天皰瘡主要自身抗體及其檢測臨床意義研究進展

王麒鈞，朱海琴，潘 萌

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科，上海 200025）

天皰瘡是一組由自身抗體介導(dǎo)的表皮內(nèi)自身免疫性大皰病的統(tǒng)稱，包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、副腫瘤型天皰瘡、IgA 型天皰瘡及皰疹樣天皰瘡等類型。天皰瘡患者的主要臨床表現(xiàn)為黏膜以及皮膚的水皰糜爛，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，重者可危及生命。天皰瘡屬罕見病，其中最為常見的類型是尋常型天皰瘡，其發(fā)病率為每年（0.1～0.5）例/10 萬人。天皰瘡多發(fā)生于成人，平均發(fā)病年齡為40～60歲。在普遍應(yīng)用全身性免疫抑制劑治療前，該病患者的5 年生存率不足30%，患者往往死于體液蛋白流失、進食受限導(dǎo)致的電解質(zhì)失衡、營養(yǎng)不良等。

1963年，Beutner 及Jordon 等首先應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)了天皰瘡患者血清中的自身抗體。此后，隨著免疫印跡及免疫沉淀檢測技術(shù)的應(yīng)用，明確了抗Dsg1、Dsg3 抗體是天皰瘡的主要自身抗體類型，并且為直接致病作用。以上研究結(jié)果證明天皰瘡是一種自身抗體介導(dǎo)的單器官免疫疾病，而抗Dsg1、Dsg3 抗體檢測在疾病的診斷及治療中起到較為重要的作用。近年來，隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多新的自身抗體被發(fā)現(xiàn)，并被證實在天皰瘡的致病過程中起到了協(xié)同作用，進一步完善了天皰瘡的致病機制研究。本文回顧近年國內(nèi)外相關(guān)文獻，對天皰瘡患者外周血中發(fā)現(xiàn)的自身抗體及作用機制及其在疾病診斷、治療監(jiān)測中的研究新進展作一綜述，為天皰瘡自身抗體的基礎(chǔ)及臨床研究提供參考。

天皰瘡主要自身抗體及作用機制

天皰瘡的自身抗體主要存在于患者皮損部位及外周血中，包括抗橋粒芯蛋白抗體、抗橋粒膠蛋白抗體、抗斑蛋白家族抗體及抗乙酰膽堿抗體等，這些抗體之間相互協(xié)同，作用于表皮細胞間的黏附分子，使其產(chǎn)生功能障礙，進而導(dǎo)致表皮棘細胞層結(jié)構(gòu)松解形成水皰、大皰?；谝陨现虏∵^程，近年對于抗體作用機制的研究主要聚焦于引發(fā)棘層松解的抗體種類及其介導(dǎo)的信號通路。

一、抗橋粒芯蛋白（desmogelin，Dsg）抗體

Dsg 是一類鈣黏素，其與其他鈣黏素同屬于鈣依賴性細胞黏附分子家族，共同形成和維持組織的完整性。Dsg 屬于橋粒鈣黏素的一種，有4 種異構(gòu)體（Dsg1～Dsg 4），而Dsg1 和Dsg3 這2 種亞型基本僅表達于復(fù)層鱗狀上皮，是天皰瘡致病的主要靶抗原。

1.抗體亞型：抗Dsg3 抗體是尋常型天皰瘡的標志性抗體，其抗體亞型主要有IgG、IgA 及IgE 型；抗Dsg1 抗體則是落葉型天皰瘡的標志性抗體，其抗體亞型主要有IgG、IgA[1]，上述2 種抗體均存在于患者的外周血及皮損中。關(guān)于IgG 抗體亞型的研究結(jié)果多表明，天皰瘡患者在疾病活動期時體內(nèi)的IgG 抗體亞型以IgG4 亞型為主，而在緩解期時則以IgG1 亞型為主，且其IgG4 與IgG1 抗體比值與其疾病活動性在一定程度上呈正相關(guān)，但IgG1 及IgG4 抗體均可參與致病，且致病性類似[2-3]。近年也有研究提示，IgG3 亞型抗體在天皰瘡的疾病進展過程中也存在一定作用[4]。IgA 型抗體多見于IgA 型天皰瘡患者；抗Dsg3 的IgE 型抗體也可見于一部分的尋常型天皰瘡患者[5]。

