正交法優(yōu)化大孔樹脂提純菝葜中綠原酸的工藝

戴富才，趙娣，李紅美，蘇月月，景學敏，張曉軒

廊坊師范學院化學與材料科學學院（廊坊 065000）

菝葜（Smilax china）為百合科植物菝葜屬，又名金剛藤、金剛刺，主要分布于我國長江以南及東南亞等地。菝葜根、莖、葉 均可入藥，菝葜中主要包含氨基酸、茋類、皂苷類、黃酮類、酚酸類等各種化學成分，具有祛風利濕、消腫解毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、預防動脈粥樣硬化等作用[1]。

綠原酸（chlorogenicacid）是由咖啡酸（caffeicacid）與奎尼酸（quinicacid）組成的縮酚酸，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降糖、增加白細胞數(shù)量等多種生理作用[2]。綠原酸主要從金銀花[3]、杜仲[4]等天然產(chǎn)物中提取。市場上綠原酸供應不足，導致綠原酸價格居高不下。所以擴大綠原酸的提取來源并研究其提純工藝十分有必要。試驗選取菝葜為綠原酸提取的植物來源。

綠原酸的提純方法主要有水提醇沉、石灰乳沉淀法、膜分離法、重結晶法、溶劑萃取法、離子交換樹脂法、凝膠色譜法、高效液相色譜法、高速逆流色譜法和大孔樹脂分離等方法[5]。其中，大孔樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶劑，便于工業(yè)化生產(chǎn)，在綠原酸的分離與富集中被廣泛應用。沈奇等[6]選用NKA-9大孔樹脂來分離蒲公英中的綠原酸，提純后，綠原酸提取物純度可達25.3%。大孔樹脂對菝葜中綠原酸的提純工藝尚未見報道，因此，如何以菝葜為原料，研究大孔樹脂提純綠原酸的工藝，成為我們研究的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菝葜（產(chǎn)自河北省保定市）；綠原酸標準品（純度＞98%，武漢天植生物技術有限公司）；大孔樹脂NKA-Ⅱ、NKA-9、HPD400、AB-8、X-5、D101等（分析純，天津市精細化工研究所）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市渤化化學試劑有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260型高效液相色譜（配自動進樣器和紫外檢測器，美國安捷倫科技有限公司）；XFB-400高速中藥粉碎機（湖南吉首市中湘制藥機械廠）；KQ-250B超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1640A電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；酒精計（河北省武強紅星玻璃儀表廠）；TD4臺式低速離心機（湖南儀器儀表總廠離心機廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菝葜中綠原酸的HPLC檢測方法

1.3.1.1 HPLC法檢測條件[7]

色譜柱為SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相，色譜純乙腈-0.1%磷酸水溶液（體積比隨時間變化見表1）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長327 nm；進樣量10 μL。

表1 乙腈與磷酸水溶液的體積比隨時間變化表

1.3.1.2 綠原酸標準品的配制及工作曲線的繪制

精確稱取5.0 mg綠原酸的標準品，用50%的色譜純甲醇溶解并定容于25 mL的棕色容量瓶中，即得到質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的綠原酸標準品溶液。于4 ℃左右保存，待用[8]。

將標準品溶液稀釋，稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL，用高效液相色譜法測定峰面積。以綠原酸的質(zhì)量濃度為橫向坐標，液相色譜的峰面積為縱向坐標，繪制綠原酸的工作曲線，并計算其線性方程[9]。

取所需待測的樣品溶液，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，用于高效液相色譜分析[10]。

1.3.2 菝葜綠原酸吸附率、解吸綠、得率、含量和產(chǎn)率

按式（1）～（5）計算[4，11]。

式中：E為綠原酸吸附率，%；C0為起始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為平衡質(zhì)量濃度，mg/mL；D為綠原酸解吸率，%；Cd為解吸液中綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd為解吸液體積，mL；V0為吸附液體積，mL；R為綠原酸得率，%；P為綠原酸含量，%；m為解吸液干物質(zhì)總質(zhì)量，g；Y為綠原酸產(chǎn)率，%；M為菝葜干粉質(zhì)量，g。

