寶雞麟游縣柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)研究*

張笑顏 薛璇璣 張新新 楊美娟 李鐵軍 郭增軍**

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，陜西 西安 710061；2.麟游縣衛(wèi)生健康局，陜西 寶雞 721599)

柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleuramscorzonerifoliumWilld.的干燥根，分別習(xí)稱為“北柴胡”和“南柴胡”，性辛、苦、微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有疏散退熱、疏肝解郁的功效[1]。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，加之藥農(nóng)亂采亂挖等現(xiàn)象，柴胡野生資源數(shù)量急劇減少，加之柴胡因其臨床用量大導(dǎo)致其市售價(jià)格連年上漲，目前市場(chǎng)上流通的藥材主要以栽培品北柴胡為主[2-3]。陜西省自古以來就是柴胡的道地產(chǎn)區(qū)[4-5]，寶雞市由于特殊的地理環(huán)境和人文條件，成為陜西省發(fā)展柴胡種植產(chǎn)業(yè)的主要區(qū)域之一[6-7]，2018年陜西省中藥協(xié)會(huì)選定的“十大秦藥”中，寶雞柴胡更是位列“十大秦藥”第二名[8]，目前主要涉及陳倉(cāng)區(qū)、麟游縣等地[9-10]，但不同產(chǎn)區(qū)地形條件差異明顯，種質(zhì)來源不一，致使柴胡質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響中醫(yī)臨床用藥及“寶雞柴胡”品牌推廣[11-12]。因此，明確當(dāng)前柴胡藥材質(zhì)量，選用優(yōu)質(zhì)種源開展規(guī)范化種植是發(fā)展寶雞柴胡及“秦藥”亟待解決的現(xiàn)實(shí)問題。

2020年版《中國(guó)藥典》柴胡含量測(cè)定項(xiàng)下要求柴胡皂苷a、d的總含量不低于0.30%，此外，黃酮類成分是柴胡屬植物中共有的有效部位[13-14]，因此本文通過測(cè)定柴胡皂苷和總黃酮的含量以評(píng)價(jià)麟游縣柴胡質(zhì)量，以期為麟游縣柴胡種植業(yè)及“秦藥”發(fā)展提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2030C 3D高效液相色譜儀，配有四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及DAD檢測(cè)器(島津Shimadzu)；METTLER AE240分析天平(梅特勒);KQ3200B超聲波清洗器(昆山);UV-1800紫外分光光度計(jì)(島津Shimadzu);EYELAN N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)。

1.2試劑 柴胡皂苷a、d對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110777201711);蘆丁購(gòu)自寶雞辰光生物科技有限公司(批號(hào):HQ105561198，純度>98%);色譜乙腈(瑞士，Oceanpak);娃哈哈純凈水;其余試劑為分析純,均購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.3藥材 7批柴胡藥材均于2019年4月收集于寶雞麟游縣，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院郭增軍教授鑒定為北柴胡BupleurumchinenseL.，具體信息見表1。

表1 樣品來源信息表

2 方法

2.1各樣品中柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 取柴胡皂苷a、d對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.5 mg、柴胡皂苷d 0.5 mg的溶液，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備 取本品粉末(過60目篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，用甲醇30 mL分3次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.1.3色譜條件 Sepax C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，洗脫程序0～27 min，15%～48%A；27～37 min，48%～57%A；37～40 min，57%～71%A；40～55 min，71%～80%A；55～60 min，80%～90%A；60～65 min，90%～90%A；65～70 min，90%～15%A；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

2.1.4方法學(xué)考察 對(duì)上述方法進(jìn)行線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率考察。以峰面積/106為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(mg·mL-1，X)計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明在0.025～0.1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，柴胡皂苷a、d線性關(guān)系良好；配制0.25 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)6 d各進(jìn)樣1次，考察儀器精密度；稱取7號(hào)樣品約0.5g，精密稱定，按供試品方法處理樣品，分別于0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣分析，考察樣品穩(wěn)定性；稱取7號(hào)樣品約0.5 g共6份，精密稱定，按供試品方法處理樣品，計(jì)算柴胡皂苷a、d含量，考察操作重復(fù)性；稱取7號(hào)樣品約0.5 g共6份，精密稱定，分別加入0.5 mL的0.25 mg·mL-1混合對(duì)照品溶液，考察方法回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，由表可見，該方法精密度、重復(fù)性、回收率高，樣品室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好，可用于樣品的測(cè)定。

