太子參水煎液對(duì)脾虛型大鼠腸道菌群的影響

朱妍錦，肖慶，黃雅婷，趙立，張繼州，胡娟,,3*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州350122；2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福州350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福州350003)

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffim.的干燥塊根，具有健脾益氣、生津潤(rùn)肺之功效，臨床常用于脾虛體倦、食欲不振、氣陰不足等癥狀[1]。太子參提取物可降低小鼠脾虛發(fā)生率，提升脾虛小鼠體能，對(duì)免疫器官指數(shù)也有明顯的改善作用[2]。付楊等[3]證實(shí)了太子參須散及其多糖對(duì)于脾虛大鼠免疫功能的改善作用，發(fā)揮了太子參健脾益氣的功效。

脾主運(yùn)化水谷，統(tǒng)攝血液，運(yùn)行水濕，并主四肢、肌肉的營(yíng)養(yǎng)。脾氣虛則四肢不用，五臟不安；實(shí)則腹脹，經(jīng)溲不利[4]。脾虛，意為脾氣虛弱或脾陰不足；脾虛與腸道菌群的失衡密切相關(guān)。當(dāng)腸道微生態(tài)遭到破壞時(shí)，機(jī)體的脾胃功能受到影響；而隨著脾胃功能的失調(diào)，同樣會(huì)造成機(jī)體腸道菌群的紊亂[5]。Peng Y等[6]對(duì)脾虛患者的糞便微生物群變化進(jìn)行了研究，證實(shí)脾虛患者與健康群體相比，其腸道菌群組成發(fā)生了較大的改變。

腸道菌群通過(guò)與機(jī)體相互作用，與機(jī)體維持著互利共生的狀態(tài)；二者之間的動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，腸道菌群就會(huì)從機(jī)體生命活動(dòng)的各個(gè)途徑影響人體健康[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防或控制腸道菌群的組成變化可能成為治療腸道疾病的潛在途徑[8]。中藥可通過(guò)影響或改變腸道微生態(tài)的組成從而對(duì)腸道健康、疾病發(fā)展等產(chǎn)生影響，而高通量測(cè)序可精準(zhǔn)確定腸道微生物群的變化，進(jìn)而可探究其作用機(jī)制[9]。中藥的部分有效成分不能被機(jī)體直接吸收，但可被腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮藥效作用；其代謝產(chǎn)物又會(huì)對(duì)腸道微生物群產(chǎn)生影響[10,11]。

目前，太子參的相關(guān)研究大多聚焦于降血糖、心臟保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域，其通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群進(jìn)而治療脾虛方面還未被深入探索。本研究旨在探索太子參水煎液對(duì)于脾虛型大鼠腸道微生態(tài)的影響，為太子參治療脾虛的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Illumina NovaSeq6000基因測(cè)序系統(tǒng)；PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer型PCR（New England Biolabs公司）；酶標(biāo)儀；NanoDrop分光光度計(jì)；R-100型全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）；AE240型十萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）等。

1.2 試劑

雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片（金雙歧）（批號(hào)：202009226，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司）；三氯乙醛（批號(hào)：E1725052，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；多聚甲醛（批號(hào)：20200609，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉注射液（0.9%）（批號(hào)：C20042301A，江西科倫藥業(yè)有限公司）等。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 藥材

太子參藥材購(gòu)自福建柘榮太子參種植基地，天人太子參藥材（批號(hào)：TR-202001，柘參2號(hào)，福建天人藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 太子參水煎液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取太子參500 g，剪成0.3～0.8 cm小段，加入2.5 L超純水，室溫下浸泡0.5 h后煎藥2次，1 h/次。合并藥液蒸發(fā)濃縮至生藥量為0.5 g/mL的太子參水煎液。

2.2 脾虛模型的建立、給藥

SPF級(jí)雄性SD大鼠20只（200±20）g，隨機(jī)分為空白組（n=5）和造模組（n=15）。造模組大鼠以苦寒瀉下法建立脾虛泄瀉模型。大黃加入5倍體積的超純水，浸泡30 min后，微沸煎煮1 h，冷卻后過(guò)濾殘?jiān)?，得上層藥液；將藥液濃縮至生藥量為1 g/mL大黃水提液。大黃水提液以10 g/kg灌胃，每天2次（間隔8 h），連續(xù)7天；空白（Blank）組以等量生理鹽水灌胃。當(dāng)造模組大鼠出現(xiàn)便溏、萎靡不振、毛發(fā)黯淡無(wú)光、畏寒倦怠等現(xiàn)象后，即顯示造模成功[3]，可開(kāi)始給藥。

