海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏期間品質(zhì)變化及與微生物多樣性間相關(guān)性分析

羅云龍，王 洋，2，，劉 義，張光晨，白東清，2，施 杭，蔣思思，馬儷珍

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；3.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院食品工程系，貴州 貴陽 551400）

革胡子鯰（）生長速度快，對環(huán)境脅迫的耐受力強，是我國經(jīng)濟淡水養(yǎng)殖魚類之一。革胡子鯰肉質(zhì)細(xì)膩，適合制作烤魚、燜鍋，受到餐飲業(yè)的歡迎和消費者的喜愛，其魚肉也有開發(fā)為魚糜的潛力。然而由于革胡子鯰魚肉易腐敗，目前還沒有冷鮮或冰鮮魚肉產(chǎn)品上市。王苗苗發(fā)現(xiàn)，真空包裝及氣調(diào)包裝冰溫冷藏革胡子鯰魚肉的優(yōu)勢腐敗菌為乳酸菌、假單胞菌和氣單胞菌，而托盤包裝冷藏革胡子鯰魚肉的優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌和產(chǎn)HS菌。可見不同包裝方式的革胡子鯰魚肉主要腐敗菌有所差異，而腐敗菌生長情況是預(yù)測產(chǎn)品貨架期及確定保鮮方案的主要依據(jù)。因此，探究革胡子鯰魚肉優(yōu)勢腐敗菌的組成和變化，對于針對性防控并延長貨架期具有重要意義。

可食性材料覆膜能夠有效抑制食品的氧化變質(zhì)，還可裝載抑菌成分，延緩微生物繁殖，從而延長魚肉貨架期。海藻酸鈉涂膜還能改變水產(chǎn)品的微生物組成，對假單胞菌、產(chǎn)HS菌、腸桿菌與乳酸菌均有抑制作用。預(yù)實驗初步證實了革胡子鯰魚肉覆膜保鮮及裝載抑菌物質(zhì)的可行性。本研究旨在探討海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉微生物多樣性變化及其與品質(zhì)的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究可食性膜裝載抑菌物質(zhì)、延長革胡子鯰魚貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活革胡子鯰 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場。

食品級海藻酸鈉、氯化鈉、甘油、硼酸（均為分析純） 天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；平板計數(shù)培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸（均為分析純） 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氧化鎂（分析純） 天津津科精細(xì)化工研究所；2-硫代巴比妥酸（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；丹磺酰氯（分析純） 天津科潤達(dá)生物工程研究有限公司；生物胺（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺及亞精胺）標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國Bioreags公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；ST 16R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；SCIENTZ-192高速勻漿研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；SKD-800自動凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；DK-600S恒溫水浴鍋 上海精密實驗設(shè)備有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵 上海力辰儀器科技有限公司；GS0610超聲波清洗機 深圳博冠科技有限公司；SX-500多功能高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；1260高效液相色譜儀（配備紫外吸收檢測器） 美國Agilent公司；CR-400比色儀 日本Konica Minolta公司；FE20/EL20數(shù)字式pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；UV-2600分光光度計日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 可食用膜的制備

根據(jù)Rhim的方法，制備海藻酸鈉膜。以1 g/100 mL海藻酸鈉水溶液、體積分?jǐn)?shù)0.5%甘油和0.2 g/100 mL氯化鈣作為食用膜的基本溶液，在室溫（20 ℃）下攪拌30 min，將溶液倒在玻璃板上，室溫下干燥48 h，得到厚度40～60 μm的膜，置于相對濕度53%、溫度20 ℃的干燥器中待用。

1.3.2 魚片處理

鮮活革胡子鯰魚低溫休眠后敲頭至死，自來水流水洗去血水，去除內(nèi)臟和魚皮。取兩側(cè)魚肉，去掉皮下脂肪，切成30 g左右的小塊，將魚肉裹上海藻酸鈉膜，之后用聚乙烯薄膜袋包裝（20 ℃條件下氧氣滲透系數(shù)約為15 181.9 mL/（m·d·101 Pa），透濕率約為4.531 8 g/（m·d）），在4 ℃條件下冷藏10 d。于冷藏0、2、4、6、8、10 d隨機抽取樣品進(jìn)行感官評價、理化性質(zhì)測定和微生物多樣性分析。

1.3.3 感官分析

從魚肉中隨機取樣，評價其氣味、色澤、汁液流失和質(zhì)地，分?jǐn)?shù)均為1～5 分，5 分代表質(zhì)量最好，分?jǐn)?shù)越低代表質(zhì)量越差。上述4 種指標(biāo)分?jǐn)?shù)之和為可接受度評分，總分小于10 分時不可接受。7 位評定人員參與感官評估。

