基于UPLC-QTOF-MS的單增李斯特菌復方新諾明耐藥性菌株代謝組學分析

周繼福，王 娉，郭 佳，3，陳 穎*

（1 中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100176 2 南京財經大學食品科學與工程學院 南京 210023 3 天津科技大學食品科學與工程學院 天津 300457）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種革蘭氏陽性、局部厭氧的短桿菌。菌株感染引起的李斯特菌病嚴重危害著人類健康[1]。輕度感染會導致伴有發(fā)燒、嘔吐和腹瀉的腸胃炎，而重度感染則會導致腦膜炎、敗血癥、腦炎和孕婦流產等嚴重的李斯特菌病[2]。對于李斯特菌病的治療，通常推薦β-內酰胺類抗生素（氨芐西林和青霉素）與氨基糖苷類抗生素單獨或聯合使用[3-4]。然而，疾病治療中部分患者對青霉素的過敏反應會造成休克或死亡[5]，對于青霉素表現過敏的患者，復方新諾明（Trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT）作為常選的替代藥物被使用。此外，復方新諾明在臨床上也是治療中樞神經退行性疾病和腦膜炎最好的口服替代藥物[6-7]。然而，抗生素的過度使用，已造成多種類食品及臨床標本中發(fā)現復方新諾明耐藥株。在1 份臨床和食品分離的李斯特菌耐藥性統(tǒng)計中發(fā)現，菌株對復方新諾明的耐藥率為40.9%，遠超慶大霉素的23.0%和青霉素的11.1%[8]。在魚類及魚加工工廠中分離的單增李斯特菌，對復方新諾明的耐藥率為47.1%[9]。從我國南京即食肉類食品中分離的33 株單增李斯特菌展現出100%的復方新諾明耐藥性[10]。鑒于復方新諾明在臨床上的用藥地位和極高的耐藥率，有必要探究單增李斯特菌復方新諾明相關耐藥性的形成原因。

代謝組學是一種解釋復雜生物系統(tǒng)的綜合性研究方法，主要研究菌株細胞某一時刻所有代謝產物的集合，獲得細胞代謝輪廓并對細胞生物學功能進行闡釋[11-12]。代謝組學技術已在一些病原菌抗生素耐藥性研究中得到應用[13-15]。目前對于單增李斯特菌的耐藥性研究主要集中在植物提取物[16-17]和微生物多肽[18]的抗菌機制方面。Zhao 等[16]利用NMR 研究抗菌多肽和葡萄籽提取物 （Grape seed extract，GSE）對單增李斯特菌的抑菌作用，結果發(fā)現使用前、后，菌株的三羧酸循環(huán)（TCA）、能量代謝和氨基酸生物合成被阻斷，從而展現出抗菌效果，然而尚未見在單增李斯特菌抗生素耐藥性研究中應用的報道。面對日益嚴峻的抗生素耐藥現狀，了解菌株受抗生素作用產生的細胞代謝反應，可為藥物作用靶標的尋找、耐藥機制研究及開發(fā)新型抗生素提供研究基礎。

本研究基于非靶標代謝組學方法，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術（Ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOFMS）對菌株胞內代謝產物進行分離、檢測，分析菌株代謝輪廓存在的顯著性差異，并對菌株耐藥代謝途徑進行富集分析，探究菌株代謝特征和耐藥性之間的關聯性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株為本實驗室分離獲得，食品分離基質包括即食食品，生、熟肉，40 株菌株信息見表1。

表1 食品分離株主要信息Table 1 Main information of L.monocytogenes

腦心浸液肉湯（Brain heart infusion，BHI）、腦心浸液瓊脂（Brain heart infusion agar，BHIA），英國OXOID 公司；甲醇（質譜純），乙腈（質譜純），美國Thermo Fisher 公司；甲酸，美國Honeywell 公司；Milli-Q 純水，德國默克集團；Kinetex 反相C18液相色譜柱，美國飛諾美（phenomenex）公司；聚四氟乙烯微孔過濾器，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（D-37520），德國Osterode 公司；小型迷你臺式恒溫搖床（XHZ-03），上海堪鑫儀器設備有限公司；超聲波清洗儀（SB5200D），寧波新芝生物科技股份有限公司；真空離心濃縮儀（Concentrator plus），德國Eppendorf 公司；四極桿飛行時間串聯質譜儀（Triple TOF 6600）、超高效液相色譜儀（ExionLC AD），美國AB SCIEX 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化和培養(yǎng) 將磁珠保藏菌株接種于BHI 培養(yǎng)基中，37 ℃下恒溫搖床培養(yǎng)16～18 h。取出后用無菌接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液劃線接種于BHIA 平板上進行二次活化培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，進行菌株藥敏試驗。取200 μL 第1 次純培養(yǎng)物，按照體積比1∶100 加到新鮮的BHI 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，取對數生長期菌液進行胞內代謝物提取。

