復(fù)合益生菌對眼斑雙鋸魚(Amphiprionocellaris)腸道消化酶、菌群結(jié)構(gòu)以及形態(tài)的影響

汪磊 武琳 曾范雙 任雪 崔舒暢 李木子 任同軍

摘要：為探討飼料中添加復(fù)合益生菌對眼斑雙鋸魚（Amphiprionocellaris）腸道消化酶、菌群結(jié)構(gòu)及形態(tài)的影響，將135尾初始體重（0.79±0.01）g的眼斑雙鋸魚隨機(jī)分為3組，每組3個重復(fù)，分別投喂復(fù)合益生菌有效活菌添加量為0%（對照組）、3%（L3組）和6%（L6組）的飼料，進(jìn)行為期28d的養(yǎng)殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示，復(fù)合益生菌能提升試驗(yàn)魚腸道蛋白酶的活性，其中L3組腸道蛋白酶顯著提升（P<0.05）;能顯著降低試驗(yàn)魚腸道淀粉酶活性（P<0.05）;能降低脂肪酶活性（P>0.05）。隨著飼料中益生菌添加量的增加，試驗(yàn)魚腸道中變形菌門豐度開始增多，擬桿菌門豐度降低。飼料中益生菌添加量的增加顯著降低試驗(yàn)魚腸道肌層厚度并顯著增加試驗(yàn)魚腸道絨毛高度（P<0.05）?？梢?，飼料中添加3%復(fù)合益生菌可改善眼斑雙鋸魚腸道消化酶活性，提高腸道微生物群落多樣性，改善腸道組織形態(tài)和功能。

關(guān)鍵詞：眼斑雙鋸魚（Amphiprionocellaris）;益生菌;消化;營養(yǎng)代謝

眼斑雙鋸魚（Amphiprionocellaris）屬鱸形目（Perciformes），雀鯛科（Pomacentridae），雙鋸魚屬（Amphiprion），俗稱公子小丑魚。眼斑雙鋸魚因其色彩艷麗、小巧可愛而深受人們的喜愛，近年來已成為觀賞魚養(yǎng)殖的熱門品種之一。觀賞魚產(chǎn)業(yè)常選用活體餌料進(jìn)行飼喂，但是由于活體飼料本身不方便存儲以及攜帶等缺點(diǎn)，因此使用人工配合飼料已經(jīng)是大勢所趨[1]。與經(jīng)濟(jì)魚類不同的是，觀賞魚的飼料應(yīng)注重提高觀賞魚的觀賞性和品質(zhì)[2]。目前觀賞魚產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，人工飼養(yǎng)小丑魚已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

益生菌可以通過改善宿主動物腸道微生物平衡進(jìn)而對其產(chǎn)生有益影響。目前市面上益生菌的主要種類有：芽孢桿菌類、乳酸菌類、酵母菌類和光合細(xì)菌類等[3]。研究表明，飼料中添加益生菌可以提高軍曹魚幼魚腸道蛋白酶活力[4]，改善雜交鱘腸道微生物環(huán)境[5]。本試驗(yàn)擬通過在飼料中添加不同水平的益生菌，探究其對眼斑雙鋸魚腸道消化酶、菌群結(jié)構(gòu)、組織形態(tài)的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌液

試驗(yàn)菌液為復(fù)合益生菌菌液，主要成分為植物乳桿菌、丁羧酸菌和枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)4.0×108CFU/mL。

1.2試驗(yàn)飼料設(shè)計(jì)

將魚粉、豆粕作為蛋白源，魚油、豆油作為脂肪源，制成粗蛋白質(zhì)含量約為51%，粗脂肪含量約為6%的基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的菌液，制成有效活菌含量分別為3%、6%的飼料。飼料制作前，先將全部飼料原料粉碎后過60目篩網(wǎng)，按照配方比例稱重后加入，均勻混合。最后加入預(yù)先混勻的魚油和大豆油。將油脂顆粒搓開后，在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上按照配方表取適量的菌液，加入到飼料中攪拌，直至均勻混合后加入適量的水，最后放入制粒機(jī)壓制成粒。直接放入-20℃冰箱中冷凍保存。每10d重新制作一次飼料，以保證飼料中益生菌活性。飼料組成詳見表1。

