PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)彌勒苣苔生長(zhǎng)的影響*

孫亞瑞，張峰程，許彬，何俊，孟靜，3

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201；3.云南省極小種群野生植物綜合保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

植物在自然環(huán)境里生長(zhǎng)，容易受到不同因素的影響，特別是非生物因素。其中，干旱脅迫會(huì)影響植物的地理分布，限制植物產(chǎn)量，影響植物的觀賞價(jià)值，制約植物生態(tài)效益[1-3]。聚乙二醇(PEG-6000)是一種乙醇聚合物，具有較強(qiáng)的吸水性，可使植物細(xì)胞脫水，從而達(dá)到模擬干旱脅迫的目的[4]。許多高等植物在遭受干旱脅迫時(shí)，常通過調(diào)節(jié)其自身代謝機(jī)制、保護(hù)酶類來應(yīng)對(duì)干旱[5]。例如：通過氣孔調(diào)控來加強(qiáng)保水能力，通過促進(jìn)根系生長(zhǎng)以增加吸水能力，通過糖和脯氨酸等物質(zhì)的積累來提高滲透調(diào)節(jié)能力，通過活性氧清除酶以及抗氧化劑來降低干旱損害等[6]。這些調(diào)節(jié)機(jī)制僅能忍受輕度和中度干旱，無法應(yīng)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的重度干旱。而一些通過獨(dú)特耐極端干旱的機(jī)制來適應(yīng)干旱的復(fù)蘇植物可以在極端缺水的條件生存，復(fù)水后可恢復(fù)正常的生長(zhǎng)發(fā)育[7-9]。

彌勒苣苔(OreocharismileensisMich.M?ller & A.Weber)為苦苣苔科(Gesneriaceae)馬鈴苣苔屬(OreocharisBenth.)多年生耐蔭草本，無地上莖，葉片基生，有柄，呈圓卵形，花冠黃色唇形，可作為室內(nèi)觀賞花卉，具有較高的觀賞價(jià)值和開發(fā)潛力[10-11]。1906年法國(guó)傳教士在云南彌勒縣首次采集到該種，時(shí)隔百年后，該種的野生群在云南石林縣再次被發(fā)現(xiàn)[12]。彌勒苣苔多生長(zhǎng)在石灰?guī)r地區(qū)，野生群僅在云南(彌勒、石林)、廣西(百色)、貴州(興義)分布，數(shù)目少，為極小種群，被列為珍稀瀕危植物[12-15]。因彌勒苣苔生長(zhǎng)環(huán)境惡劣，能夠在極端干旱條件下生存，一旦恢復(fù)水分就可以迅速恢復(fù)正常的生長(zhǎng)狀態(tài)，表明其為復(fù)蘇植物。Li等[16]研究了彌勒苣苔對(duì)極端干旱的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)它具有一種通過調(diào)節(jié)膜脂組成來應(yīng)對(duì)干旱的新的耐旱模式。目前，對(duì)于彌勒苣苔在干旱脅迫下形態(tài)和生理生化變化的研究還鮮有報(bào)道。因此，以2 a生彌勒苣苔植株為試驗(yàn)材料，通過不同濃度的聚乙二醇(PEG-6000)模擬干旱脅迫，觀測(cè)其形態(tài)特征變化并測(cè)定生理指標(biāo)，探討干旱脅迫對(duì)其生長(zhǎng)的影響，為其引種栽培及保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇2 a生生長(zhǎng)良好、無病蟲害的彌勒苣苔植株，栽植于規(guī)格16 cm×16 cm×12 cm的塑料盆中。栽培基質(zhì)采用草炭∶珍珠巖=1∶1。放置于溫室里統(tǒng)一管養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法

采用不同濃度的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，共設(shè)置4個(gè)處理：0(CK)、5%(T1)、10%(T2)、15%(T3)。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理6盆，重復(fù)3次，共72盆。試驗(yàn)前澆透水，3 d后用塑料袋包住栽植參試苗木的塑料盆底部，澆灌PEG-6000溶液，于干旱脅迫處理0 、4、8 d時(shí)分別觀測(cè)參試苗木形態(tài)指標(biāo)及測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

彌勒苣苔形態(tài)指標(biāo)的觀測(cè)：每隔4 d記錄一次植株的生長(zhǎng)表現(xiàn)(生長(zhǎng)旺盛與否)、葉片狀況(色澤的變化、萎蔫與否)。采用3級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)綜合評(píng)定參試苗木的受害程度：-，無傷害；+，植株生長(zhǎng)受到影響，出現(xiàn)葉片邊緣卷曲；++，植株停止生長(zhǎng)，葉片失水全部卷曲[17]。

生理指標(biāo)測(cè)定：每隔4 d，于8:30統(tǒng)一取樣，分別從植株基部葉片開始取樣[18]，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，所取葉片用錫箔紙包住，液氮速凍放入密封袋中，保存在-80 ℃的超低溫冰箱中，以待相對(duì)電導(dǎo)率(%)、葉綠素含量(mg/g)、丙二醛含量(nmol/g)、過氧化物酶〔U/(g·min)〕以及超氧化物歧化酶(U/g)等指標(biāo)的測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定重復(fù)3次。