1.3.3 樹脂預處理及再生

用95%乙醇浸泡6種待處理的大孔樹脂24 h，使其充分膨脹后，用去離子水洗去乙醇；用5%鹽酸溶液浸泡12 h，用去離子水洗至中性（pH試紙檢測），用5%氫氧化鈉溶液浸透12 h，用去離子水沖洗至中性，待用[11]。

1.3.4 拔葜綠原酸粗提液的制備

用粉碎機將菝葜粉碎，過0.250 mm（60目）篩，待用。

稱取20 g的菝葜粉末，按照料液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇溶液搖勻，使粉末浸濕后，按照超聲時間35 min、超聲功率135 W進行超聲提取，過濾，提取2次，合并濾液[12]，減壓蒸餾濃縮至無醇味（酒精計測量乙醇體積分數(shù)約2%），離心分離（3 000 r/min，離心5 min），合并上清液即為菝葜粗提液。

1.3.5 大孔樹脂D101吸附除雜

將菝葜粗提液和D101大孔樹脂（比例為50∶1 mL/g）放在25 ℃、110 r/min的搖床上振蕩24 h。將振蕩后的溶液進行過濾，濾液即為大孔樹脂D101除雜后溶液，測定其中綠原酸含量，備用。

1.3.6 大孔樹脂提純菝葜中綠原酸的單因素試驗

以大孔樹脂D101除雜后溶液為原料液，以樹脂提純后樣品中綠原酸的含量和得率為指標，研究樹脂種類、吸附液pH、吸附液濃度、解吸液乙醇體積分數(shù)等因素對大孔樹脂提純菝葜綠原酸的影響[4]。

1.3.6.1 樹脂種類對提純工藝的影響

將原料液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2，在5個250 mL的錐形瓶中各放入150 mL，放入已經(jīng)處理好的NKA-II、NKA-9、HPD400、AB-8、X-5樹脂各3 g，放在25 ℃、110 r/min的搖床上振蕩24 h。取出后抽濾，測定吸附液中未吸附的綠原酸的含量。將抽濾后的樹脂用適量的pH 3的酸水沖洗、抽濾干后，放入原錐形瓶中，分別加入50 mL 40%的乙醇，放在25 ℃、110 r/min的搖床上振蕩解吸24 h。用HPLC法測定過濾后解吸液中綠原酸含量；將解吸出的溶液蒸干，測定干物質(zhì)質(zhì)量，計算不同樹脂種類下綠原酸的含量和得率。

1.3.6.2 吸附液pH對提純工藝的影響

將吸附液pH調(diào)至1，2，3，4和5后，其他條件不變，參照1.6.3.1進行吸附解吸試驗，研究吸附液pH對提純工藝的影響。

1.3.6.3 吸附液質(zhì)量濃度對提純工藝的影響

將吸附液質(zhì)量濃度調(diào)至0.04，0.08，0.12，0.16和0.20 mg/mL，其他條件不變，參照1.6.3.1進行吸附解吸試驗，研究吸附液質(zhì)量濃度對提純工藝的影響。

1.3.6.4 解吸液乙醇體積分數(shù)對提純工藝的影響

將解吸液乙醇體積分數(shù)調(diào)至20%，30%，40%，50%和60%，其他條件不變，參照1.6.3.1進行吸附解吸試驗，研究解吸液乙醇體積分數(shù)對提純工藝的影響。

1.3.7 大孔樹脂提純菝葜中綠原酸的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以綠原酸含量和得率為指標，選擇A（樹脂種類）、B（吸附液pH）、C（解吸液乙醇體積分數(shù)）、D（吸附液質(zhì)量濃度）4個因素，設計L9(34)正交試驗。

1.3.8 大孔樹脂動態(tài)提純菝葜中的綠原酸

1.3.8.1 上柱樣體積和流速的測定

將最優(yōu)樹脂放入3支1.2 cm×40 cm的玻璃層析柱中，高度15 cm左右，將經(jīng)過D101樹脂除雜后的原料液按照正交試驗確定的以綠原酸含量為指標確定的最佳靜態(tài)吸附工藝條件進行動態(tài)吸附試驗。分別控制流速1，2和3 BV/h，每柱體積收集1次，并進行液相色譜檢測，在流出液綠原酸的質(zhì)量濃度為上樣液綠原酸質(zhì)量濃度的l/10時即達到泄漏點[13]，認為綠原酸透過，停止上樣。確定上樣液體積及流速。