2.作用機制：抗Dsg 抗體識別的主要抗原表位位于Dsg結(jié)構(gòu)的N端，當抗Dsg 抗體與Dsg 結(jié)合后，主要通過以下兩方面起作用，促使水皰形成[6-7]。①抗原抗體結(jié)合后產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，抑制鈣黏素的同嗜和異嗜性黏附，喪失黏附效應(yīng)。既往研究提示，抗Dsg3 抗體能夠抑制Dsg3 的同嗜性黏附，而抗Dsg1 抗體則無明顯的抑制同嗜作用。Ishii 等[8]采用微珠包裹重組人抗原的方法，證明抗Dsg1、Dsg3 抗體無需經(jīng)過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就可分別抑制Dsg1/橋粒膠蛋白（desmocollins，Dsc）1、Dsg3/Dsc3 的異嗜性相互作用，進而導(dǎo)致細胞間產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，促進細胞解離。②抗Dsg 抗體與Dsg結(jié)合引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要包括Ca2+、p38MAPK、磷脂酶C/蛋白激酶C、表皮生長因子受體等多條信號通路，導(dǎo)致細胞間黏附功能紊亂。近年研究提示，磷脂酶C 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可能是天皰瘡發(fā)病過程中最早的事件[9]?？笵sg1 抗體結(jié)合Dsg1 后能夠激活磷酸肌醇14-激酶α，進而激活磷脂酶C-γ1，產(chǎn)生三磷酸肌醇，與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三磷酸肌醇受體結(jié)合，進而引起Ca2+內(nèi)流，而蛋白激酶C 也是Ca2+通路下游的主要作用靶點之一。生理狀況下，Dsg3 與橋斑珠蛋白結(jié)合后可抑制p38MAPK，而當Dsg3 與自身抗體結(jié)合后，可產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，從而導(dǎo)致其細胞黏附功能喪失，進而激活p38MAPK，促進Dsg3 的內(nèi)化及角蛋白的回縮[10]?？笵sg3 抗體與Dsg3 結(jié)合還能夠通過Ca2+途徑及Src 途徑激活表皮生長因子受體，進而參與斑珠蛋白磷酸化、激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 和9 等天皰瘡致病途徑[11-12]。

二、抗Dsc 抗體

Dsc 與Dsg 類似，也屬于Ca2+依賴性鈣黏蛋白家族中的一種，兩者成對存在，參與組成細胞間的橋粒結(jié)構(gòu)，為相鄰的上皮細胞提供黏附作用。Dsc 共有3 種異構(gòu)體（Dsc1～Dsc3），陸續(xù)有報道在副腫瘤型天皰瘡、尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡及皰疹樣天皰瘡患者中發(fā)現(xiàn)了IgG 型的抗Dsc 抗體（包括Dsc1～Dsc3）。抗Dsc 抗體在落葉型、尋常型天皰瘡患者外周血中陽性率高低不一（0～44%），而在PVe、副腫瘤型天皰瘡、皰疹樣天皰瘡等少見類型天皰瘡患者的外周血抗Dsc 抗體陽性率（40%～67%）更高[13-14]。

