魚(yú)糜冷凍穩(wěn)定劑的種類及作用機(jī)理

朱士臣，俞杰航，相興偉，顧賽麒，柯志剛，丁玉庭，周緒霞*

（1 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 杭州 310014 2 浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310014 3 國(guó)家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（杭州） 杭州 310014 4 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 大連工業(yè)大學(xué) 遼寧大連 116034）

魚(yú)糜制品因營(yíng)養(yǎng)豐富、口感鮮嫩等特點(diǎn)而深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。低溫冷凍貯藏作為冷凍魚(yú)糜品質(zhì)保持的重要手段之一，能夠抑制魚(yú)糜制品中微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。然而，魚(yú)糜在冷凍過(guò)程中會(huì)形成較大冰晶，其力學(xué)效應(yīng)會(huì)破壞組織細(xì)胞，嚴(yán)重影響魚(yú)糜質(zhì)構(gòu)特性，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分損失，持水性下降，以及加工特性降低等一系列不良后果。

近年來(lái)，關(guān)于冷凍魚(yú)糜制品品質(zhì)控制的研究主要集中于：以抑制冰晶生長(zhǎng)為靶向的抗凍劑的研發(fā)。冰晶的形成是魚(yú)糜冷凍過(guò)程中最直接、最顯著的物理變化，是導(dǎo)致冷凍魚(yú)糜品質(zhì)劣化的“元兇”。冰晶的力學(xué)效應(yīng)會(huì)破壞肌肉組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致反應(yīng)因子外泄，從而使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等魚(yú)糜主要組分發(fā)生一系列生化反應(yīng)，進(jìn)而影響冷凍魚(yú)糜的質(zhì)地特征、感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前，僅以抑制冰晶形成為作用靶點(diǎn)的抗凍劑因安全及成本的局限性，而使其應(yīng)用受到限制。例如：傳統(tǒng)抗凍劑蔗糖等糖類，因高熱量、高甜度而導(dǎo)致肥胖和齲齒等健康問(wèn)題，且不適于糖尿病患者食用；多聚磷酸鹽的攝入亦存在加重高血壓或慢性腎病等的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。抗凍蛋白和抗凍多肽因優(yōu)異的抗凍特性而受到人們的青睞，然而其高昂的生產(chǎn)成本，苛刻的制備條件，使其難以規(guī)?；瘧?yīng)用于魚(yú)糜加工業(yè)，因此有必要對(duì)現(xiàn)有冷凍保護(hù)策略做補(bǔ)充和拓展，以最大程度地增強(qiáng)魚(yú)糜的冷凍品質(zhì)。

鑒于上述抗凍劑的局限性，僅通過(guò)抑制冰晶形成或許無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)魚(yú)糜的冷凍保護(hù)。通過(guò)添加冷凍穩(wěn)定劑（多糖、親水性膠體、抗氧化物質(zhì)等）進(jìn)一步增強(qiáng)魚(yú)糜組分的凍融穩(wěn)定性，或可作為抗凍手段的重要補(bǔ)充，從而最大程度實(shí)現(xiàn)魚(yú)糜的冷凍保護(hù)。與抗凍劑的作用對(duì)象不同（控制冰晶形成），冷凍穩(wěn)定劑是基于自身結(jié)構(gòu)的化學(xué)可反應(yīng)性，通過(guò)與關(guān)鍵魚(yú)糜組分（蛋白質(zhì)和脂肪）的相互作用，以增強(qiáng)魚(yú)糜的冷凍保護(hù)能力（圖1）[3-4]。目前已有大量文獻(xiàn)總結(jié)了冰晶的形成機(jī)理和幾種抗凍劑的冷凍保護(hù)機(jī)制[5-7]，然而對(duì)于以穩(wěn)定魚(yú)糜組分為作用靶向的冷凍穩(wěn)定劑及其穩(wěn)定機(jī)制尚無(wú)系統(tǒng)的總結(jié)。本文重點(diǎn)闡述幾類冷凍穩(wěn)定劑（糖類、蛋白水解物類、膠體類和多酚類等）的穩(wěn)定機(jī)理，并總結(jié)冷凍魚(yú)糜冷凍期間發(fā)生的品質(zhì)劣化規(guī)律，對(duì)于進(jìn)一步增強(qiáng)魚(yú)糜的冷凍貯藏品質(zhì)以及開(kāi)發(fā)高品質(zhì)魚(yú)糜制品具有重要意義。

圖1 冷凍魚(yú)糜低溫保護(hù)策略示意圖Fig.1 Schematic diagram of cryoprotective strategy for frozen surimi