2.2各樣品中柴胡總黃酮的含量測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁0.5 mg的溶液，搖勻，即得。

表2 柴胡皂苷a、d含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法學(xué)結(jié)果(n=6)

2.2.2供試品溶液的制備 取樣品約0.2 g，精密稱定，加入25 mL甲醇超聲提取15 min后，濾過，回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙庵?0 mL量瓶中，定容，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3顯色方法 精密量取供試品溶液5 mL置于25 mL量瓶中，用水補(bǔ)足至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液l mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以隨行試劑作空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[15-17]。

2.2.4方法學(xué)考察 對(duì)上述方法進(jìn)行線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率考察，結(jié)果見表3。將蘆丁對(duì)照品溶液依次稀釋成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別精密量取5 mL置于25 mL量瓶中，自“2.2.3 顯色方法 用水補(bǔ)足至6 mL”后操作，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(mg·mL-1,X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明總黃酮測(cè)定濃度在0.02～0.5 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；取0.1 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液，按上述顯色方法連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；稱取7號(hào)樣品約0.2 g，精密稱定，按上述供試品制備及顯色方法處理樣品，分別于0，1，2，3，4 h測(cè)定吸光度，考察樣品穩(wěn)定性；稱取7號(hào)樣品約0.2 g共6份，精密稱定，按上述供試品制備及顯色方法處理樣品，考察方法重復(fù)性；稱取7號(hào)樣品約0.5 g共6份，精密稱定，分別加入0.5 mL的0.1 mg·mL-1蘆丁對(duì)照品溶液，計(jì)算加樣回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，由表可見，該方法精密度、重復(fù)性、回收率高，樣品室溫放置4h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可用于柴胡樣品總黃酮的含量測(cè)定。

表3 總黃酮測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法學(xué)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)果

3.1各樣品柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定 稱取充分干燥的7批柴胡根部粉末約0.5 g，平行三份，精密稱定后，按“2.1.2”方法制備供試品溶液后進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算柴胡皂苷a、d的含量。結(jié)果見表4及圖1。

圖1 各柴胡樣品中柴胡皂苷含量差異(虛線為藥典限量0.3%)

表4 各柴胡樣品中柴胡皂苷含量結(jié)果

上述結(jié)果顯示：麟游縣域內(nèi)采購(gòu)的7批柴胡樣品均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中樣品1～3號(hào)均為野生樣品，其柴胡皂苷含量分別高于藥典3.2、2.2、3.0倍，提示我們麟游縣的生態(tài)環(huán)境可能適宜于柴胡藥材有效成分的累積。樣品4～7號(hào)為不同種源、不同生長(zhǎng)年限的栽培柴胡樣品，其含量存在明顯差異，其中7號(hào)樣品(河北安國(guó)種源)柴胡皂苷含量達(dá)藥典限量的7.9倍。

3.2柴胡總黃酮的含量測(cè)定 稱取充分干燥的7批柴胡粉末約0.2 g，平行三份，精密稱定后，按“2.2.2”方法制備供試品溶液后顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算柴胡總黃酮的含量。結(jié)果見表5及圖2。

表5 各柴胡樣品中柴胡總黃酮含量結(jié)果

圖2 各柴胡樣品中柴胡總黃酮含量差異

上述結(jié)果表明：1～3號(hào)柴胡均為野生樣品，其總黃酮含量接近，5號(hào)(桑樹塬基地)黃酮含量最高，7號(hào)(河北安國(guó)種源)含量次之。

4 討論

柴胡為我國(guó)大宗中藥品種，但由于其悠久的種植歷史悠久，各各市區(qū)生態(tài)條件存在明顯差異、加之各產(chǎn)區(qū)種質(zhì)來源復(fù)雜，導(dǎo)致藥材質(zhì)量不均的問題日趨嚴(yán)重[18-20]，本文從柴胡皂苷和總黃酮含量?jī)煞矫婢C合評(píng)價(jià)寶雞麟游縣野生及栽培柴胡質(zhì)量，為進(jìn)一步優(yōu)選種源，確保柴胡質(zhì)量的一致性及可控性，充分發(fā)揮當(dāng)?shù)厣硟?yōu)勢(shì)，進(jìn)一步保障藥材質(zhì)量和形成柴胡品牌提供數(shù)據(jù)參考。