1.3.8.2 解吸液體積對解吸效果的影響

將吸附綠原酸達到泄漏點的樹脂，按照正交試驗得出的最優(yōu)解吸條件進行解吸。前2 BV解吸液收集在一起，后每隔1 BV收集1次，分別取樣，進行HPLC檢測，測定解吸液中綠原酸含量，確定最優(yōu)解吸液體積。

1.3.8.3 綠原酸含量和產(chǎn)率的計算

取120.000 0 g菝葜干粉，按照最優(yōu)工藝提純，按照式1.3.2中公式（4）計算純化過程的綠原酸含量變化，按照公式（5）計算純化后綠原酸產(chǎn)率。

1.3.9 大孔樹脂NKA-Ⅱ的重復使用次數(shù)試驗

將工藝用量較大的NKA-Ⅱ樹脂使用后按照1.3.3再生后重復使用。

將再生好的NKA-Ⅱ樹脂放入1.2 cm×40 cm的玻璃層析柱中，高度15 cm，將經(jīng)過D101樹脂除雜后的原料液按照最優(yōu)工藝進行吸附試驗。當吸附率降至新樹脂對綠原酸吸附率的70%[14]時，停止再生，記錄樹脂的重復使用次數(shù)。

2 結果與分析

2.1 綠原酸標準曲線

標準曲線的回歸方程為y=31 508.29x+285.49，R2=0.995。其中：y為綠原酸色譜峰面積，mAU；x為綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL。結果表明綠原酸在0.01～ 0.06 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 樹脂種類對綠原酸提純效果的影響

由表2可知：極性樹脂純化效果好于弱極性樹脂和非極性樹脂，這是因為綠原酸是有一定極性的有機酸，更容易被極性樹脂吸附[15]。NKA-II樹脂純化后得率和含量最高，因此選擇NKA-II樹脂作為最優(yōu)樹脂，進行后續(xù)單因素試驗，NKA-II、NKA-9和HPD400樹脂為正交試驗中樹脂種類的3個水平。

表2 樹脂種類對綠原酸提純效果的影響

2.2.2 吸附液pH對綠原酸提純效果的影響

由圖1可知：pH 2時，純化后綠原酸含量最高，這是因為綠原酸是有機酸，酸性環(huán)境下綠原酸以分子形式存在，有利于樹脂對綠原酸分子的吸附[6]。弱酸性環(huán)境也有利于黃酮類等其他物質(zhì)的吸附[13]，因此pH 4時，綠原酸得率雖然最高，但是綠原酸含量卻不是最高。考慮到試驗的主要目的是提高產(chǎn)品中綠原酸的含量，因此，以純化后綠原酸含量最高的pH 2作為單因素試驗的最優(yōu)pH，選擇pH 1，2和3作為正交試驗中吸附液pH的3個水平。

圖1 吸附液pH對綠原酸提純效果的影響

2.2.3 吸附液質(zhì)量濃度對綠原酸提純效果的影響

由圖2可知：吸附液質(zhì)量濃度越小，綠原酸得率越大，隨著吸附液質(zhì)量濃度上升，綠原酸含量先增大后減小?？紤]到試驗的主要目的是提高產(chǎn)品中綠原酸的含量，因此，選擇0.08 mg/mL為吸附菝葜綠原酸的吸附液質(zhì)量濃度，開展后續(xù)單因素試驗；選擇吸附液質(zhì)量濃度0.04，0.08和0.12 mg/mL為正交試驗中吸附液質(zhì)量濃度的3個水平。

圖2 吸附液質(zhì)量濃度對綠原酸提純效果的影響

2.2.4 解吸液乙醇體積分數(shù)對綠原酸提純效果的影響

由圖3可知，隨著解吸液乙醇體積分數(shù)的增大，綠原酸得率逐漸增大，而綠原酸含量先增大后減小。因為與水相比，綠原酸在乙醇中的溶解度更大。由相似相容原理，較大的乙醇體積分數(shù)對綠原酸的解吸更有利；但較大的乙醇體積分數(shù)也有利于黃酮類物質(zhì)等其他醇溶性成分的解吸[11，13]?？紤]到試驗的主要目的是提高產(chǎn)品中綠原酸的含量，因此，選擇50%作為最優(yōu)解吸液乙醇體積分數(shù)，選擇40%，50%和60%為正交試驗中解吸液乙醇體積分數(shù)的3個水平。