1 魚(yú)糜凍藏期間品質(zhì)變化規(guī)律

在魚(yú)糜的制備過(guò)程中，通過(guò)漂洗可除去部分脂肪、水溶性蛋白質(zhì)、色素以及一些內(nèi)源性蛋白酶[8]，在一定程度上延緩了魚(yú)糜貯藏過(guò)程中的品質(zhì)劣變。然而漂洗后的魚(yú)糜還保留了一定量的脂質(zhì)、內(nèi)源性蛋白酶等[9-10]，在冰晶力學(xué)效應(yīng)作用下，蛋白酶、促氧化輔助因子從受損組織泄出，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和脂肪氧化等不良反應(yīng)（表1）。此外魚(yú)糜中豐富的蛋白質(zhì)也容易在冷凍條件下發(fā)生氧化、聚集和變性等生化反應(yīng)。魚(yú)糜組分在冷凍過(guò)程中的上述反應(yīng)，進(jìn)一步影響魚(yú)糜的色澤、凝膠性、質(zhì)構(gòu)特性、持水性以及營(yíng)養(yǎng)特性。

1.1 色澤變化

色澤是衡量魚(yú)糜品質(zhì)的重要指標(biāo)，色澤不僅影響人們食用魚(yú)糜制品的感官體驗(yàn)，還可反映魚(yú)糜制品品質(zhì)的劣化程度。高鐵肌紅蛋白和脫氧肌紅蛋白是魚(yú)類肌肉中紅色色素的主要成分，而魚(yú)糜在凍藏期間的色澤變化主要是由于肌紅蛋白氧化形成高鐵肌紅蛋白[11]，這與魚(yú)糜凍藏的脂質(zhì)氧化密切相關(guān)。已有研究表明，脂質(zhì)氧化的次生產(chǎn)物己烯醛和4-羥基壬烯醛（4-HNE）等醛類物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)中的親核氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)作用結(jié)合，從而促進(jìn)氧合肌紅蛋白氧化形成高鐵肌紅蛋白[12]。一般而言，隨著魚(yú)糜凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)糜的白度值下降。陳康[13]研究發(fā)現(xiàn)，在30 d 冷凍貯藏過(guò)程中，復(fù)合魚(yú)糜制品的L*值（亮度值）和白度值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能由于在貯藏過(guò)程中部分微生物生長(zhǎng)分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物在魚(yú)糜中堆積，從而影響魚(yú)糜色澤；另一方面，可能是由于冷凍過(guò)程中的油脂腐敗加速了魚(yú)糜色澤的變化。

1.2 凝膠特性變化

冷凍過(guò)程中肌原纖維蛋白變性，其構(gòu)象發(fā)生不可逆改變，導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變，將直接影響魚(yú)糜的凝膠能力。Benjakul 等[14]研究了冷凍對(duì)魚(yú)糜凝膠特性的影響，在冷藏過(guò)程中蜥蜴魚(yú)魚(yú)糜的破斷力和凹陷深度均顯著下降，-18 ℃下冷藏1 周后破斷力和凹陷深度較新鮮樣本分別下降43.8%和71.8%。冷凍過(guò)程中魚(yú)糜凝膠特性的下降是多種因素共同作用的結(jié)果[14-15]：一方面由于冷凍過(guò)程中組織結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致TMAOase 被釋放到肌肉組織中，通過(guò)氧化三甲胺（Trimetlylamine oxide，TMAO）生成甲醛，破壞肌球蛋白的完整性，從而導(dǎo)致魚(yú)糜蛋白凝膠能力降低；另一方面，冷凍貯藏過(guò)程中發(fā)生的脂質(zhì)氧化等生化反應(yīng)也會(huì)對(duì)魚(yú)糜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能造成不利影響；此外，魚(yú)糜凝膠特性的減弱除了與肌球蛋白變性有關(guān)以外，魚(yú)糜中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TGase）活性降低也是使得魚(yú)糜凝膠能力下降的因素之一。