抗Dsc 抗體的病理效應(yīng)過程也一直受到研究人員關(guān)注，其中抗Dsc3 抗體的致病性已被學(xué)界普遍認可。Chen 等[15]發(fā)現(xiàn)，Dsc3 基因缺失的小鼠會產(chǎn)生水皰糜爛。體外實驗也證實，IgG 型抗Dsc3 抗體能夠單獨造成細胞黏附功能喪失及棘層松解。但抗Dsc3 抗體導(dǎo)致天皰瘡的具體分子機制目前尚未完全闡明，推測其可能是通過空間位阻效應(yīng)致病，即分子彼此接近時引起空間阻礙作用；或是通過特異性識別結(jié)合EC2 結(jié)構(gòu)閾中的鈣依賴性抗原決定簇，從而耗竭Dsc3 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞黏附功能喪失、棘層細胞松解；或同時存在與其他少見自身抗體的協(xié)同致病作用[16]。

三、抗斑蛋白家族抗體

斑蛋白家族包括橋斑蛋白、網(wǎng)蛋白、大皰性類天皰瘡抗原1、包斑蛋白、周斑蛋白及epiplakin等，是一組具有多結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白。這些蛋白參與連接細胞骨架，形成復(fù)雜的連接結(jié)構(gòu)。針對這一組抗原的抗體僅見于副腫瘤型天皰瘡患者外周血及皮損中，其中抗包斑蛋白抗體和抗周斑蛋白抗體最為常見[17]。斑蛋白分子是一類胞質(zhì)內(nèi)抗原，在副腫瘤型天皰瘡患者中最為常見（74.2%～80.6%），目前已作為其診斷標準之一納入指南。以上這些抗體均為IgG 型抗體，并不能穿過細胞膜產(chǎn)生效應(yīng)，故這一組抗體與天皰瘡發(fā)病間的相關(guān)性尚不清楚。

四、抗乙酰膽堿受體抗體

在人的表皮內(nèi)存在非神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)，其在角質(zhì)形成細胞間以及角質(zhì)形成細胞與基質(zhì)的連接黏附之間起到重要作用?？挂阴Ｄ憠A受體抗體也是一組參與天皰瘡致病過程的抗體，其中主要包括抗毒蕈堿樣膽堿受體（Muscarinic acetylcholine receptor，mAChR）抗體、抗煙堿樣膽堿受體抗體及抗Pemphaxin（PX）抗體[18]。

1.mAChR：mAChR 是一種跨膜糖蛋白，其包括5 種亞型（M1～M5）。早年體外實驗發(fā)現(xiàn)，激活mAChR 能夠逆轉(zhuǎn)由天皰瘡抗體引起的棘層細胞松解，提示乙酰膽堿受體受損可能是天皰瘡病理過程中的一環(huán)。85%～100%的天皰瘡患者血清中存在抗mAChR 抗體，其中又以抗M3 亞型抗體為主，其滴度與天皰瘡疾病面積指數(shù)（pemphigus disease area index,PDAI）有著較好相關(guān)性（r=0.65,P<0.0001）。Chernyavsky 等[19]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，抗M3 型mAChR 抗體的存在與棘層松解的嚴重程度相關(guān)，這是由于在生理情況下持續(xù)激動M3 型mAChR，能夠保持基底細胞與基底膜之間的黏附作用。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)，抗M3 型mAChR 抗體與抗hSPCA1（ATP2C1 編碼的Ca2+/Mn2+ATP 酶）抗體在Dsg1、Dsg3 陰性天皰瘡的致病過程中起到協(xié)同致病作用。

2.煙堿樣膽堿受體：煙堿樣膽堿受體是配體門控離子通道蛋白超家族的成員，其功能主要是介導(dǎo)Na+和Ca2+內(nèi)流以及K+的外排。天皰瘡患者體內(nèi)的抗煙堿樣膽堿受體抗體與線粒體外膜上的煙堿樣膽堿受體結(jié)合，使線粒體的呼吸鏈發(fā)生變化，進而導(dǎo)致膜電位改變、H+滲漏，細胞內(nèi)的活性氧濃度增加，Cyt C 異常釋放，促進線粒體和整個細胞的凋亡，參與天皰瘡的發(fā)病[20]。