圖3 解吸液乙醇體積分數(shù)對綠原酸提純效果的影響

2.3 正交試驗

由表3可知，以菝葜綠原酸含量為指標，各因素影響的大小依次為樹脂種類＞吸附液pH＞解吸液乙醇體積分數(shù)＞吸附液質(zhì)量濃度。其中，樹脂種類顯著影響。最佳組合為A1B1C1D2，即大孔樹脂采用NKA-Ⅱ、吸附液pH 1、解吸液乙醇體積分數(shù)40%、吸附液質(zhì)量濃度0.08 mg/mL。

由表3可知：以菝葜綠原酸得率為指標，各因素影響的大小依次為解吸液乙醇體積分數(shù)＞樹脂種類＞吸附液質(zhì)量濃度＞吸附液pH；其中，解吸液乙醇濃度顯著影響；最佳組合為A1B3C3D3，即大孔樹脂采用NKA-Ⅱ、pH 3、解吸液乙醇體積分數(shù)60%、吸附液濃度0.04 mg/mL。

表3 正交試驗因素水平及結果

為驗證正交試驗中獲得最優(yōu)的組穩(wěn)定性和準確性，在最優(yōu)組合下，各進行3次平行試驗。即以綠原酸含量為指標，含量的平均值為6.4%，得率平均值為52.3%。以綠原酸得率為指標，含量的平均值為5.0%，得率的平均值為63.9%。

2.4 動態(tài)試驗分離純化菝葜中的綠原酸

2.4.1 泄漏點的測定及流速對樹脂吸附的影響

大孔樹脂提純天然產(chǎn)物時，一般較低的流速有利于吸附[13]，然而流速過低，完成吸附的時間就要延長，降低提純效率。圖4為不同流動速度下，流出液中綠原酸質(zhì)量濃度的變化圖。流速1 BV/h時，10 BV達到綠原酸泄漏點，流速2 BV/h時，8 BV達泄漏點，雖然完成1周期吸附，少處理2 BV樣品液，但吸附速度提高1倍。因此，綜合考慮處理量和吸附速度，2 BV/h為最佳上樣液流速，在此流速下，上樣液體積為8 BV。

圖4 上樣液流速對樹脂吸附的影響

2.4.2 解吸液體積對解吸效果的影響

由圖5可知，解吸液體積為前2 BV時，流出液主要為雜質(zhì)，綠原酸含量很小，不收集。當解吸液體積達到5 BV時，大部分綠原酸被解吸下來，繼續(xù)增加解吸體積可能將樹脂吸附的部分雜質(zhì)解吸出來，影響純化效果。因此，解吸液體積控制在5 BV，收集第3～第5 BV解吸液。

圖5 解吸液體積對解吸效果的影響

2.5 菝葜綠原酸含量和產(chǎn)率

2.5.1 菝葜綠原酸含量（見表4）

表4 純化過程中綠原酸含量的變化

2.5.2 菝葜綠原酸的產(chǎn)率（見表5）

表5 菝葜綠原酸的產(chǎn)率

2.6 樹脂NKA-Ⅱ的重復使用次數(shù)

由表6可知，由于一些強吸附性雜質(zhì)的影響，樹脂第8次再生后，對綠原酸的吸附率將至59.3%，低于61.3%（即新樹脂吸附率的70%），認為不能繼續(xù)使用。因此，經(jīng)過再生，NKA-Ⅱ樹脂共可以使用8次，8次后需要更換新樹脂。

表6 樹脂再生后使用次數(shù)對綠原酸吸附率的影響

3 結論

以菝葜為原料，利用超聲波粗提，經(jīng)大孔樹脂D101除雜，NKA-Ⅱ樹脂提純的工藝，可有效提純菝葜中綠原酸。提純后，菝葜綠原酸含量顯著提高。樹脂NKA-Ⅱ再生處理后，共計可使用8次。試驗可為菝葜中綠原酸的工業(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。