1.3 質(zhì)構(gòu)特性變化

魚(yú)糜的質(zhì)構(gòu)特性是反映魚(yú)糜品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一。凍藏過(guò)程中魚(yú)糜凝膠的硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性都呈現(xiàn)先增強(qiáng)后下降的趨勢(shì)。凍藏初期魚(yú)糜質(zhì)構(gòu)增強(qiáng)是由于凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，以及脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的羥基自由基促進(jìn)巰基氧化，導(dǎo)致二硫鍵增多，表面疏水性增強(qiáng)，從而加強(qiáng)了魚(yú)糜蛋白的相互交聯(lián)；然而隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白的氧化過(guò)度交聯(lián)會(huì)阻礙反應(yīng)性官能團(tuán)的有序作用，使蛋白質(zhì)基質(zhì)中的氫鍵相互作用減弱，最終降低了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水之間的相互作用，導(dǎo)致魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性降低[16]。此外，冷凍期間魚(yú)糜的內(nèi)源性蛋白酶和由微生物產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)結(jié)締組織蛋白的水解作用也可能是魚(yú)糜質(zhì)構(gòu)特性降低的另一原因[17]。

1.4 持水性變化

持水性特是衡量魚(yú)糜品質(zhì)的重要指標(biāo)，可以反映魚(yú)糜蛋白的變性程度。任麗娜[18]研究了-18℃和-50 ℃下白鰱魚(yú)魚(yú)糜持水性的變化，結(jié)果顯示，隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)糜持水性持續(xù)下降，且-18 ℃下貯藏12 周的魚(yú)糜持水性下降超過(guò)20%，滴水損失超過(guò)10%，顯著低于-50 ℃貯藏的魚(yú)糜。研究表明，凍藏過(guò)程中魚(yú)糜持水性的下降和滴水損失的增加與蛋白質(zhì)變性密切相關(guān)。凍藏期間冰晶的形成破壞了細(xì)胞，造成水分流失，一方面會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氫鍵遭到破壞，蛋白質(zhì)親水區(qū)域和疏水區(qū)域暴露，并與相鄰蛋白區(qū)域相互作用致使蛋白質(zhì)聚集變性，另一方面脫水導(dǎo)致體系離子強(qiáng)度增大，同樣誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集變性[19]。魚(yú)糜蛋白質(zhì)的聚集變性導(dǎo)致其功能特性降低，持水能力顯著降低。

2 冷凍魚(yú)糜品質(zhì)劣化機(jī)制

凍藏期間魚(yú)糜品質(zhì)變化與自身組分（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和水分）的各種生化反應(yīng)密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外對(duì)凍藏魚(yú)糜品質(zhì)劣化機(jī)制進(jìn)行了大量研究 （表1），主要包括冰晶的機(jī)械效應(yīng)、酶的激活、脂質(zhì)氧化以及蛋白質(zhì)冷凍變性。

表1 魚(yú)糜凍藏期間品質(zhì)變化規(guī)律及其發(fā)生機(jī)制Table 1 Quality changes and the corresponding mechanisms of surimi during frozen storage

2.1 內(nèi)源性酶激活

氧化三甲胺脫甲基酶（Trimethylamine-N-oxidedemethylase，TMAOase），是一種存在于海產(chǎn)品肌肉和內(nèi)臟組織中的內(nèi)源酶，該酶可以催化氧化三甲胺（Trimetlylamine oxide，TMAO）還原產(chǎn)生二甲胺（Dimethylamine，DMA）和甲醛（Formaldehyde，F(xiàn)A）。Huidobro 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，凍藏后的魚(yú)糜蛋白中形成穩(wěn)定的非二硫共價(jià)鍵，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)程度。甲醛被認(rèn)為是誘導(dǎo)魚(yú)糜蛋白質(zhì)交聯(lián)的主要物質(zhì)之一。這可能是由于在魚(yú)糜凍藏過(guò)程中，冰晶的形成破壞了細(xì)胞組織，TMAOase 進(jìn)入肌肉組織催化TMAO 形成DMA 和FA，促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)變性，導(dǎo)致魚(yú)糜蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，從而影響魚(yú)糜的品質(zhì)[19]。TMAOase 對(duì)冷凍魚(yú)糜品質(zhì)的影響與魚(yú)的種類及加工過(guò)程密切相關(guān)。TMAOase 通常存在于鱈科類魚(yú)類中，而在非鱈科魚(yú)類（鯡魚(yú)、鲉魚(yú)、鯖魚(yú)等）的組織中TMAOase 活性很低或幾乎沒(méi)有，且TMAOase 通常在魚(yú)類內(nèi)臟組織中活性較高，肌肉組織中活性較低[25]。

