絳紅小單孢菌突變株CH20190225-107的選育與鑒定

葛祥斌 徐鵬 劉陽 孟曉妍 葉暉 楊春敬 董宏偉

(福安藥業(yè)集團(tuán)煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司，煙臺(tái) 264001)

慶大霉素(gentamicin)是一種常見的氨基糖苷類抗生素，由絳紅小單孢菌(Micromonospora purprua)發(fā)酵產(chǎn)生，絳紅小單孢菌屬于放線菌目小單孢菌屬，革蘭氏陽性菌[1]。由于絳紅小單孢菌遺傳性能穩(wěn)定、不易突變、對(duì)誘變因素耐受性高等特點(diǎn)，因此傳統(tǒng)的化學(xué)誘變方法較難得到高產(chǎn)菌株。

ARTP(常溫等離子體誘變)是一種近年來發(fā)展起來的誘變方法，ARTP通過射頻輝光放電能產(chǎn)生各種高能活性離子，這些離子能改變細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，損傷到細(xì)菌的遺傳物質(zhì)，從而引起菌株突變，具有安全性高、操作簡(jiǎn)便、正突變率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。

本研究所用的出發(fā)菌株為本公司(福安藥業(yè)集團(tuán)煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司)冷凍管保存的絳紅小單孢菌GM20190109-15，其效價(jià)為1547 U/mL，組分C1、C1a、C2a、C2分別為24%、26%、25%、25%。采用ARTP結(jié)合氯化鋰化學(xué)誘變的方法對(duì)慶大菌株進(jìn)行誘變[4]，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度的方法進(jìn)行高通量初篩，經(jīng)復(fù)篩得到絳紅小單孢菌突變株CH20190225-107，其效價(jià)為2280 U/mL，組分C1、C1a、C2a和C2的相對(duì)比例分別為29%、23%、25%和23%，突變株發(fā)酵單位較出發(fā)菌株提高了47.4%。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 出發(fā)菌株

本公司(福安藥業(yè)集團(tuán)煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司)-80℃低溫儲(chǔ)存的絳紅小單孢菌GM20190109-15。

1.2 試劑配制

45%氫氧化鈉溶液：稱取90 g氫氧化鈉，加入110 mL重蒸水中溶解。

0.4 mol/L硼酸(pH 10.4)：稱取6.183 g硼酸，加入100mL重蒸水溶解，定容至250 mL，使用45%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.4。

鄰苯二甲醛(OPA)衍生試劑：稱取2.5 g OPA加入12.5 mL甲醇中溶解，加入237.5 mL 0.4 mol/L硼酸(pH 10.4)和5 mL巰基乙酸，使用45%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.4。

水相：稱取5.5 g庚烷磺酸鈉，加入240 mL重蒸水溶解。

20%氯化鋰：稱取20 g氯化鋰，加入80 mL重蒸水溶解。

0.9%生理鹽水：稱取0.9 g氯化鈉，加入50 mL重蒸水溶解，定容至100mL。

20%硫酸：量取20 mL濃硫酸，加入80 mL重蒸水中，邊攪拌邊緩慢加入。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

斜面培養(yǎng)基(1L)：瓊脂條12 g，麩皮12 g，可溶性淀粉7.5 g，天冬酰胺0.02 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.3 g，碳酸鈣1 g，調(diào)節(jié)pH至7.5，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

種瓶培養(yǎng)基的配制(1L)：可溶性淀粉6.25 g，蛋白胨5 g，玉米粉15 g，黃豆餅粉18.8 g，葡萄糖1 g，硝酸鉀0.6 g，氯化鈷0.24 mL(濃度為1.2 μg/mL)，碳酸鈣6.25 g，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基的配制(1L)：淀粉37 g，蛋白胨4 g，玉米粉11.5 g，黃豆餅粉35 g，葡萄糖2 g，硝酸鉀0.185 g，硫酸銨1 g，氯化鈷2 mL(濃度為10 μg/mL)，碳酸鈣3 g，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

分離培養(yǎng)基(1L)：瓊脂條12 g，可溶性淀粉7.5 g，天冬酰胺0.02 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.3 g，碳酸鈣1 g，調(diào)節(jié)pH至7.5，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