將造模組大鼠隨機(jī)分為模型（Model）組、陽(yáng)性對(duì)照（positive control，PC）組、PHD組，每組5只。PHD組以3 g/kg PHD灌胃給藥，PC組按0.2 g/kg灌胃給予金雙歧溶液，Model組和Blank組等體積給予生理鹽水。各組每天1次，連續(xù)7天給藥。

2.3 取材及分析測(cè)定

末次給藥24 h（自由飲水、進(jìn)食）后，稱(chēng)量大鼠體重，以0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠[12]，常規(guī)消毒后正中切開(kāi)腹腔，采集盲腸內(nèi)容物。

2.3.1 盲腸內(nèi)容物采集

在距回盲部末端10 cm以內(nèi)，取盲腸內(nèi)容物0.2 g，置于2 mL無(wú)菌離心管中密封，置于-80°C冰箱中冷凍保存。

2.3.2 腸道菌群宏基因組DNA提取、測(cè)序；生物信息學(xué)分析

2.3.2.1 對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

2.3.2.2 以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物，對(duì)16S rDNA基因中的可變區(qū)V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

515F：（CCTAYGGGRBGCASCAG），806R：（GGA CTACNNGGGTATCTAAT）。

2.3.2.3 PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，采用酶標(biāo)定量，根據(jù)產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，檢測(cè)PCR產(chǎn)物后對(duì)目的條帶回收產(chǎn)物。

2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

2.4.1 組間差異性分析

使用SPSS 26.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)分析，通過(guò)單因素ANOVA分析及獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)確定各組之間的差異性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2 OTU聚類(lèi)分析

對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序，質(zhì)控后根據(jù)97%一致性將序列進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類(lèi)，然后與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比、物種注釋?zhuān)垣@得樣品中物種的多樣性信息。

2.4.3 物種相對(duì)豐度

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣本或分組在科分類(lèi)水平上相對(duì)豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，詳見(jiàn)圖1；分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 科水平物種相對(duì)豐度 （n=5，±s）

表1 科水平物種相對(duì)豐度 （n=5，±s）

注：與Blank組比較，aP<0.01，bP<0.05；與Model組比較，cP<0.01，dP<0.05。

Peptostreptococcaceae Lactobacillaceae Prevotellaceae Lachnospiraceae Blank 23.00±9.89 16.65±4.81 1.20±0.80 17.32±5.32 Model 50.38±7.30a 19.37±6.78 0.26±0.34 6.71±1.03a PHD 16.07±10.61c 10.89±7.74 21.66±4.85ac 13.72±2.39d PC 15.37±5.38c 37.26±10.47bd 5.72±5.45d 9.22±5.22a

由表1及圖1可知，在科水平上，Peptostreptococcaceae（消化鏈球菌科）、Lactobacillaceae（乳酸桿菌科）、Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）和Lachnospiraceae（毛螺菌科）有較高的物種相對(duì)豐度。與Blank組相比，Model組中Peptostreptococcaceae的相對(duì)豐度顯著提升（P<0.01），Lachnospiraceae則顯著降低（P<0.01）；給藥后，這種趨勢(shì)顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05）。與Blank和Model相較，PHD組Prevotellaceae的相對(duì)豐度顯著提升（P<0.01）。

研究表明，Peptostreptococcaceae與腸道菌群組成失衡、腸道炎癥、結(jié)腸癌等疾病發(fā)生呈現(xiàn)正相關(guān)[13,14]，在脾虛及其相關(guān)病癥中含量有所上升[15]，對(duì)腸道微生態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響；而PHD可顯著降低其含量（P<0.01）。Lactobacillaceae是機(jī)體內(nèi)知名的益生元，與腸道健康息息相關(guān)，對(duì)于免疫系統(tǒng)也具有一定的調(diào)節(jié)作用[16]；與Model相比，PC組中金雙歧的使用可顯著提高其含量（P<0.01），而PHD對(duì)其含量沒(méi)有明顯影響。Prevotellaceae是腸道中生產(chǎn)短鏈脂肪酸的主要菌種之一[17]，PHD可顯著提升其相對(duì)豐度（P<0.01）。Lachnospiraceae是機(jī)體腸道中主要的丁酸生產(chǎn)菌種，而丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞的首選能源，對(duì)維持腸屏障的正常功能非常重要[18,19]；與模型組比較，PHD可顯著提升Lachnospiraceae的相對(duì)豐度（P<0.05）。