魚(yú)肉中除了氧化三甲胺脫甲基酶外，還存在多種內(nèi)源性酶，一定程度上影響魚(yú)糜的凝膠品質(zhì)。例如，TGase 作為一種內(nèi)源性酶，通過(guò)催化蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酰胺基的轉(zhuǎn)移酶，可以催化魚(yú)糜賴氨酸殘基上的ε-?；纬傻鞍踪|(zhì)分子間的ε-（γ-谷氨酰胺）-賴氨酸交聯(lián)，從而增強(qiáng)魚(yú)糜的凝膠品質(zhì)[26]。TGase 對(duì)魚(yú)糜凝膠的增強(qiáng)效應(yīng)在冷凍貯藏初期尤為明顯。這可能由于魚(yú)糜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，使魚(yú)糜中游離氨基酸含量增加，在TGase 作用下促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，增強(qiáng)了魚(yú)糜質(zhì)構(gòu)特性[27]。然而長(zhǎng)期冷凍會(huì)破壞TGase 構(gòu)象，使TGase 活性下降甚至喪失，從而導(dǎo)致魚(yú)糜品質(zhì)劣化。

此外，魚(yú)肉組織中還存在多種以組織蛋白酶為主的內(nèi)源性蛋白水解酶。其中絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶可能是導(dǎo)致肌原纖維蛋白降解的主要內(nèi)源性酶。魚(yú)糜在凍藏期間肌肉組織內(nèi)的絲氨酸蛋白酶外泄，水解肌原纖維蛋白，會(huì)造成魚(yú)糜品質(zhì)不可逆劣變[21]。魚(yú)糜的漂洗加工可以去除組織蛋白酶B 和H，然而無(wú)法去除具有較高活性的組織蛋白酶L。組織蛋白酶L 能催化水解魚(yú)糜肌球蛋白[28]，造成魚(yú)糜品質(zhì)劣變。低溫貯藏對(duì)組織蛋白酶的活性影響很小，在-20 ℃下冷藏8 周仍保留了77%的活性[29]。目前，魚(yú)糜中添加特定內(nèi)源酶抑制劑（半胱氨酸酶抑制劑、絲氨酸酶抑制劑等）是解決內(nèi)源性蛋白水解酶作用的有效手段。

2.2 脂質(zhì)氧化

脂質(zhì)氧化是導(dǎo)致水產(chǎn)品凍藏期間發(fā)生變質(zhì)腐敗的重要因素，不僅對(duì)產(chǎn)品色澤產(chǎn)生不利影響，還是導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)生異味和腐臭味的主要因素[30]。魚(yú)糜在冷凍貯藏期間通過(guò)脂質(zhì)氧化反應(yīng)可產(chǎn)生自由基以及醛、酮等次級(jí)代謝產(chǎn)物，是導(dǎo)致魚(yú)糜凍藏期間品質(zhì)劣變的關(guān)鍵因素之一。一方面，脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物直接危害魚(yú)糜品質(zhì)；另一方面，脂肪氧化產(chǎn)生的羥基自由基和過(guò)氧自由基將肌原纖維蛋白中的巰基氧化形成二硫鍵[20]。在氧存在的情況下，自由基與蛋白質(zhì)和肽的反應(yīng)會(huì)引起肽鏈主鏈和氨基酸側(cè)鏈發(fā)生構(gòu)象改變，如圖2所示，蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)衍生物的形成、氨基酸側(cè)鏈的改性以及肽鍵斷裂等。氧化反應(yīng)帶來(lái)的蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化進(jìn)一步導(dǎo)致魚(yú)糜品質(zhì)發(fā)生劣化，造成冷凍魚(yú)糜凝膠特性和持水性下降，色澤變差，必需氨基酸損失以及蛋白質(zhì)消化率降低[31-32]。

圖2 脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化Fig.2 Conformational changes of protein induced by lipid oxidation

2.3 蛋白質(zhì)冷凍變性

魚(yú)肉蛋白凍藏過(guò)程中的品質(zhì)劣變與魚(yú)糜肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)演變密切相關(guān)。通過(guò)拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，凍藏期間魚(yú)糜蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量升高，主鏈構(gòu)象由有序發(fā)展為無(wú)序，導(dǎo)致魚(yú)糜鹽溶性蛋白含量下降，巰基氧化形成二硫鍵，Ca2+-ATPase 活力下降，以及芳香族氨基酸殘基暴露導(dǎo)致疏水相互作用增強(qiáng)，造成魚(yú)糜品質(zhì)劣變[23]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)魚(yú)肉蛋白冷凍變性機(jī)理進(jìn)行了大量研究，并取得了一定成果。目前人們廣泛接受的蛋白質(zhì)冷凍變性模型主要包括以下兩種：一是蛋白質(zhì)分子的聚集，二是蛋白質(zhì)多肽鏈的展開(kāi)[22]。圖3為凍藏過(guò)程中魚(yú)糜蛋白質(zhì)聚集變性模型。蛋白質(zhì)聚集變性主要是具有α-螺旋結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（如肌球蛋白）的變性模型。該模型指出，隨著凍藏溫度的降低，溫度較低部位的水分形成冰晶，未凍結(jié)部分的水分子開(kāi)始向冰晶形成區(qū)域遷移，冰晶生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致結(jié)合水脫離蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，使蛋白質(zhì)表面的功能基團(tuán)相互暴露，并通過(guò)氫鍵、離子鍵、疏水鍵和二硫鍵等相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集變性[22]。