1.3試驗(yàn)動物及飼養(yǎng)方法

試驗(yàn)所用眼斑雙鋸魚購自大連老虎灘珊瑚館。投喂基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)兩周后，選取平均初始體重為（0.79±0.01）g的眼斑雙鋸魚135尾。將試驗(yàn)魚隨機(jī)分為三組，每組設(shè)置三個重復(fù)，即每個水族箱（長40cm、寬25cm、高40cm）中15尾眼斑雙鋸魚，飼養(yǎng)周期為28d。養(yǎng)殖周期內(nèi)，每天8：00和17：00進(jìn)行飽食投喂。投喂結(jié)束后用虹吸法吸取底部殘餌和糞便。馴養(yǎng)及正式試驗(yàn)均采用靜水養(yǎng)殖。定期補(bǔ)充因吸底和蒸發(fā)損失的海水，將缸中水位保持約為30cm。水溫保持在（25±0.5）℃，鹽度保持在（32.00±2.00）‰，pH值為8.0～8.2。保持每天24h不間斷充氧。

1.4眼斑雙鋸魚腸道相關(guān)指標(biāo)的測定

1.4.1眼斑雙鋸魚取樣養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚（停食24h）用丁香酚（1∶10000）麻醉后放置在冰盤上解剖。取試驗(yàn)魚腸道放入無菌離心管后迅速放置于液氮中凍存，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測定。用于做切片的腸道放到Bouin's液中進(jìn)行固定。

1.4.2消化酶的測定試驗(yàn)魚腸道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均采用南京建成生物工程研究所購買的試劑盒測定。樣品前處理、試劑配制和測定步驟嚴(yán)格按照操作說明書執(zhí)行。

1.4.3腸道菌群測定將冷凍保存的試驗(yàn)魚腸道樣本進(jìn)行腸道菌群測定。根據(jù)試劑盒說明書OMEGA試劑盒進(jìn)行DNA提取。之后利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量后，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。最后使用Qubit3.0熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定。

稀釋曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，以抽取的數(shù)據(jù)量為橫軸，以可操作分類單元數(shù)值為縱軸繪制曲線，根據(jù)曲線是否達(dá)到平緩來判斷本次測序數(shù)據(jù)量是否足夠。利用Mothur做分析，利用GraphPadPrism8軟件制作曲線圖得到稀釋曲線。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，觀測樣本在門分類水平上的群落結(jié)構(gòu)，利用GraphPadPrism8軟件制作堆積柱形圖。

眼斑雙鋸魚腸道微生物多樣性指數(shù)計(jì)算公式如下：

香農(nóng)指數(shù)=-∑S obs i=1n iNlnn iN;

豐富度指數(shù)=S obs+n 1（n 1-1）2[n 2+1]

辛普森指數(shù)=∑S obs i=1n i（n i-1）N（N-1）;

覆蓋率=1-n iN。

式中：S obs為實(shí)際觀測到的可操作分類單元數(shù);n i為第i個可操作分類單元數(shù)包含的序列數(shù);n 1為只含有一條序列的可操作分類單元數(shù)目;n 2為只含有兩條序列的可操作分類單元數(shù)目;N為所有個體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

1.4.4腸道切片制作將保存于Bouin’s固定液中的腸道樣本24h后轉(zhuǎn)入75%酒精中脫水。后委托武漢賽維爾生物科技有限公司制作HE染色切片。使用光學(xué)顯微鏡（Olympuxcx23）觀察，用顯微測微尺測量絨毛高度、寬度和肌層厚度。

1.5數(shù)據(jù)分析

使用SPSS19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One—wayANOVA）。當(dāng)有差異性時，用Duncan’s多重比較，設(shè)置P<0.05為差異顯著。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2結(jié)果

2.1眼斑雙鋸魚腸道消化酶結(jié)果

飼喂復(fù)合益生菌能提升試驗(yàn)魚腸道蛋白酶活性，與對照組相比，L3組蛋白酶活性達(dá)到最高（P<0.05）。飼料中復(fù)合益生菌的補(bǔ)充能降低試驗(yàn)魚腸道淀粉酶活性，與對照組相比，L3組試驗(yàn)魚腸道淀粉酶活性顯著下降（P<0.05）。隨著飼料中益生菌添加量的增加，試驗(yàn)魚腸道脂肪酶活性開始下降。見表2。