3.Pemphaxin（PX）：PX 是一種相對分子質(zhì)量為75 000的膜聯(lián)蛋白，也被稱為膜聯(lián)蛋白31 或ANXA 9，其同時具有煙堿樣及毒蕈堿樣的雙重藥理作用，故被視為乙酰膽堿受體的一種。體外實驗中，抗PX 抗體能夠?qū)е缕つw棘層松解。但在小鼠實驗中，單獨的抗PX 抗體及洗去抗PX 抗體的天皰瘡抗體均不能產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀，提示天皰瘡患者水皰的形成是由于多種抗體綜合效應(yīng)的結(jié)果[18]。

五、其他少見抗體

近年來，隨著對天皰瘡抗體的深入研究，還發(fā)現(xiàn)了一些天皰瘡患者外周血相對較為少見的抗體，如抗α2巨球樣蛋白1抗體、抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗hSPCA1 抗體、抗E-鈣黏素抗體、抗斑珠蛋白抗體、抗斑菲素蛋白抗體及抗高親和力IgE 受體抗體，有部分研究提示這些少見抗體也在致病過程中起到協(xié)同作用，從側(cè)面證明天皰瘡是一類異質(zhì)性疾病[18]。

天皰瘡自身抗體的檢測及臨床意義

一、抗體檢測

臨床診斷天皰瘡的依據(jù)主要由臨床癥狀、組織病理學(xué)檢查結(jié)果以及自身抗體檢測結(jié)果三部分組成。作為一種主要由自身抗體介導(dǎo)的器官特異性自身免疫病，確定自身抗體的存在是確診天皰瘡不可或缺的條件。目前，檢測天皰瘡自身抗體的方法主要包括免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）、蛋白質(zhì)印跡、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等，用于診斷天皰瘡的靈敏度及特異度見表1。在臨床實踐中，免疫熒光與ELISA 為較好的初篩方法，能夠明確大部分患者的診斷，當無法明確診斷時，免疫印跡技術(shù)可作為有效的補充。而化學(xué)發(fā)光免疫分析法作為新的技術(shù)，尚未得到廣泛應(yīng)用，其靈敏度及特異度仍待進一步驗證。

表1 臨床常用抗體檢測方法診斷天皰瘡的靈敏度及特異度

1.免疫熒光法：免疫熒光法檢測天皰瘡自身抗體最早在臨床診療中得到應(yīng)用。臨床上常用的免疫熒光檢測方法分為直接免疫熒光及間接免疫熒光，2 種方法能夠分別確定患者皮膚及外周血中是否存在針對皮膚的自身抗體、確定其自身抗體沉積于棘層細胞間或基底膜帶，從而初步排除類天皰瘡及其余非自身免疫性大皰病。直接免疫熒光結(jié)果顯示，IgG 和（或）C3 在棘細胞間沉積是診斷天皰瘡的金標準。猴食管作為底物的間接免疫熒光也能夠很好地顯示棘細胞間沉積的抗體，其是最早作為診斷標準納入國內(nèi)外臨床指南。但在一些情況下（比如抗ABO 血型抗體干擾），免疫熒光法也可能出現(xiàn)不準確的結(jié)果[21]。而使用高表達斑蛋白家族的小鼠膀胱組織作為底物，則有助于明確副腫瘤型天皰瘡（免疫學(xué)特征為產(chǎn)生抗斑蛋白自身抗體）的診斷[22]。

2.蛋白質(zhì)印跡法檢測：蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測是一種經(jīng)典的抗體鑒定方法，早年也常被用于天皰瘡抗體的檢測，但由于其步驟相對繁瑣、實驗時間較長，近年已不推薦用于臨床檢測[22]?，F(xiàn)該方法多用于檢測除抗Dsg1、Dsg3 抗體外的一些相對少見的自身抗體，如抗Dsc 抗體等，結(jié)合臨床癥狀有助于提示診斷增殖型天皰瘡、皰疹樣天皰瘡等少見類型的天皰瘡。同時，蛋白質(zhì)印跡法檢測也是發(fā)現(xiàn)新的天皰瘡抗原的重要方法。