圖3 凍藏過(guò)程中魚(yú)肉蛋白質(zhì)（聚集）變性模型[22]Fig.3 Denaturation （aggregation） model of fish protein in frozen storage[22]

圖4為凍藏過(guò)程中魚(yú)糜蛋白質(zhì)展開(kāi)變性模型。蛋白質(zhì)多肽鏈的展開(kāi)變性主要是具有非螺旋結(jié)構(gòu)或球形結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) （如肌動(dòng)蛋白） 的變性模型。未凍結(jié)時(shí)，蛋白質(zhì)以高度水化的折疊蛋白狀態(tài)存在，此時(shí)多肽鏈上的非極性基團(tuán)位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。且蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性基團(tuán)相互作用形成化學(xué)鍵進(jìn)一步穩(wěn)定了這種狀態(tài)。隨著凍藏過(guò)程進(jìn)行，冰晶形成和生長(zhǎng)使蛋白質(zhì)水化程度降低，導(dǎo)致多肽鏈展開(kāi)，蛋白質(zhì)分子以開(kāi)鏈狀態(tài)存在，同時(shí)引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)發(fā)生變化[22]。

圖4 凍藏過(guò)程中魚(yú)肉蛋白質(zhì)（展開(kāi)）變性模型[22]Fig.4 Denaturation （unfolding） model of fish protein in frozen storage[22]

3 冷凍穩(wěn)定劑

鑒于現(xiàn)有抗凍劑（蔗糖、山梨醇、磷酸鹽、抗凍蛋白和抗凍肽）的安全性、有效性及經(jīng)濟(jì)性，單純通過(guò)抗凍劑抑制冰晶形成，或許無(wú)法較大程度提高魚(yú)糜的凍藏品質(zhì)。從穩(wěn)定冷凍魚(yú)糜組分的角度出發(fā)，通過(guò)添加不同種類的冷凍穩(wěn)定劑以增強(qiáng)魚(yú)糜組分的凍藏穩(wěn)定性，或許可作為魚(yú)糜冷凍保護(hù)策略的重要補(bǔ)充，從而最大程度上提高魚(yú)糜及其制品的冷凍品質(zhì)[33-35]。

與抗凍劑的作用對(duì)象不同（控制冰晶形成），冷凍穩(wěn)定劑通過(guò)抑制食品組分冷凍過(guò)程中的各種生化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)冷凍保護(hù)的目的。冷凍穩(wěn)定劑種類繁多，根據(jù)化學(xué)性質(zhì)的不同，冷凍穩(wěn)定劑大致分為以下幾類：糖類冷凍穩(wěn)定劑、蛋白水解物類冷凍穩(wěn)定劑、膠體類冷凍穩(wěn)定劑以及多酚類冷凍穩(wěn)定劑。不同的冷凍穩(wěn)定劑對(duì)魚(yú)糜冷凍貯藏品質(zhì)的控制效果也有所差別，這取決于其不同的結(jié)構(gòu)組成。一般而言，具有冷凍穩(wěn)定效果的化學(xué)物通常具備以下特征：（1）相對(duì)較小的分子質(zhì)量；（2）具有豐富的化學(xué)反應(yīng)基因，分子中須含有一個(gè)必須基團(tuán)和一個(gè)及以上的輔助基團(tuán)，且兩種基團(tuán)空間分布合理[18]。

表2 冷凍穩(wěn)定劑種類和作用機(jī)制Table 2 Classification of frozen stabilizers and acting mechanism

