利奈唑胺耐藥腸球菌感染危險(xiǎn)因素及耐藥機(jī)制分析

夏 晴，呂 梅，李慶蓉，和平安，李 江，楊 旭

腸球菌為兼性厭氧的革蘭陽性球菌，廣泛分布于人和動(dòng)物消化道內(nèi)和自然環(huán)境中，是人體正常菌群之一，同時(shí)也是一種條件致病菌。近年來，由于臨床上抗生素的廣泛使用及侵襲性操作的普及，腸球菌已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一。腸球菌對(duì)多種抗生素天然耐藥，并可通過接受外來的耐藥質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或通過基因突變獲得耐藥性[1]，給預(yù)防治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。

1 材料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 研究對(duì)象 收集2018 年9 月—2020 年12月昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院分離的非重復(fù)腸球菌標(biāo)本2 898 份，其中LRE 陽性標(biāo)本38 份。根據(jù)LRE 感染來源分為醫(yī)院獲得性（HA-LRE）組和社區(qū)獲得性（CA-LRE）組，同時(shí)在盡可能相同標(biāo)本和科室中按照1∶4 的比例隨機(jī)抽取利奈唑胺敏感腸球菌（LSE）感染者標(biāo)本作為對(duì)照組。

腸球菌分離自患者無菌部位血液、體液標(biāo)本，胸腔和腹腔保留積液標(biāo)本，中段尿標(biāo)本。分離的菌株吸附在濾紙上而后冷凍干燥保存于－80 ℃。

不同感染部位診斷[3]：①尿路感染，出現(xiàn)尿頻、尿急、尿痛等尿路刺激癥狀，或有下腹觸痛、腎區(qū)叩痛，伴或不伴發(fā)熱，清潔中段尿培養(yǎng)腸球菌菌數(shù)≥104CFU/mL；②腹腔感染，引流液培養(yǎng)陽性和新的或加重的腹膜炎癥狀如腹部壓痛和反跳痛，腹水量增加或性質(zhì)改變；③燒傷后傷口感染，傷口愈合不良，切口周圍出現(xiàn)紅腫、發(fā)熱和疼痛，滲出物明顯增多，創(chuàng)面分泌物或膿液培養(yǎng)陽性；④血流感染為急性發(fā)熱，白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯增高，而無局限于某一系統(tǒng)的急性感染，出現(xiàn)皮疹、肝脾腫大、遷徙性膿腫等癥狀，血培養(yǎng)陽性。

1.1.2 病例資料收集 收集臨床基本信息包括人口學(xué)特征（性別、年齡），住院特征（外院轉(zhuǎn)入、住院科室、ICU 入住情況），基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕?、糖尿病、泌尿系統(tǒng)疾?。?，免疫狀態(tài)（低蛋白血癥、腫瘤），侵襲性操作（近6 個(gè)月手術(shù)史、氣管插管、導(dǎo)尿管），近6 個(gè)月抗菌藥物使用史（碳青霉烯類、利奈唑胺），多數(shù)菌感染（同一患者有2 個(gè)或更多種細(xì)菌或真菌感染）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 分離的LRE 采用紙片擴(kuò)散法（K-B 法）進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M100-S30 的標(biāo)準(zhǔn)，最低抑菌濃度（MIC）≥8 mg/L 為耐藥。通過在VITEK 2-Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）上使用AST-GP67 卡對(duì)分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

1.2.2 利奈唑胺耐藥基因檢測(cè) 復(fù)蘇LRE 菌株，提取基因組 DNA 及質(zhì)粒 DNA，采用PCR 技術(shù)分別擴(kuò)增23S rRNA V 區(qū)基因、編碼核糖體蛋白的L3、L4 基因及cfr、optrA和poxtA基因。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技公司進(jìn)行雙向測(cè)序。與標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌ATCC 29212 進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)腸球菌是否存在基因突變及耐藥基因。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料通過t檢驗(yàn)（正態(tài)分布變量）或秩和檢驗(yàn)（非正態(tài)分布變量）進(jìn)行單因素分析，計(jì)數(shù)資料通過卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法進(jìn)行單因素分析，計(jì)算相關(guān)統(tǒng)計(jì)量用百分比（%）表示。單因素分析中P＜0.1 的變量納入logistic 回歸模型中，用于評(píng)估LRE 感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）以評(píng)估關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

從38 例LRE 感染患者檢出38 株LRE，排除資料不完整5 例，共納入33 例LRE 感染患者。16例為醫(yī)院獲得性LRE 感染組，64 例醫(yī)院獲得性LSE 感染為對(duì)照組；17 例為社區(qū)獲得性LRE 感染組，68 例社區(qū)獲得性LSE 感染為對(duì)照組。38 株LRE 菌株主要來源為中段尿（20 例，52.6%），引流液（11 例，28.9%）。見圖1?？剖抑饕植荚诿谀蛲饪疲?7 例，44.7%）。見圖2。

2.2 藥敏試驗(yàn)