2.2飼喂復(fù)合益生菌對眼斑雙鋸魚腸道菌群影響

2.2.1飼料中添加不同濃度益生菌對眼斑雙鋸魚腸道微生物多樣性分析根據(jù)稀釋曲線（圖1）可以看到，逐漸趨于平緩，表明數(shù)據(jù)樣本夠大，測試深度足夠大，測量結(jié)果合理可信。

L3、L6組的香農(nóng)指數(shù)、豐富度指數(shù)比對照組高。各組覆蓋深度接近1，說明測序深度足夠，基本可以覆蓋所有樣品中所有的物種，數(shù)據(jù)可信。見表3。

2.2.2飼料中添加不同濃度益生菌對眼斑雙鋸魚腸道菌群在門水平上的組成差異由眼斑雙鋸魚腸道微生物物種在門水平分布上柱狀圖（圖2）可知，各組試驗(yàn)魚腸道優(yōu)勢菌群主要以變形菌門、擬桿菌門為主。隨著飼料中復(fù)合益生菌添加量的增加，試驗(yàn)魚腸道中變形菌門相對豐度開始增多，擬桿菌門相對豐度降低。L3組試驗(yàn)魚腸道厚壁菌門相對豐度相比對照組增多;擬桿菌門相對豐度在L6組試驗(yàn)魚腸道降至最低，同時放線菌門相對豐度增加。2.3飼料中添加不同濃度復(fù)合益生菌對眼斑雙鋸魚腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

各組試驗(yàn)魚腸道肌層厚度低于對照組，L6組試驗(yàn)魚腸道肌層厚度與對照組相比顯著下降（P<0.05）;隨著飼料中益生菌添加量的增加，L3組試驗(yàn)魚腸道絨毛高度與對照組相比顯著上升（P<0.05），相反的是，L6組試驗(yàn)魚腸道絨毛高度顯著下降（P<0.05）;飼料中添加益生菌對試驗(yàn)魚腸道絨毛寬度沒有顯著影響（P>0.05）。見表4。各組腸道切片見圖3。

3討論

3.1眼斑雙鋸魚腸道消化酶結(jié)果

魚類消化酶又容易被周圍環(huán)境影響而發(fā)生改變。在本試驗(yàn)中，飼喂復(fù)合益生菌能提升試驗(yàn)魚腸道蛋白酶的活性，這與重口裂腹魚[6]、鯉魚[7]中的研究結(jié)果類似。

通常認(rèn)為，益生菌可以通過分泌胞外酶產(chǎn)物，促使腸道分泌更多的消化酶。在有關(guān)復(fù)合益生菌對大菱鲆的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，腸道中的蛋白酶活力主要受腸道中pH值的影響，同時DeSchrijver等[8]認(rèn)為，當(dāng)腸道內(nèi)環(huán)境處于適宜的pH值時，蛋白酶會大量地被分泌，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的消化。因此初步推測本試驗(yàn)中眼斑雙鋸魚腸道蛋白酶活性的提高是因?yàn)閺?fù)合益生菌可以通過在腸道定植來改變腸道內(nèi)環(huán)境pH值，同時促進(jìn)蛋白酶分泌。

然而，隨著飼料中益生菌添加量的增加，腸道淀粉酶活性、脂肪酶開始下降，這與何偉聰?shù)萚4]、江永明等[9]的試驗(yàn)結(jié)果類似。也有部分研究表明，飼料中添加益生菌能夠增加暗紋東方鲀幼魚[10]、凡納濱對蝦[11]腸道淀粉酶的活性。由于眼斑雙鋸魚是偏肉食性魚類，這可能解釋了其腸道淀粉酶活力偏低的現(xiàn)象[10]。此外，脂肪酶活性的下降，推測是因?yàn)轱暳现械膹?fù)合益生菌可以促進(jìn)腸道中乳酸桿菌的增殖。據(jù)報(bào)道，乳酸桿菌的增殖可以相應(yīng)地降低脂肪酶的活性[12]。