3.1 糖類

糖類分子可以增大水分子表面張力，將部分自由水轉(zhuǎn)化為結(jié)合水，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水化程度增強(qiáng)，抑制了蛋白質(zhì)的聚集變性[49]。已有大量研究證實(shí)幾種多糖（大豆多糖、殼聚糖和魔芋寡糖甘露聚糖等）能有效增強(qiáng)魚(yú)糜組分的凍藏穩(wěn)定性[34，38]。大豆多糖的添加可以有效抑制凍藏期間魚(yú)糜蛋白質(zhì)溶解度的下降，防止巰基含量的減少以及Ca2+-ATPase活性降低，從而可以抑制魚(yú)糜蛋白冷凍變性[34]。殼聚糖也是一種優(yōu)良的魚(yú)糜冷凍保護(hù)劑，其可通過(guò)多重效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)魚(yú)糜的冷凍保護(hù)：（1）螯合效應(yīng)：殼聚糖通過(guò)與某些促氧化的金屬離子反應(yīng)形成絡(luò)合物[50]，降低凍藏期間魚(yú)糜品質(zhì)劣化；（2）抑菌效應(yīng)：殼聚糖通過(guò)抑制魚(yú)糜中的腐敗細(xì)菌來(lái)延緩魚(yú)糜蛋白降解并保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；（3）凝膠效應(yīng)：殼聚糖還可以通過(guò)增強(qiáng)魚(yú)糜的凝膠特性來(lái)減輕冷凍對(duì)魚(yú)糜品質(zhì)劣化的影響[51]。魔芋寡糖甘露聚糖具有豐富的親水基團(tuán)及少量的支鏈，添加魔芋寡糖甘露聚糖還可以保護(hù)肌原纖維蛋白的完整性，抑制凍藏期間魚(yú)糜蛋白變性。此外，魔芋寡糖甘露聚糖還具有很強(qiáng)的抗氧化活性，顯著降低凍藏期間脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，可以作為冷凍魚(yú)糜的低溫冷凍保護(hù)劑[38]。寡糖在增強(qiáng)肌原纖維蛋白凍藏穩(wěn)定性方面也具有出色的表現(xiàn)，一方面卡拉膠寡糖可以通過(guò)氫鍵作用與蛋白質(zhì)帶電荷氨基酸的極性殘基結(jié)合，增強(qiáng)凍藏期間蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，另一方面寡糖具有較強(qiáng)的自由基清除活性，因此卡拉膠寡糖同時(shí)具備穩(wěn)定蛋白質(zhì)和抗氧化的雙重作用，是高效魚(yú)糜冷凍穩(wěn)定劑的選擇之一[40]。

3.2 蛋白水解肽類

蛋白水解多肽的肽段序列中含有大量親水性氨基酸，如脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸等。這些親水性氨基酸具有高效的結(jié)合水分子能力，通過(guò)與肌原纖維蛋白水合水分子間的相互作用，使魚(yú)糜蛋白質(zhì)周圍凍結(jié)水含量下降，起到維持肌原纖維蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的作用[41，52]。

蛋白水解多肽的氨基酸組成和分子質(zhì)量大小等均會(huì)影響其冷凍保護(hù)特性。研究發(fā)現(xiàn)，多肽中的丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸和芳香族氨基酸可以作為質(zhì)子供體淬滅自由基，抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生，且分子質(zhì)量較低的多肽具有更強(qiáng)的淬滅自由基的能力，而蛋白水解肽中的親水性氨基酸則起到約束水分子穩(wěn)定魚(yú)糜蛋白構(gòu)象的作用[53]。Nikoo 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，鱘魚(yú)皮明膠酶水解物中含有豐富的疏水性氨基酸（如甘氨酸、脯氨酸等），大量的疏水性氨基酸使其具備較強(qiáng)的淬滅自由基的活性，增強(qiáng)冷凍魚(yú)糜的抗氧化能力。此外，明膠水解物還具有約束水分子在魚(yú)糜內(nèi)部遷移的作用，穩(wěn)定凍藏期間魚(yú)糜蛋白結(jié)構(gòu)。Korzeniowska 等[54]利用風(fēng)味蛋白酶酶解太平洋鱈魚(yú)得到魚(yú)蛋白水解物，發(fā)現(xiàn)魚(yú)蛋白水解物可通過(guò)與魚(yú)肉蛋白質(zhì)相互作用，形成具有低溫保護(hù)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，抑制凍藏期間蛋白質(zhì)冷凍變性，防止魚(yú)糜在凍藏期間品質(zhì)劣變。絲膠蛋白酶解肽含有豐富的極性氨基酸，特別是絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）等含羥基側(cè)鏈的氨基酸，研究表明，絲膠蛋白酶解肽的添加可以有效抑制巰基的氧化，延緩埋藏在蛋白質(zhì)表面的疏水性殘基的暴露和魚(yú)糜肌球蛋白重鏈的降解，從而延緩凍藏期間魚(yú)糜品質(zhì)的劣化[43]。