3.ELISA：ELISA 由于能夠區(qū)分特異性的自身抗體，并且能夠定量檢測，目前已被越來越多地被應(yīng)用于天皰瘡的臨床診斷?，F(xiàn)商用的ELISA 試劑盒可以檢測針對Dsg1、Dsg3、envoplakin 和periplakin 的抗體，靈敏度和特異度均較高，檢測過程也相對簡便、快捷，能夠較好地對尋常型天皰瘡（僅抗Dsg3 抗體陽性或抗Dsg1、Dsg3 抗體雙陽性）、落葉型天皰瘡（僅抗Dsg1 抗體陽性）及副腫瘤型天皰瘡（抗envoplakin、periplakin 抗體陽性）進行明確的分型診斷，與間接免疫熒光結(jié)果聯(lián)合使用，能夠避免后者可能產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，進一步減少誤診?，F(xiàn)國內(nèi)外臨床指南均已將ELISA 的陽性結(jié)果納入天皰瘡的診斷標準[23]。

4.其他檢測技術(shù)：近年來還有一些新的檢測技術(shù)，如BIOCHIP、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法等已被用于臨床檢驗。BIOCHIP 是采用人工重組底物與傳統(tǒng)底物結(jié)合組成的BIOCHIP 進行間接免疫熒光檢測的方法，該方法能夠同時檢測多種底物，在兼具高效的同時，有較高的靈敏度和特異度[24]。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法是近年來一種檢測特異性抗體的新方法，具有快速、自動和節(jié)約標本的優(yōu)點，其結(jié)果與ELISA 結(jié)果間高度一致（在Dsg1，為96%，在Dsg3，為97%），但在抗原抗體孵育時間不足的情況下可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，故其用于臨床診斷的可靠性仍需進一步行研究驗證[25-26]。

二、抗體檢測意義

1.判斷病情：已有多個研究對ELISA 法測定的抗Dsg1、Dsg3 滴度與天皰瘡疾病嚴重程度間的相關(guān)性進行了探索，但相關(guān)結(jié)論并不完全統(tǒng)一[27-28]。65%以上的研究提示，抗Dsg1、Dsg3 抗體與天皰瘡疾病活動間存在正相關(guān)性（尤其抗Dsg1 抗體）[29]，但仍存在一部分臨床緩解但抗體滴度較高的患者。目前有較多研究對這一問題進行了探討，有研究表明，可能存在非致病性的抗非Ca2+依賴表位的抗Dsg3 抗體，故一部分臨床緩解的患者其外周血抗Dsg3 抗體仍處于較高滴度，對抗Ca2+依賴表位抗Dsg 抗體的監(jiān)測（使用EDTA處理樣本）可能有助于臨床醫(yī)師更準確地監(jiān)測患者的病情[30-32]。然而，緩解期抗體高滴度患者的外周血抗體仍能夠使重組Dsg3-Dsc3 磁珠解離，證明其仍存在致病性[23]，故可能存在非致病性抗體以外的其他機制導(dǎo)致緩解期高滴度現(xiàn)象的出現(xiàn)。另有研究提示，特異性的抗體亞型比例可能與天皰瘡疾病嚴重程度間具有一定程度的相關(guān)性，活動期患者外周血中以IgG4 抗體亞型為主[IgG4∶IgG1=（1.28～3）∶1]，穩(wěn)定期患者外周血中則以IgG1 抗體亞型為主（IgG4∶IgG1=1∶7）[32]。除上述外，尚有研究提示毛囊熒光強度與天皰瘡疾病活動度呈正相關(guān)（r=0.505，P<0.05），可考慮作為臨床監(jiān)測疾病活動度的工具[33]。