魚肉的亮度值（）、紅度值（）、黃度值（）和色差值（Δ）用比色儀測定。

1.3.4 理化性質(zhì)測定

1.3.4.1 持水力參照馮慧等的方法。取約2.0 g（，g）搗碎的鯰魚肉放入離心管，3 000×、4 ℃離心15 min，倒掉水分，稱質(zhì)量（，g），按下式計算持水力。

1.3.4.2 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》方法，用數(shù)字式pH計測定鯰魚肉pH值。

1.3.4.3 總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》方法。

1.3.4.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值

參照Witte等的方法。

1.3.4.5 生物胺含量

依據(jù)陳援援等的方法進(jìn)行樣品制備和提取，采用高效液相色譜法測定。

1.3.5 微生物數(shù)量及多樣性分析

委托北京奧維森基因科技有限公司，用絕對定量法測定冷藏0、4、8 d魚肉中目的基因拷貝數(shù)，使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)進(jìn)行16S rRNA V～V區(qū)序列分析。通用擴增引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGC-3’）和806R（5’-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

感官分析及理化指標(biāo)測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，USA）進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s檢驗進(jìn)行方差分析（=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中感官品質(zhì)變化

圖 1 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中感官評分變化Fig. 1 Changes in sensory evaluation scores of sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由圖1可知，海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中色澤和汁液流失評分快速下降，質(zhì)地和氣味的劣變略有延遲，在冷藏4 d后開始快速劣化。總體可接受度評分逐漸下降，6 d時降低到12 分，8 d降低到8 分，低于感官貨架期標(biāo)準(zhǔn)（10 分）。

表 1 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中的色差值變化Table 1 Changes in color parameters of sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由表1可知，冷藏0～4 d，海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉各項顏色指標(biāo)均沒有顯著變化。冷藏6 d時下降，、Δ顯著升高（＜0.05）。冷藏6～10 d，魚肉的持續(xù)上升，說明魚肉色澤變黃。

2.2 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中理化指標(biāo)變化

圖 2 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中理化指標(biāo)變化Fig. 2 Changes in physicochemical indexes of sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由圖2A可知，革胡子鯰魚肉冷藏4～6 d，持水力下降顯著（從80.28%降至77.38%，＜0.05），冷藏0～4 d和6～10 d沒有顯著變化。由圖2B可知，革胡子鯰魚肉初始pH值為6.62，冷藏0～8 d持續(xù)降低，4～6 d下降幅度最大，8 d降至最低（5.66），10 d與8 d相比明顯升高。由圖2C可知，革胡子鯰魚肉的TVB-N含量在冷藏初期維持在較低水平，冷藏6 d開始快速增加，冷藏8～10 d迅速增加，最終達(dá)到30.69 mg/100 g，超過國標(biāo)限量（25 mg/100 g）。由圖2D可知，革胡子鯰魚肉TBARs值在冷藏期間緩慢升高，從0 d的0.30 mg/kg上升至10 d的0.84 mg/kg。

表 2 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中生物胺含量變化Table 2 Changes in contents of biogenic amines in sodium alginatecoated catfish flesh during cold storage

由表2可知，鯰魚肉中生物胺總含量在冷藏期間逐漸增加，由8.51 mg/kg上升至141.04 mg/kg。8 種生物胺中，尸胺、腐胺、酪胺和組胺在冷藏末期含量最高，前3 種生物胺冷藏10 d含量分別達(dá)到35.02、69.84、15.79 mg/kg。組胺含量在冷藏0～4 d均低于檢測限（0.005 mg/kg），冷藏6 d時開始增加，10 d時升至14.59 mg/kg。魚肉中色胺、亞精胺含量有一定波動，但含量一直較低（不超過4 mg/kg），苯乙胺、精胺含量也較低，且在冷藏期間沒有顯著變化。

2.3 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中微生物多樣性變化

由圖3A可知，革胡子鯰魚肉樣初始微生物總數(shù)量為6.75（lg（CFU/g）），冷藏4 d升至8.37（lg（CFU/g）），8 d為8.08（lg（CFU/g））。由圖3B可知，冷藏0、4、8 d共有OTU有76 個，冷藏初始特有OTU數(shù)量最多，為438 個，冷藏4、8 d特有OTU分別為26、37 個。由圖3C可知，革胡子鯰魚肉微生物多樣性在冷藏4、8 d顯著低于初始水平。由圖3D可知，主成分分析顯示，革胡子鯰魚肉冷藏0、4、8 d時的微生物群落組成不同，冷藏0 d樣本微生物組成與冷藏4、8 d樣本聚類在不同區(qū)域。