3.2眼斑雙鋸魚腸道菌群結(jié)果分析

在本試驗(yàn)中，通過高通測序法測定各組眼斑雙鋸魚腸道菌群，結(jié)果表明在各組中變形菌門和擬桿菌門都是優(yōu)勢菌種，這與蘇鵬[13]得到的結(jié)果類似。L3組試驗(yàn)魚腸道厚壁菌門豐度相比對照組增多，有研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門與碳水化合物消化酶的分泌有一定關(guān)聯(lián)，因此推測其功能與消化密不可分[14]。芽孢桿菌則是厚壁菌門的常見菌屬，有研究表明，芽孢桿菌可以改善水質(zhì)，降低魚體感染細(xì)菌的概率，因此通?？梢员挥米魉a(chǎn)養(yǎng)殖益生菌補(bǔ)充到水生動物體內(nèi)[15]。這一結(jié)果從側(cè)面證實(shí)本試驗(yàn)中添加的枯草芽孢桿菌成分已經(jīng)在眼斑雙鋸魚腸道中定植。

3.3眼斑雙鋸魚腸道切片分析

在本試驗(yàn)中，各組試驗(yàn)魚腸道肌層厚度均低于對照組，肌層厚度下降說明試驗(yàn)魚腸道的完整性在逐漸遭到破壞[16]。隨著飼料中益生菌含量的增加，試驗(yàn)魚腸道絨毛高度與絨毛寬度都是先增加后減少，這與邱燕等[17]試驗(yàn)結(jié)果類似，表明該復(fù)合益生菌可以對試驗(yàn)魚腸道產(chǎn)生一定的促進(jìn)生長作用。試驗(yàn)魚腸道絨毛高度與寬度增加時，能加大絨毛與腸道中食物的接觸面積，改善試驗(yàn)魚腸道的消化功能。已有研究表明，益生菌能定植在生物的腸道中，通過對細(xì)胞免疫和體液免疫的調(diào)控，改善腸道黏膜屏障的完整性，同時益生菌還可以與腸道中的微生物群達(dá)到共生的關(guān)系[18]，因此推測益生菌可以促進(jìn)絨毛高度和寬度的增加。

4結(jié)論

在眼斑雙鋸魚飼料中添加3%復(fù)合益生菌可以有效改善其腸道消化酶活性，提高腸道厚壁菌門相對豐度，增加腸道絨毛高度與寬度。

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Effectofcompoundprobioticsondigestiveenzymes，microflorastructureandmorphologyofAmphiprionocellaris

WANGLei1，WULin1，ZENGFanshuang1，RENXue1，CUIShuchang1，LIMuzi1，RENTongjun1，2

（1.CollegeofFisheriesandLifeScience，DalianOceanUniversity，Dalian116023，China;2.KeyLaboratoryofAppliedBiologyandAquacultureofNorthernFishesinLiaoningProvince，DalianOceanUniversity，Dalian116023，China）

Abstract：Inordertoinvestigatetheeffectsofcompoundprobioticsaddedindietondigestiveenzymes，florastructureandmorphologyofintestinaltractofAmphiprionocellaris，135fishwithaninitialweightof（0.79±0.01）gwererandomlydividedinto3groupswith3replicatesineachgroup.Thecompoundprobioticswereaddedindietofthefishatdifferentlevels，i.e.，0%（controlgroup），3%（groupL3）and6%（groupL6）respectivelyfora28-dayexperiment.Theresultsshowedthatcompoundprobioticscouldimprovetheactivityofintestinalproteaseinthefish，amongwhichtheintestinalproteaseingroupL3wassignificantlyincreased（P<0.05）.Theamylaseactivitywasreducedsignificantlyinintestinaltractofthefish（P<0.05）;Thelipaseactivitywasreducedtoo（P>0.05）.Withtheincreaseofprobioticsindiet，theabundanceofProteobacteriainintestines

ofthefishincreased，whilethatofBacteroidetesdecreased.Increasedsupplementofprobioticsindietsignificantlyreducedthethicknessofintestinalmusclelayerandincreasedtheheightofintestinalvillusofthefish（P<0.05）.Tosumup，theadditionof3%compoundprobioticsindietimprovedthedigestiveenzymeactivity，increasedthediversityofintestinalmicrobialcommunity，andimprovedthemorphologyandfunctionofintestineofthefish.

Keywords：Amphiprionocellaris;probiotics;digestion;nutritionalmetabolism

（收稿日期：2021-08-19）