相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法測(cè)定；葉綠素含量和丙二醛(MDA)含量分別用分光光度計(jì)法、硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定；過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定分別采用愈創(chuàng)木酚法和氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)分析，DPS 7.05進(jìn)行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果分析

2.1 干旱脅迫對(duì)彌勒苣苔形態(tài)特征的影響

不同濃度PEG-6000溶液處理后，T1、T2、T3處理隨時(shí)間的推移，葉片均表現(xiàn)出不同程度的萎蔫(表1)。第4 d，T2和T3處理葉片開始表現(xiàn)萎蔫，T1處理表現(xiàn)正常；第8 d時(shí)，T1、T2和T3處理葉片均表現(xiàn)萎蔫，T3處理的植株停止生長(zhǎng)，葉片失水全部卷曲，受害最重。

表1 干旱脅迫下彌勒苣苔葉片形態(tài)變化Tab.1 The observation of leaf morphology of O.mileensis under drought stress

2.2 干旱脅迫下彌勒苣苔相對(duì)電導(dǎo)率的變化

由圖1可知，隨著脅迫時(shí)間增加，CK處理彌勒苣苔葉片的相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，于第4 d達(dá)到最大值。T1和T2、T3處理葉片的相對(duì)電導(dǎo)率均在第8 d達(dá)到最大值，與第0 d相比分別增加了24.61%、33.68%和26.57%。干旱脅迫第4 d，CK處理葉片的相對(duì)電導(dǎo)率與T2處理相比差異顯著(P<0.05)，CK處理與T1和T3處理比較差異不顯著(P>0.05)；干旱脅迫第8 d，T2、T3處理葉片的相對(duì)電導(dǎo)率與CK相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 干旱脅迫下彌勒苣苔相對(duì)電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)注：圖中數(shù)據(jù)為平均值，不同小寫字母表示同一時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。Fig.1 The changes of relative conductivity of O.mileensis under drought stress

2.3 干旱脅迫對(duì)彌勒苣苔葉綠素含量的影響

由圖2可知，經(jīng)不同濃度的PEG-6000處理后，T2和T3處理隨著脅迫時(shí)間增加，彌勒苣苔葉片葉綠素含量呈上升趨勢(shì)。干旱脅迫第8 d，T2、T3處理葉綠素含量分別比CK增加20.86%和17.02%，T1處理較CK減少了6.88%； T2處理與CK間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 干旱脅迫下彌勒苣苔葉綠素含量的變化趨勢(shì)Fig.2 The changes of chlorophyll content in O.mileensis under drought stress

2.4 干旱脅迫對(duì)彌勒苣苔丙二醛含量的影響

由圖3可知，采用低濃度到高濃度的PEG-6000處理后，彌勒苣苔葉片的MDA含量呈現(xiàn)平穩(wěn)的上升趨勢(shì)。在脅迫第8 d時(shí)，T3處理葉片的MDA含量較CK、T1和T2分別增加了23.56%、26.27%、28.80%，存在極顯著差異(P<0.01)，CK、T1、T2處理之間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 干旱脅迫下彌勒苣苔丙二醛含量的變化趨Fig.3 The changes of MDA content in O.mileensis under drought stress

2.5 干旱脅迫對(duì)彌勒苣苔過氧化物酶活性的影響

由圖4可以看出，各處理葉片POD活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫時(shí)間的增加，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，于干旱脅迫第4 d達(dá)峰值，其中T2處理POD活性最高為615.50 U/(g·min)，較同一時(shí)間的CK顯著增加了14.92%(P<0.05)。各處理在第8 d時(shí)，POD活性均降低，較第4 d分別減少了43.46%、65.30%、58.43%、61.85%，處理間差異不顯著(P>0.05)。

圖4 干旱脅迫下彌勒苣苔過氧化物酶活性的變化趨勢(shì)Fig.4 The changes of POD activity in O.mileensis under drought stress

2.6 干旱脅迫對(duì)彌勒苣苔超氧化物歧化酶活性的影響

由圖5可知，各處理彌勒苣苔葉片SOD活性隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度增加，均呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。脅迫第8 d時(shí)，各處理SOD活性達(dá)到峰值，其中T3處理SOD活性最高；T1、T2、T3處理與CK處理SOD活性相比分別增加了49.19%、110.66%、141.76%，差異極顯著(P<0.01)。

圖5 干旱脅迫對(duì)彌勒苣苔超氧化物歧化酶活性的變化趨勢(shì)Fig.5 The changes of SOD activity in O.mileensis under drought stress

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫下，植物的形態(tài)特征可直接反映植物受損害的程度，株高、莖粗、葉片形態(tài)、葉片數(shù)和葉面積等植物地上部會(huì)因干旱脅迫造成不同程度的影響[20]。通常植物會(huì)通過放慢生長(zhǎng)速度或縮小葉面積來緩解水分虧缺造成的危害。本研究表明，PEG-6000濃度為5%對(duì)彌勒苣苔葉片生長(zhǎng)無顯著影響，而隨著干旱脅迫的加劇，葉片出現(xiàn)不同程度的卷曲，與Li等[16]對(duì)彌勒苣苔、趙日成[17]對(duì)長(zhǎng)瓣馬鈴苣苔(Oreocharisauricula)的研究結(jié)果相一致，表明彌勒苣苔可以通過葉片卷曲來適應(yīng)干旱環(huán)境。