由圖3E可知，革胡子鯰魚肉冷藏0、4、8 d時優(yōu)勢菌組成不同。冷藏0 d優(yōu)勢菌為莫拉氏菌科（Moraxellaceae，50.04%）、鏈球菌科（Streptococcaceae，23.79%）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae，8.12%）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae，3.70%）；冷藏4 d優(yōu)勢菌為鏈球菌科（33.04%）、希瓦氏菌科（Shewanellaceae，21.73%）、莫拉氏菌科（19.90%）、假單胞菌科（15.51%）和李斯特氏菌科（Listeriaceae，5.89%）；冷藏8 d為鏈球菌科（53.13%）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）（18.16%）、希瓦氏菌科（8.67%）、莫拉氏菌科（4.00%）、扁球菌科（Planococcaceae，3.36%）和葡萄球菌科（2.03%）。

圖 3 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程微生物多樣性及組成變化Fig. 3 Changes in microbial community diversity and composition in sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由圖3F可知，LEfSe（LDA Effect Size）分析顯示了鯰魚肉在冷藏0、4、8 d間相對豐度均有顯著差異的微生物。冷藏0 d相對豐度差異顯著的微生物種類最多，包括10 個科、13 個屬；冷藏4 d差異微生物為希瓦氏菌屬（）、假單胞菌屬（）；冷藏8 d差異微生物共2 個科（扁球菌科、鏈球菌科）、4 個屬（庫特氏菌屬、明串珠菌屬、摩根氏菌屬、鄰單胞菌屬）。

2.4 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中微生物與理化指標(biāo)相關(guān)性分析

圖 4 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中微生物數(shù)量與理化指標(biāo)相關(guān)性（A）及冗余分析結(jié)果（B）Fig. 4 Correlation between microbial counts and physicochemical parameters of sodium alginate-coated catfish felsh during cold storage (A)and redundancy analysis (B)

表 3 環(huán)境因素與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between environmental factors and microbial community structure

對相對豐度大于1%的屬水平微生物絕對數(shù)量與理化因子進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。由圖4可知，乳球菌屬的絕對數(shù)量與樣本的各理化因子均有顯著相關(guān)性（＜0.05），與組胺、酪胺含量、、Δ呈極顯著正相關(guān)（＜0.001，＞0.8），與持水力、pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01，＞0.8）。而不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬、鏈球菌屬、黃桿菌屬、金黃桿菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性則與乳球菌屬基本相反。

不動桿菌屬與TVB-N含量、、呈極顯著負(fù)相關(guān)。嗜冷桿菌屬、黃桿菌屬與TBARs值、腐胺、尸胺、總胺含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與pH值（除黃桿菌屬）、呈極顯著正相關(guān)。鏈球菌屬、金黃桿菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性基本相同，它們與腐胺含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與呈極顯著正相關(guān)。不同冷藏時間微生物絕對數(shù)量之間的相關(guān)性顯示，乳球菌屬豐度與庫特氏菌屬呈極顯著正相關(guān)，金黃桿菌屬與鏈球菌屬、黃桿菌屬之間互為極顯著正相關(guān)。

冗余分析（圖4B、表3）顯示，所選理化指標(biāo)共解釋了93.9%的微生物變化信息，其中AX1與AX2的特征值分別為0.446和0.346，累計解釋79.2%的變化信息。微生物數(shù)量、理化因子間的相關(guān)性與Pearson相關(guān)性分析結(jié)果相符。

3 討 論

3.1 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中理化指標(biāo)的變化

本研究監(jiān)測冷藏期間革胡子鯰魚肉持水力、pH值、TVB-N含量、TBARs值和生物胺含量的動態(tài)變化。結(jié)果表明，各項理化指標(biāo)均從冷藏4 d開始變化速率加快，這與微生物在冷藏4 d時數(shù)量增加的趨勢一致。革胡子鯰魚肉持水力在冷藏4～6 d顯著降低，有研究認(rèn)為肌原纖維蛋白變性及pH值降低會導(dǎo)致魚肉持水力下降。本研究亦發(fā)現(xiàn)pH值與持水力有正相關(guān)性。根據(jù)文獻(xiàn)報道，魚肉貯藏過程中pH值的降低源于糖原的分解和二氧化碳的溶解，而pH值的升高主要是由于魚肉中腐敗細(xì)菌產(chǎn)生的氨和其他揮發(fā)性堿。此外，產(chǎn)酸腐敗菌的繁殖也會造成食品pH值下降。本研究中革胡子鯰魚肉pH值在冷藏4～8 d的快速下降可能與乳球菌屬的生長和代謝有關(guān)，而在冷藏8～10 d pH值的上升則與TVB-N含量和生物胺在此時段快速上升的趨勢相吻合。