2.4.4 MetaStat分析

使用MetaStat分析，得到Blank組、Model組以及PHD組間的屬水平菌種差異，并繪制箱型圖，詳見(jiàn)圖2。

由圖2A可知，與Blank組相比，Model組在屬水平上Rombutsia的菌種豐度具有顯著提高（P<0.05），Lachnospiraceae_NK4A136_group、Fournierella、Christensenellaceae_R-7_group的含量顯著降低（P<0.05）。由圖2B可知，與Blank組相比，PHD組中Alloprevotella（擬普雷沃菌屬）的豐度顯著提升（P<0.05）。由圖2C可知，與Model組比較，PHD組中Rombutsia的含量顯著降低（P<0.05），而Prevotella（普雷沃菌屬）、Agathobacter、Fusicatenibacter的豐度顯著提高（P<0.05）。

Rombutsia屬于Peptostreptococcaceae，Model組的Rombutsia豐度顯著高于Blank組與PHD組（P<0.05），這可能是Model組Peptostreptococcaceae相對(duì)豐度顯著降低的原因（P<0.05），而Rombutsia與腸道中的蛋白質(zhì)代謝有關(guān)[20]。

Lachnospiraceae_NK4A136_group、Agathobacter和Fusicatenibacter屬于Lachnospiraceae。其中Lachnospiraceae_NK4A136_group與腸道內(nèi)碳水化合物的消化分解以及膽汁酸代謝有關(guān)，與肥胖癥等多種疾病呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[21–23]；與Blank組比較，Model組Lachnospiraceae_NK4A136_group含量的顯著降低（P<0.05）可能是Lachnospiraceae相對(duì)豐度顯著降低的原因（P<0.05）。Agathobacter與結(jié)直腸癌等疾病呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[24]；Fusicatenibacter可阻止某些細(xì)菌感染進(jìn)程[25]；與Model組相比，PHD組Lachnospiraceae相對(duì)豐度的顯著提升（P<0.05）可能是由于Agathobacter和Fusicatenibacter的豐度顯著提高（P<0.05）。

Alloprevotella和Prevotella屬于Prevotellaceae，Alloprevotella可在腸道中代謝、產(chǎn)生丁酸，影響腸道健康，Prevotella則是人體腸道的典型菌種[26–28]；與Blank組、Model組相比，Alloprevotella和Prevotella在PHD組中菌群豐度的顯著提升（P<0.05），可能是Prevotellaceae相對(duì)豐度顯著提高的主要原因（P<0.05）。

Fournierella屬于Ruminococcaceae（瘤胃球菌科），Ruminococcaceae是短鏈脂肪酸的主要生產(chǎn)菌科，參與腸道中某些多糖、纖維的降解及膽汁酸代謝，是人體腸道內(nèi)知名的有益菌[29,30]。Christensenellaceae_R-7_group屬于Christensenellaceae（克里斯滕森菌科），Christensenellaceae與炎性腸病、腸易激綜合征呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，同時(shí)參與機(jī)體代謝、遺傳變異等健康過(guò)程[31]，Christensenellaceae_R-7_group則會(huì)對(duì)腸道內(nèi)葡萄糖代謝產(chǎn)生影響[32]。

3 討論

腸道菌群與人體健康息息相關(guān)，中醫(yī)傳統(tǒng)的脾虛病癥和腸道菌群組成之間存在相互作用。腸道微生物對(duì)于脾虛影響的相關(guān)研究正被不斷展開(kāi)[33]，而有關(guān)于健脾、補(bǔ)氣類(lèi)中藥及其有效成分通過(guò)改變腸道微生態(tài)環(huán)境進(jìn)而治療脾虛的研究亦有相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展[34]。太子參是經(jīng)典的健脾益氣類(lèi)中藥，本課題研究太子參水煎液對(duì)于脾虛型大鼠腸道菌群的影響，旨在探索其作用機(jī)制，為太子參治療脾虛的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PHD對(duì)于脾虛型大鼠腸道菌群組成具有一定的影響。在科水平上，PHD可顯著提高Prevotellaceae和Lachnospiraceae等有益菌的相對(duì)豐度（P<0.05），顯著降低Peptostreptococcaceae等有害菌的相對(duì)豐度（P<0.01）。在屬水平上，太子參水煎液組中Prevotella、Agathobacter、Fusicatenibacter等菌的豐度有顯著提高（P<0.05），Rombutsia等菌的豐度顯著降低（P<0.05）。

本實(shí)驗(yàn)明確太子參水煎液可通過(guò)影響腸道菌群組成，進(jìn)而對(duì)脾虛型大鼠發(fā)揮一定的治療效果。