取絳紅小單孢菌GM20190109-15冷凍管孢子，吸取100 μL接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35.5℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 d。

1.2.2 孢子懸浮液制備

挖取1.0 cm2活化后的孢子加入含5 mL滅菌0.9%生理鹽水的三角瓶中，震蕩20 min，得到孢子懸液。

1.2.3 ARTP和氯化鋰復(fù)合誘變

取500 μL孢子懸液，加入20%氯化鋰250 μL，0.9%生理鹽水250 μL，震蕩混勻5 min，得到含5%氯化鋰的孢子懸液；震蕩混勻后，用移液槍吸取20 μL含5%氯化鋰的孢子懸液置于ARTP誘變樣品器中進(jìn)行誘變，調(diào)節(jié)誘變參數(shù)：誘變高度2 mm、氣體流量12 slm，誘變時(shí)間分別設(shè)置為20、40、60、80、100、120、140和300 s，開始誘變。

1.2.4 分離

將誘變后的孢子懸液和未誘變的孢子懸液分別稀釋至10-4、10-5、10-6和10-7，分別取100 μL誘變后的孢子懸浮液，涂布于含有分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，溫度為35.5℃、濕度為55%～65%下培養(yǎng)10～12 d，得到誘變后的單菌落，并計(jì)算致死率。

致死率(%)=(未誘變的菌落數(shù)-誘變的菌落數(shù))/未誘變的菌落數(shù)×100%

1.2.5 高通量篩選

用滅菌的牙簽挑取單菌落，接種于裝有種瓶培養(yǎng)基的24孔板上，35.5℃、220 r/min下培養(yǎng)42 h。之后吸取600 μL種瓶培養(yǎng)基接種于發(fā)酵孔板上，35.5℃、220 r/min下培養(yǎng)96 h，同時(shí)吸取100 μL接種于斜面孔板，35.5℃下培養(yǎng)10 d。發(fā)酵孔板長(zhǎng)成后，使用20%硫酸酸化發(fā)酵液至pH1.5～2.0，混勻后靜置20 min，3000 r/min離心20 min，吸取上清20 μL置于96孔板中，加入160 μL OPA衍生試劑、820 μL重蒸水， 60℃水浴15 min，之后吸取200 μL衍生后的發(fā)酵液加入96孔玻璃板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，震蕩5s，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm。

1.2.6 發(fā)酵搖瓶篩選

經(jīng)過“1.2.5”項(xiàng)下篩選得到數(shù)據(jù)較高的單菌落，從斜面孔板傳茄瓶斜面，在溫度為35.5℃、濕度為55%～65%下培養(yǎng)10～12 d。后挖取1.0 cm2孢子接入種子瓶中，35.5 ℃，220 r/min下培養(yǎng)42 h，在超凈工作臺(tái)中吸取10 mL菌絲種子，接入接發(fā)酵搖瓶，35.5℃，220 r/min下培養(yǎng)96 h。

1.2.7 高效液相色譜檢測(cè)

將發(fā)酵搖瓶中的發(fā)酵液酸化至pH1.5～2.0，混勻靜置20 min，過濾取上清液，衍生化步驟同“1.2.5”所示，采用高效液相色譜儀檢測(cè)效價(jià)及組份。液相條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18，柱溫為30℃，流動(dòng)相為甲醇:水相:乙酸=710:240:50(V/V/V)，流速1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。

1.2.8 穩(wěn)定性考察

對(duì)篩選出來的高產(chǎn)菌進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，考察突變菌株的遺產(chǎn)穩(wěn)定性。在超凈工作臺(tái)上用2#棒輕蹭孢子，接種在3支空白斜面培養(yǎng)基上，溫度為35.5℃、濕度為55%～65%下培養(yǎng)10～12 d，長(zhǎng)成后，挖取1.0 cm2孢子接種子搖瓶中，之后接發(fā)酵搖瓶，培養(yǎng)條件同上，使用高效液相色譜的方法檢測(cè)發(fā)酵液的效價(jià)及組份，重復(fù)上述工作4次。