植物在遭受干旱脅迫時(shí)，植株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害,相對(duì)電導(dǎo)率可用于判斷細(xì)胞膜損傷程度。產(chǎn)生過量活性氧自由基也會(huì)引起細(xì)胞膜脂過氧化，MDA是細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，它的大量累積是活性氧作用的表現(xiàn)。因此，MDA可用于表示細(xì)胞膜脂過氧化程度[19,21-22]。眾多研究者認(rèn)為相對(duì)電導(dǎo)率與MDA含量呈正相關(guān)。本研究表明，彌勒苣苔葉片隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量呈上升趨勢(shì)，各處理間差異不顯著(P>0.05)，與張璐等[23]對(duì)文冠果(Xanthocerassorbifolium)在干旱脅迫下耐鹽性的研究結(jié)果一致。在脅迫4 d時(shí)，T1、T2、T3處理植株的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率較CK差異不顯著(P>0.05)，推測(cè)在脅迫初期,彌勒苣苔植株有較強(qiáng)的抗旱性，未對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境造成嚴(yán)重傷害，與劉凱月等[24]對(duì)荊芥(Nepetacataria)的研究結(jié)果一致。在脅迫8 d時(shí)，T3處理葉片的MDA含量極顯著高于CK(P<0.01)，其相對(duì)電導(dǎo)率卻與CK差異不顯著(P>0.05)，推測(cè)在脅迫后期彌勒苣苔植株受害較輕，這與張丹丹等[25]對(duì)大花旋蒴苣苔(Boeaclarkeana)的研究結(jié)果一致，表明彌勒苣苔具有一定的耐旱性。

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，葉綠素是參與光合作用的一個(gè)重要因素，其含量能直接反映植物適應(yīng)、利用環(huán)境因子以及制造有機(jī)物的能力[26]。本研究表明，彌勒苣苔葉片中葉綠素含量整體呈上升趨勢(shì)，與羅孟容等[27]對(duì)梔子(Gardeniajasminoides)研究結(jié)果一致。而孔艷菊等[28]對(duì)黃櫨(Cotinuscoggygria)研究中表明干旱脅迫下，植物體內(nèi)葉綠素的合成和降解系統(tǒng)易受破壞，從而導(dǎo)致葉綠素含量降低。產(chǎn)生差異的原因可能是彌勒苣苔在干旱脅迫下具有抗旱性，能夠減輕干旱對(duì)葉綠素合成與降解系統(tǒng)的傷害。

POD是一種廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原酶，可清除羥基自由基和H2O2，也在抗旱性中發(fā)揮重要作用[29]。本研究表明，彌勒苣苔葉片POD活性在干旱脅迫4 d時(shí)上升很快，推測(cè)彌勒苣苔為了適應(yīng)所處的脅迫環(huán)境，激發(fā)體內(nèi)保護(hù)機(jī)制，與高興國(guó)等[30]對(duì)光葉珙桐(Davidiainvolucratavar.vilmoriniana)的研究結(jié)果一致。但在干旱脅迫第8 d時(shí)POD活性開始下降，推測(cè)干旱脅迫強(qiáng)度達(dá)到一定程度，超氧陰離子大量積累破壞酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性降低[31]。

植物受到干旱脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和清除活性氧的平衡系統(tǒng)就會(huì)受到破壞，導(dǎo)致活性氧積累。SOD是一種清除活性氧自由基(O2-)的酶，可以猝滅O2-的毒性，維持活性氧代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，使植物在一定程度上可以抵御水分脅迫[32]。本研究表明，各處理隨著時(shí)間的增加，干旱脅迫第4 d，SOD活性呈緩慢上升趨勢(shì)，與阮凌暄等[33]對(duì)鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)的研究結(jié)果不一致，推測(cè)在干旱初期彌勒苣苔葉片能夠正常生長(zhǎng)，體內(nèi)產(chǎn)生的O2-較少。在脅迫第8 d時(shí)，SOD活性達(dá)到最大值，T2、T3與CK、T1處理表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，與董晶晶等[34]對(duì)牛膝菊(Galinsogaparviflora)的研究結(jié)果一致，推測(cè)當(dāng)干旱脅迫達(dá)到一定的積累，彌勒苣苔體內(nèi)可產(chǎn)生大量的酶進(jìn)行自我保護(hù)。

綜上所述，在干旱脅迫后期，彌勒苣苔葉片出現(xiàn)不同程度的卷曲，來抵御干旱；相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量呈顯著上升趨勢(shì)，增加了彌勒苣苔葉片膜脂過氧化程度；在整個(gè)脅迫實(shí)驗(yàn)過程中，POD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)；SOD活性前期呈緩慢上升趨勢(shì)，后期各處理迅速升高，推測(cè)彌勒苣苔可以通過增強(qiáng)酶活性來保護(hù)其膜系統(tǒng)。