2.預(yù)測天皰瘡復(fù)發(fā)：在預(yù)測天皰瘡復(fù)發(fā)方面，Abasq 等[29]研究表明，ELISA 檢測抗Dsg1 抗體≥20 U/mL 能夠較好地預(yù)測皮膚復(fù)發(fā)（陽性預(yù)測值為79%，陰性預(yù)測值為84%）；而ELISA 檢測抗Dsg3 抗體≥130 U/mL，能夠較好地預(yù)測黏膜復(fù)發(fā)（陽性預(yù)測值為84%，陰性預(yù)測值為81%）。還有研究顯示，抗Dsg3 抗體ELISA 及直接免疫熒光檢測雙陽性的穩(wěn)定期尋常型天皰瘡患者，平均無復(fù)發(fā)時間更長（28.6 個月比53.7 個月，P=0.015），但其單獨檢測預(yù)測復(fù)發(fā)的靈敏度（59%，61%）、陽性預(yù)測值（0.56，0.68）及陰性預(yù)測值（0.75，0.67）并不高[34]。

天皰瘡患者初次診斷時，其抗體水平也可能影響其疾病復(fù)發(fā)的風險，診斷時僅Dsg3 抗體陽性的患者，在臨床緩解時其抗體未轉(zhuǎn)陰，是天皰瘡復(fù)發(fā)的顯著預(yù)測因子（OR=7.89，95%置信區(qū)間為2.06～30.21，P<0.01）；診斷時抗Dsg1、Dsg3 抗體雙陽性的患者，在臨床緩解時其Dsg1 抗體未轉(zhuǎn)陰，也是天皰瘡復(fù)發(fā)的顯著預(yù)測因子（OR=5.74，95%置信區(qū)間為1.15～28.61，P=0.03）[35]。除上述研究外，還有個案報道顯示，天皰瘡患者的頭皮毛囊及皮膚直接免疫熒光檢測雙陰性，可能提示著較低的疾病復(fù)發(fā)風險，但這一結(jié)論尚缺乏大樣本研究驗證[33]。

3.指導(dǎo)治療：在大型臨床試驗RITUX3 證明了利妥昔單抗聯(lián)合小劑量激素治療的優(yōu)越性后，近年來利妥昔單抗聯(lián)合小劑量激素逐漸成為尋常型天皰瘡患者的一線治療方案。RITUX3 后續(xù)研究提示，治療后PDAI≥45 和（或）第3 個月抗Dsg1 抗體滴度＞20 IU/mL 和（或）抗Dsg3 抗體滴度＞130 IU/mL 的患者，復(fù)發(fā)風險更高（靈敏度為91%，特異度為60%，陽性預(yù)測值為50%，陰性預(yù)測值為94%），這部分人群可能需要第6 個月重復(fù)給藥治療[36]。這也提示，在臨近患者的治療終點時，臨床醫(yī)師需要結(jié)合其自身抗體的檢測結(jié)果來制定診療方案。

總結(jié)和展望

天皰瘡作為一種自身抗體介導(dǎo)的慢性潛在致命性自身免疫疾病，對其自身抗體的研究及檢測有助于揭示疾病的發(fā)病機制、準確評估患者的疾病活動度、指導(dǎo)臨床用藥。本文總結(jié)了天皰瘡主要自身抗體在疾病中作用機制的研究進展，以及自身抗體檢測在診斷、評估、監(jiān)測等臨床應(yīng)用領(lǐng)域的探索發(fā)現(xiàn)。

未來對于天皰瘡自身抗體致病機制進行更深入研究，能夠進一步揭示天皰瘡的具體病理機制及疾病進展過程，有助于尋找更加精準、有效的治療靶點。同時，更多大樣本、多中心的臨床研究則有助于明確以及發(fā)現(xiàn)自身抗體檢測在疾病監(jiān)測方面的更多應(yīng)用，指導(dǎo)臨床診療。