3.3 膠體類

親水性膠體具有諸多功能特性，如膠凝特性、乳化特性、增稠特性以及抗凍特性等。膠體對(duì)魚(yú)糜的冷凍穩(wěn)定作用主要依賴于其黏度效應(yīng)和凝膠效應(yīng)。膠體結(jié)構(gòu)中的某些活性基團(tuán)可通過(guò)物理或化學(xué)交聯(lián)方式提高蛋白質(zhì)的凍藏穩(wěn)定性；此外，也有研究表明，膠體還可提高體系的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg），使體系處于玻璃態(tài)，提高了魚(yú)糜組分的凍藏穩(wěn)定性[55]。

一般而言，具有低溫保護(hù)功能的親水性膠體主要可以分為兩大類[55]：一是瓊脂、卡拉膠、海藻酸和阿拉伯樹(shù)膠等多糖類親水膠體；二是明膠、乳清蛋白等蛋白類親水膠體。Akkose 等[56]研究了阿拉伯樹(shù)膠對(duì)在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）下貯藏的牛肉的低溫保護(hù)作用，阿拉伯樹(shù)膠可以通過(guò)形成凝膠結(jié)構(gòu)來(lái)抑制組織細(xì)胞間水分子的遷移，減小了凍藏期間牛肉組織的破壞，抑制了凍藏期間的脂肪與氧氣的接觸以及疏水性氨基酸的暴露，從而穩(wěn)定了肉類組織中的成分，延緩其在冷凍條件下的品質(zhì)劣化。Carvajal 等[44]研究了不同分子質(zhì)量的麥芽糊精在抑制魚(yú)肉蛋白質(zhì)變性中的作用，結(jié)果表明，高分子質(zhì)量的麥芽糊精通過(guò)固定水分子和提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，從而增強(qiáng)了魚(yú)肉蛋白質(zhì)在低溫下的構(gòu)象穩(wěn)定性，而低分子質(zhì)量的麥芽糊精則是通過(guò)溶質(zhì)排斥機(jī)制，即蛋白質(zhì)-溶質(zhì)相互作用，作為溶質(zhì)被排除在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之外，導(dǎo)致體系自由能增加，從而穩(wěn)定了蛋白質(zhì)構(gòu)象，實(shí)現(xiàn)冰凍狀態(tài)下蛋白的穩(wěn)定性[39]。

某些蛋白類親水膠體也具有一定的低溫保護(hù)作用，其作為親水膠體發(fā)揮低溫保護(hù)作用主要?dú)w因于兩方面[55，57]：一是作為增稠劑和膠凝劑，穩(wěn)定魚(yú)糜內(nèi)部的游離水、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等組分；二是其含有豐富的親水性氨基酸，可以很好地穩(wěn)定與蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子，為魚(yú)糜蛋白提供一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，阻礙蛋白質(zhì)發(fā)生聚集變性。乳清蛋白可通過(guò)較強(qiáng)的自由基清除活性，有效抑制凍藏期間魚(yú)糜的蛋白質(zhì)氧化[58]。畢海丹等[45]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的添加能夠減緩魚(yú)糜脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)變性，乳清蛋白分散在魚(yú)糜中與肌原纖維蛋白相結(jié)合，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在一定程度上阻斷了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而增強(qiáng)了冷凍魚(yú)糜的持水能力，減弱了魚(yú)糜質(zhì)地劣化程度。

3.4 多酚類

魚(yú)糜凍藏過(guò)程發(fā)生的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化是造成魚(yú)糜品質(zhì)劣變的重要因素。為控制凍藏期間魚(yú)糜的組分氧化，目前主要的方法是添加一些抗氧化物質(zhì)，其中多酚類物質(zhì)研究較為廣泛。多酚類物質(zhì)的抗氧化機(jī)理在于[59]：（1）多酚類物質(zhì)具有螯合金屬離子的能力，可以降低金屬離子對(duì)于凍藏魚(yú)糜品質(zhì)劣化的誘導(dǎo)作用[60]；（2）酚羥基可以作為氫供體，清除自由基能力強(qiáng)，可以有效減緩氧化的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；（3）酚類物質(zhì)可以與魚(yú)糜中的氧化酶通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，抑制酶活性，延緩冷凍魚(yú)糜的氧化反應(yīng)。