所有LRE菌株利奈唑胺的MIC值為8～16 mg/L，呈低水平耐藥。利奈唑胺耐藥屎腸球菌（LREfm，6 株）對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、米諾環(huán)素、四環(huán)素均耐藥，對(duì)萬古霉素、替考拉寧和替加環(huán)素均敏感。利奈唑胺耐藥糞腸球菌（LREfs，32 株）對(duì)克林霉素、奎奴普丁-達(dá)福普汀均耐藥，對(duì)紅霉素、四環(huán)素耐藥率為90%以上，對(duì)替加環(huán)素100%敏感，有3 株對(duì)萬古霉素耐藥。多重耐藥被定義為對(duì)3 種及以上抗菌藥物不敏感，本研究中所有LRE菌株均為多重耐藥。見表1。

表1 利奈唑胺耐藥腸球菌對(duì)17 種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)Table 1 Susceptibility of linezolid-resistant Enterococcus to 17 antibiotics[n（%）]

2.3 耐藥機(jī)制

HA-LRE 和CA-LRE 菌株主要耐藥機(jī)制都是攜帶optrA基因，均未發(fā)現(xiàn)23S rRNA V 區(qū)突變和獲得poxtA基因存在。有2 株LRE 菌株均未檢測(cè)到23S rRNA V 區(qū)，核糖體蛋白L3、L4 基因突變和攜帶cfr、optrA和poxtA基因，是否存在其他耐藥機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。見圖3。

2.4 HA-LRE 感染危險(xiǎn)因素分析

2.4.1 單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，入住ICU、氣管插管、膀胱沖洗是HA-LRE 感染主要的危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 醫(yī)院獲得性利奈唑胺耐藥腸球菌感染危險(xiǎn)因素的單因素分析Table 2 Univariate analysis of risk factors for hospital-acquired LRE infection

表2（續(xù)）Table 2（continued）

2.4.2 多因素分析 對(duì)單因素分析中P＜0.1 的變量進(jìn)行多變量logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)氣管插管（OR4.913，95%CI：1.119～21.571，P=0.035）是HALRE 感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。logistic 回歸模型的Hosmer Lemeshow 檢驗(yàn)表明數(shù)據(jù)擬合良好（χ2=8.595，df=7，P=0.283）。

2.5 CA-LRE 感染危險(xiǎn)因素分析

2.5.1 單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，低蛋白血癥、復(fù)數(shù)菌感染是CA-LRE 感染主要的危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 社區(qū)獲得性利奈唑胺耐藥腸球菌感染危險(xiǎn)因素的單因素分析Table 3 Univariate analysis of risk factors for community-acquired LRE infection

2.5.2 多因素分析 對(duì)單因素分析中P＜0.1 的變量進(jìn)行多變量logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)低蛋白血癥（OR10.166，95%CI：1.378～74.972，P=0.023）、復(fù)數(shù)菌感染（OR5.773，95%CI：1.198～27.828，P=0.029）是CA-LRE 感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。logistic 回歸模型的Hosmer Lemeshow 檢驗(yàn)表明數(shù)據(jù)擬合良好（χ2=0.39，df=1，P=0.532）。

3 討論

利奈唑胺是治療由多重耐藥革蘭陽性細(xì)菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素腸球菌（VRE）引起嚴(yán)重感染的重要藥物。在中國，2007 年將利奈唑胺引入臨床實(shí)踐后不久就出現(xiàn)了耐利奈唑胺的分離株[4]。近期研究顯示，在幾個(gè)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中，腸球菌分離株對(duì)利奈唑胺耐藥率較低（＜2%）[5]。但是，一旦出現(xiàn)高耐藥率，臨床治療就會(huì)出現(xiàn)問題，因此應(yīng)該引起足夠關(guān)注。本研究中，CA-LRE 感染占57.9%，表明社區(qū)感染不可忽視。我院分離的LRE 菌株主要來自泌尿外科，標(biāo)本類型主要為中段尿，可能原因?yàn)槊谀蛳到y(tǒng)疾?。I結(jié)石、輸尿管狹窄、前列腺增生、腫瘤等）引起排尿不暢，尿液潴留，增加了耐藥菌繁殖，以及泌尿道相關(guān)侵襲性操作，導(dǎo)致防御功能減弱，增加了耐藥菌感染的機(jī)會(huì)[6]。

本研究的38 株LRE 菌株對(duì)利奈唑胺呈低水平耐藥性，MIC 值為8～16 mg/L。LREfs 對(duì)克林霉素、奎奴普丁-達(dá)福普汀均耐藥，對(duì)紅霉素、四環(huán)素耐藥率為90%以上，與姚丹等[7]的研究相一致；與全國耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)相比[8]，我院LREfs 菌株對(duì)左氧氟沙星和慶大霉素的耐藥率明顯增高，可能與這些抗菌藥物普遍使用有關(guān)；其中有3 株對(duì)萬古霉素耐藥，對(duì)替加環(huán)素都敏感。LREfm 對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、米諾環(huán)素、四環(huán)素均有高的耐藥率，LREfm 整體耐藥水平高于LREfs。耐藥性的差異提示臨床應(yīng)根據(jù)細(xì)菌種類、耐藥率的變化合理選擇治療方案。