1.2.9 生長(zhǎng)特性分析

(1) pH對(duì)突變株生長(zhǎng)的影響

取培養(yǎng)成熟的突變菌株茄瓶斜面，制成孢子懸液，稀釋至10-6。用移液槍吸取100 μL分別接種于pH分別為3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的含斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并設(shè)置3個(gè)平行，35.5℃培養(yǎng)6～10 d，每天記錄菌落數(shù)。

(2) 溫度對(duì)突變株生長(zhǎng)的影響

取稀釋至10-6的孢子懸液，用移液槍吸取100 μL接種于含斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。溫度設(shè)置為28℃～38℃，設(shè)置10個(gè)梯度，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，培養(yǎng)6～10d?？s小范圍后，再對(duì)長(zhǎng)出菌落的溫度范圍設(shè)置10個(gè)梯度，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，培養(yǎng)6～10 d。每天記錄菌落數(shù)。

(3) 濕度對(duì)突變株生長(zhǎng)的影響

取稀釋至10-6的孢子懸液，用移液槍吸取100 μL分別接種于含斜面培養(yǎng)基[pH為“1.2.9(1)”的最適pH]的培養(yǎng)皿中，濕度分別設(shè)置為35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%和70%，設(shè)置3個(gè)平行，在“1.2.9(2)”的溫度下培養(yǎng)6～10 d，每天記錄菌落數(shù)。

(4)突變株的培養(yǎng)時(shí)間確定

取稀釋至10-6的孢子懸液，配制10個(gè)分離培養(yǎng)基[pH為“1.2.9(1)”的最適宜pH值]，取100 μL孢子懸液接種于這10個(gè)培養(yǎng)基中，在“1.2.9(2)”的溫度下，“1.2.9(3)”的濕度下培養(yǎng)，每天記錄菌落數(shù)，至不再長(zhǎng)出菌落為止。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高通量突變株篩選

慶大霉素衍生物，借助酶標(biāo)儀，在波長(zhǎng)為325 nm下，檢測(cè)吸光度，其吸光值與慶大霉素效價(jià)呈線性關(guān)系，吸光值越大，慶大霉素效價(jià)越高，該方法可以快速檢測(cè)大量樣品。通過對(duì)192個(gè)樣品的檢測(cè)，最終篩選出6株吸光度較高的菌落，結(jié)果如表1所示。對(duì)這6株菌落進(jìn)行發(fā)酵搖瓶復(fù)篩，高效液相色譜儀檢測(cè)，得到CH20190225-107菌株，其效價(jià)有較大提高，C1提高較大，C1a降低明顯，液相數(shù)據(jù)如表2所示。

表1 初篩6個(gè)菌株與出發(fā)菌株的吸光度比較Tab.1 The data of high throughput screening

表2 突變菌株與出發(fā)菌株效價(jià)及C1、C1a、C2a、C2對(duì)比Tab.2 Comparison of the titer and composition of mutant strains with original strains

2.2 突變菌株菌落形態(tài)特征

突變株CH20190225-107形態(tài)如圖1(a)，出發(fā)菌株GM20190109-15形態(tài)如圖1(b)，兩者差異較大。突變株菌落扁平光滑、半透明、圓形、呈橙黃色，直徑3 mm左右，出發(fā)菌株菌落隆起、盤卷蠟樣、圓形、呈黑色，邊緣有棕色圈，直徑2 mm左右。

2.3 ARTP和氯化鋰共同作用合適條件的考察

通過對(duì)絳紅小單孢菌孢子懸液進(jìn)行ARTP和氯化鋰的復(fù)合誘變處理后，通過計(jì)算致死率來確定誘變時(shí)間。誘變時(shí)間與致死率的數(shù)據(jù)如表3，曲線如圖2所示，隨著誘變時(shí)間的增加，致死率顯著上升，60s時(shí)達(dá)到92%，當(dāng)誘變時(shí)間達(dá)到100 s以上時(shí)，致死率達(dá)到100%，因此選擇60 s作為最適誘變時(shí)間。

表3 ARTP和氯化鋰復(fù)合誘變的最適條件Tab.3 The optimal conditions for combined mutagenesis of ARTP and lithium chloride