TVB-N含量是衡量水產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。國標(biāo)規(guī)定淡水魚類TVB-N含量不高于20 mg/100 g。本研究中革胡子鯰魚肉初始TVB-N含量較低，但在8～10 d快速增加并超過了食用上限，TBARs值在冷藏期間逐漸升高，但始終未超過1.0 mg/kg，表明脂肪氧化不是限制覆膜革胡子鯰魚肉貨架期的關(guān)鍵因素。本研究檢測到的主要腐敗生物胺為腐胺、尸胺、酪胺和組胺，組胺在魚肉腐敗時含量未超過安全上限。

3.2 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中微生物多樣性及組成

魚肉腐敗與微生物的數(shù)量和組成密切相關(guān)。本研究分析了海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉在4 ℃條件下冷藏的微生物多樣性和組成。發(fā)現(xiàn)魚肉中微生物的多樣性在冷藏0 d最高，之后顯著降低，這與Zotta等研究結(jié)果一致，是優(yōu)勢菌生長所致。本研究中革胡子鯰魚肉腐敗時優(yōu)勢菌有莫拉氏菌科、鏈球菌科、假單胞菌科、希瓦氏菌科、腸桿菌科及扁球菌科。在屬水平上，乳球菌屬、鄰單胞菌屬、摩根氏菌屬、希瓦氏菌屬和假單胞菌屬在冷藏4、8 d的魚肉中相對豐度較高，這些菌均為魚肉中常見腐敗菌。已有研究表明，包裝方式對魚肉特征腐敗菌有重要影響。假單胞菌、希瓦氏菌是魚肉有氧包裝的優(yōu)勢腐敗菌，而氣調(diào)包裝魚肉中乳酸菌、腸桿菌和熱殺索絲菌為優(yōu)勢菌。本研究中，革胡子鯰魚肉冷藏4 d時優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌和希瓦氏菌，與托盤包裝冷藏鯰魚肉的優(yōu)勢腐敗菌相似。但是在冷藏8 d時，革胡子鯰魚肉乳球菌、腸桿菌的相對豐度顯著上升，而希瓦氏菌相對豐度顯著降低，可能是微生物代謝影響了包裝中氣體成分，從而抑制了好氧菌的生長。

3.3 海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉冷藏過程中微生物和理化指標(biāo)的相關(guān)性

微生物間的相互作用是影響魚肉微生物組成的重要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，乳球菌屬、庫特氏菌屬、希瓦氏菌屬、熱殺索絲菌屬間的相對豐度呈正相關(guān)。金黃桿菌屬、鏈球菌屬、黃桿菌屬與嗜冷桿菌屬四者互為正相關(guān)。黃桿菌和嗜冷桿菌在魚肉中十分常見，是冰鮮鱈魚的主要腐敗菌。Zotta等發(fā)現(xiàn)，0 ℃或10 ℃冷藏鱈魚及鰈魚肉中的黃桿菌屬與嗜冷桿菌屬含量均呈正相關(guān)。

明確理化因子與微生物間的相關(guān)性對防腐保鮮有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在所有相對豐度大于1%的微生物中，乳球菌屬數(shù)量與腐敗相關(guān)的各理化因子，包括組胺、酪胺、腐胺、尸胺、TVB-N含量、TBARs值呈顯著正相關(guān)，與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)。乳球菌屬是淡水魚腐敗菌之一，有產(chǎn)生物胺能力，其豐度隨冷藏時間延長而升高。魚乳球菌（）是一種具有腐敗活性的嗜冷乳酸菌，能夠造成鮭魚腐敗，在氣調(diào)或真空包裝的肉類食品中十分常見。棉子糖乳球菌（）是真空和氣調(diào)包裝鯰魚的優(yōu)勢腐敗菌之一，也可造成鯽魚、牡蠣等冷藏水產(chǎn)品腐敗。本研究可確定乳球菌屬是海藻酸鈉覆膜革胡子鯰魚肉的主要腐敗微生物，但具體腐敗菌株需進(jìn)一步分析驗證。

4 結(jié) 論

海藻酸鈉可食性膜覆膜革胡子鯰魚肉的微生物數(shù)量、TVB-N含量、TBARs值、尸胺、腐胺、酪胺含量在冷藏過程中顯著升高，腐敗時優(yōu)勢菌在科水平上為鏈球菌科、腸桿菌科和希瓦氏菌科，在屬水平上為乳球菌屬、鄰單胞菌屬、摩根氏菌屬和希瓦氏菌屬。乳球菌屬與魚肉腐敗指標(biāo)呈顯著正相關(guān)性，是革胡子鯰魚肉優(yōu)勢腐敗菌。