目前已明確的腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥機(jī)制主要有5 種，包括23S rRNA V 區(qū)突變，L3、L4 核糖體蛋白突變，攜帶poxtA基因，多重耐藥基因cfr介導(dǎo)的耐藥以及近年來研究逐漸增多的optrA基因[9]。各國對(duì)腸球菌利奈唑胺耐藥機(jī)制的報(bào)道越來越多，但主要耐藥機(jī)制不同。在本研究中，可轉(zhuǎn)移耐藥基因optrA是對(duì)利奈唑胺耐藥的主要機(jī)制，攜帶optrA基因菌株的高發(fā)率與韓國的先前研究相似[10]。愛爾蘭研究表明[11]，poxtA基因有較高流行。美國多中心研究發(fā)現(xiàn)利奈唑胺的主要耐藥機(jī)制是23S rRNA 中的G2576T 突變[12]。然而我院未發(fā)現(xiàn)LRE 菌株攜帶poxtA基因和23S rRNA突變。表明主要耐藥機(jī)制存在地域差異。

HA-LRE 感染危險(xiǎn)因素中，氣管插管是獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與Ma 等[13]研究相一致?？赡茉蛴校孩贇夤懿骞艿幕颊咦≡簳r(shí)間長，醫(yī)院環(huán)境中可能存在LRE 定植，通過醫(yī)源性感染、交叉感染等途徑將其傳播至患者；②患者免疫功能低下，同時(shí)伴有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病更易獲得LRE 感染；③患者同時(shí)伴有更多部位的侵襲性操作容易破壞皮膚和黏膜的屏障，損害宿主的防御系統(tǒng)，并把LRE 帶入機(jī)體引起感染。文獻(xiàn)報(bào)道男性、入住ICU、腸道灌洗、外院轉(zhuǎn)入、腫瘤等可能是LRE 感染的危險(xiǎn)因素，不同的研究結(jié)果之間存在差異。本研究除氣管插管外未發(fā)現(xiàn)其他危險(xiǎn)因素，可能原因是樣本量少。一些研究表明腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥性與利奈唑胺長期暴露有關(guān)[14]，但是也有從未接觸過利奈唑胺的患者體內(nèi)分離出利奈唑胺耐藥腸球菌[15]。我院HA-LRE 感染患者住院期間均無利奈唑胺用藥史，可能的解釋是先前的暴露或者院外曾經(jīng)使用但病史未記錄等。

在CA-LRE 感染危險(xiǎn)因素中，復(fù)數(shù)菌感染、低蛋白血癥是獨(dú)立危險(xiǎn)因素。值得注意的是，腸球菌和大腸埃希菌的綴合實(shí)驗(yàn)確定了革蘭陽性菌和革蘭陰性菌之間利奈唑胺耐藥基因的可轉(zhuǎn)移性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)數(shù)菌感染是獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能原因是在腸球菌分離物中檢測(cè)到的optrA基因可能是從臨床中的其他細(xì)菌（如大腸埃希菌）轉(zhuǎn)移而來的。通常低蛋白血癥患者免疫功能降低，容易受到外來細(xì)菌的侵襲，耐藥細(xì)菌間的水平傳播也更易在該環(huán)境下進(jìn)行。CA-LRE 耐藥機(jī)制檢測(cè)以optrA基因（78.9%）為主。有文獻(xiàn)報(bào)道，optrA基因在動(dòng)物來源腸球菌中檢出率可能更高，動(dòng)物源的腸球菌可能作為耐藥基因的貯存庫，成為社區(qū)內(nèi)腸球菌optrA基因的潛在來源[17]。有研究表明，腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥很可能通過耐藥基因的克隆擴(kuò)增或水平轉(zhuǎn)移在社區(qū)環(huán)境中傳播，然而社區(qū)環(huán)境中大多數(shù)病例與醫(yī)療相關(guān)，因此主要以醫(yī)療保健相關(guān)的方式傳播[18]。CA-LRE 感染的增加需要考慮動(dòng)物-環(huán)境-人的傳播途徑，動(dòng)物和食物可能成為潛在的危險(xiǎn)因素，需要加強(qiáng)食品安全管理。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HA-LRE 和CA-LRE感染的危險(xiǎn)因素有所不同，因此醫(yī)務(wù)人員應(yīng)該意識(shí)到有這些危險(xiǎn)因素的患者中存在LRE 感染的可能，并采取適當(dāng)抗感染措施。在社區(qū)環(huán)境中optrA基因介導(dǎo)的LRE 的出現(xiàn)令人震驚，應(yīng)該引起高度重視。

本研究存在一些局限性。首先，研究的LRE分離株的數(shù)量相對(duì)較少；其次，這是一項(xiàng)單中心研究。需要進(jìn)一步的多中心研究來確認(rèn)LRE 感染危險(xiǎn)因素及其主要耐藥機(jī)制。