袁悅等[59]研究發(fā)現(xiàn)，添加表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）可以減緩凍藏期間羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白的羰基化作用，有效抑制魚(yú)糜在凍藏期間發(fā)生的蛋白質(zhì)氧化和降解。EGCG 較強(qiáng)的自由基清除能力和螯合金屬離子能力是其抑制魚(yú)糜蛋白氧化的主要因素。而EGCG 含有的豐富羥基通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)作用結(jié)合魚(yú)糜蛋白中的疏水基團(tuán)，或許是其抑制蛋白質(zhì)降解的作用途徑。α-生育酚作為抗氧化劑通過(guò)從羥基中提供一個(gè)氫原子來(lái)減少自由基，抑制凍藏期間氧化誘導(dǎo)的魚(yú)糜蛋白變性。Tang 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，添加α-生育酚降低了魚(yú)糜羰基含量，減緩巰基下降程度。此外，褐藻多酚也可以有效抑制凍藏過(guò)程魚(yú)糜的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化，且其抗脂質(zhì)氧化能力比α-生育酚強(qiáng)，而α-生育酚在抗蛋白質(zhì)氧化方面的效果更好。二者在抗脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化方面的差異主要源于褐藻多酚具有強(qiáng)大的獨(dú)立清除自由基的能力，從而能更有效的控制凍藏過(guò)程魚(yú)糜的脂質(zhì)氧化[47]。

3.5 其它

凍藏期間蛋白酶水解導(dǎo)致的魚(yú)糜蛋白質(zhì)降解是造成魚(yú)糜品質(zhì)劣變的重要因素之一。然而關(guān)于蛋白酶抑制劑對(duì)于增強(qiáng)凍藏期間魚(yú)糜品質(zhì)的研究較少，F(xiàn)owler 等[48]研究了鮭魚(yú)血漿對(duì)魚(yú)糜蛋白水解的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)鮭魚(yú)血漿中含有多種半胱氨酸酶抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以有效抑制魚(yú)糜中的內(nèi)源性半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白的降解作用，而此類酶抑制劑在低溫環(huán)境下的有效性有待研究。此外，某些螯合劑（EDTA 等）可以結(jié)合魚(yú)糜中的一些蛋白酶或金屬離子，從而延緩魚(yú)糜蛋白降解速率和氧化速率，減輕凍藏期間內(nèi)源性的酶和金屬離子[60]對(duì)魚(yú)糜品質(zhì)的劣化作用。

4 結(jié)論與展望

現(xiàn)有抗凍劑較高的安全風(fēng)險(xiǎn)及應(yīng)用成本，一定程度上限制了高質(zhì)量魚(yú)糜制品的開(kāi)發(fā)。因此有必要發(fā)展一種新型的冷凍保護(hù)策略，以最大程度實(shí)現(xiàn)魚(yú)糜的冷凍保護(hù)。通過(guò)添加冷凍穩(wěn)定劑以增強(qiáng)食品組分的穩(wěn)定性，或可作為現(xiàn)有冷凍保護(hù)策略（抑制冰晶形成）的重要補(bǔ)充，從而實(shí)現(xiàn)魚(yú)糜及其制品最大程度的冷凍保護(hù)。本文總結(jié)了魚(yú)糜在凍藏期間色澤、質(zhì)構(gòu)、持水性等品質(zhì)特征的變化規(guī)律及其機(jī)理；從增強(qiáng)魚(yú)糜組分冷凍穩(wěn)定性角度出發(fā)，重點(diǎn)闡述了冷凍穩(wěn)定劑的種類及其作用機(jī)制?；诖?，未來(lái)新型冷凍保護(hù)劑的研發(fā)或從以下方面重點(diǎn)著力：（1）開(kāi)發(fā)兼具抗凍和組分穩(wěn)定特性的冷凍保護(hù)劑。如親水性膠體的冰晶生長(zhǎng)抑制效應(yīng)以及豐富的化學(xué)反應(yīng)活性，有望成為具有優(yōu)異冷凍保護(hù)特性的冷凍保護(hù)劑，而材料的選擇及改性或是未來(lái)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一；（2）冰晶抑制手段與冷凍穩(wěn)定劑的耦合協(xié)同。冷凍穩(wěn)定劑通過(guò)與不同冰晶生長(zhǎng)抑制手段結(jié)合應(yīng)用（物理方法如超聲輔助凍結(jié)、液氮快速凍結(jié)和均勻磁場(chǎng)輔助凍結(jié)以及化學(xué)方法如抗凍蛋白等抗凍劑），以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)、多途徑的冷凍保護(hù)。