2.4 突變株的穩(wěn)定性考察

對(duì)CH20190225-107連續(xù)傳5代，每代均使用高效液相色譜儀檢測(cè)效價(jià)及組分，結(jié)果顯示穩(wěn)定性良好，如表4所示，各組份的出峰時(shí)間與出發(fā)菌株一致，如圖3所示，說明該突變株高產(chǎn)及組分C1提高、C1a降低的特性具有遺傳穩(wěn)定性，具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)能力。

表4 CH20190225-107菌株5代發(fā)酵單位與組分?jǐn)?shù)據(jù)的比較Tab.4 Comparison of 5 liquid phase data of CH20190225-107 strain

2.5 斜面生長(zhǎng)條件研究

原始菌株GM20190109-15的最適生長(zhǎng)條件為：斜面培養(yǎng)基最適pH為7.5，培養(yǎng)溫度為35.5℃～36.5℃，濕度為55%～65%，培養(yǎng)時(shí)間為10 d。而在對(duì)突變株CH20190225-107的pH、溫度、濕度、生長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其斜面最適生長(zhǎng)條件為：培養(yǎng)基pH為7.0、溫度為37℃、濕度為55%、培養(yǎng)時(shí)間為3d，如圖4所示。與原始菌株相比，突變菌株的最適pH有所下降，培養(yǎng)溫度有所提高，濕度基本保持不變，培養(yǎng)時(shí)間大幅下降。

2.6 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果分析

50 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，將斜面菌種制成孢子懸液，接種到15 L種子罐，接種量為0.1%，培養(yǎng)64 h后接種到50 L發(fā)酵罐，接種量為30%，發(fā)酵周期為96 h。培養(yǎng)溫度36℃，通氣量1:1 vvm，罐壓0.02 MP，發(fā)酵過程中用30%NaOH溶液維持pH7.0，發(fā)酵罐接種后每24 h檢測(cè)1次慶大霉素效價(jià)。在50 L發(fā)酵罐上對(duì)突變株CH20190225-107發(fā)酵效價(jià)和組分進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)以出發(fā)菌株GM20190109-15為對(duì)照，考察突變株的慶大霉素效價(jià)變化和產(chǎn)品組分情況。發(fā)酵過程中慶大霉素效價(jià)如表5，曲線如圖5所示，產(chǎn)品組分如表6。突變株CH20190225-107的96 h放罐效價(jià)較出發(fā)菌株GM20190109-15提高了52.6%，C1提高了20.8%，C1a降低了21.4%。突變株CH20190225-107在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)，慶大霉素效價(jià)具有明顯的上升趨勢(shì)。

表6 突變株與出發(fā)菌株株組分變化比較(50L發(fā)酵罐)Tab.6 Comparison of component changes between mutant strain and original strain (50L fermentor)

表5 突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵周期與發(fā)酵單位的比較(50 L發(fā)酵罐)Tab.5 Comparison of fermentation cycle and fermentation unit between mutant and original strain (50 L fermentor)

3 結(jié)果與展望

采用ARTP和氯化鋰復(fù)合誘變的方法，對(duì)絳紅小單孢菌進(jìn)行處理，得到了高產(chǎn)菌株，提高慶大霉素產(chǎn)量和質(zhì)量。絳紅小單孢菌的細(xì)胞壁較厚，耐誘變因素強(qiáng)[5]，而ARTP技術(shù)可以增加細(xì)胞壁的通透性，有利于誘變劑的進(jìn)入，氯化鋰這種弱誘變劑，適合和其它誘變方式配合使用，對(duì)含有5%氯化鋰的孢子懸浮液，使用ARTP誘變60 s，可以使正突變率達(dá)到最高。本研究得到的突變菌株CH20190225-107，其搖瓶效價(jià)提高了47.4%、C1提高17.8%、C1a降低12.5%，經(jīng)穩(wěn)定性考察其性狀能夠穩(wěn)定遺傳。突變菌株CH20190225-107在50 L發(fā)酵罐中，表現(xiàn)出中后期生物活性強(qiáng)、效價(jià)高、產(chǎn)品質(zhì)量好的特點(diǎn)。該突變株經(jīng)過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)酵效價(jià)會(huì)進(jìn)一步提高。