1.3.2 菌株藥物敏感性試驗 使用微量肉湯稀釋法測定菌株的抗生素敏感性。陽性對照質控菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）。根據菌株的最小抑菌濃度 （Minimum inhibitory concentration，MIC） 值對照臨床實驗室標準化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S24-2014 標準對菌株耐藥性進行判讀[19]（表2），當質控菌株藥敏結果符合標準時，認為藥敏試驗結果真實可靠。

表2 臨床實驗室標準化研究所復方新諾明M100-S24-2014 標準Table 2 M100-S24-2014 standard of institute of clinical laboratory standardization

1.3.3 菌株淬滅及代謝產物的提取、濃縮 菌株胞內代謝產物的提取參照Singh 等[20]的方法，略作修改。試驗中，加入40%冷甲醇水（4 ℃）淬滅溶液的體積為1.5 mL；室溫下在細胞碎片中加入無菌超純水的體積為1.5 mL，其余步驟參照文獻[20]進行。真空離心濃縮儀用于菌株胞內代謝物的離心濃縮，對旋干后的濃縮產物加入100 μL 超純水進行復溶。渦旋混勻后的胞內代謝產物用0.22 μm聚四氟乙烯微孔過濾器過濾。將樣品置于帶有內襯管的螺紋口自動進樣瓶中，-80 ℃保存。每個菌株樣品做4 次生物學平行試驗。每個樣本取同等體積 （10 μL） 代謝提取物混勻，作為質量控制（Quality control，QC）樣品，對試驗儀器的穩(wěn)定性和重復性進行監(jiān)測。

1.3.4 非靶標代謝組學分析 采用超高效液相色譜系統(tǒng)（ExionLC AD，AB SCIEX）對菌株胞內代謝產物進行分離。色譜柱使用C18 反相色譜柱（2.6 μm，100 A，100 mm×2.1 mm）。液相色譜系統(tǒng)參數設定：流動相：A 相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液。流動相使用前進行超聲脫氣。流動相洗脫梯度如表3所示，色譜柱溫度40 ℃，進樣量3 μL。

表3 流動相洗脫梯度Table 3 Mobile phase elution gradient

胞內代謝產物的檢測采用聯用電噴霧電離（ESI）的四極桿飛行時間串聯質譜儀（Triple TOF 6600），分別在正、負離子電離模式下采集數據。使用全掃（Full-Scan）和信息依賴掃描模式（Informa-tion dependent acquisition，IDA），動態(tài)背景扣除（DBS），對一級、二級譜圖進行采集。離子源參數設定：正離子模式下的噴霧電壓（Ion spray voltage floating，ISVF），5 000 V；負離子模式下的噴霧電壓（ISVF），-4 500 V。一級質譜的掃描范圍m/z 100～1 000，保留時間0.250 s；二級質譜掃描范圍m/z 50～1 000，保留時間0.05 s，模式選用高分辨模式（High resolution），碰撞電壓（Collision energy，CE）為35 eV，碰撞能量疊加（Collision energy spread，CES）為15 eV。為保證高分辨質譜在數據采集過程中的高質量靈敏度，使用自動校準裝置系統(tǒng)（Calibration device system，CDS）加注專用CDS 校準液用于系統(tǒng)校正[21]。

1.4 數據分析

1.4.1 數據處理和分析 使用MarkerView 1.3.1軟件（AB SCIEX）實現對所有進樣樣品的峰檢測、峰比對、峰積分和數據歸一化等數據預處理。利用SIMCA15.0.2 軟件對預處理的矩陣數據進行化學計量學分析，分析中權重（Weighting）設為佩爾托標度（Pareto scaling，par）、轉化（Transformation）為log 轉化。試驗建立有監(jiān)督的正交偏最小二乘分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型。模型的擬合參數（R2Y 和Q2）用于直觀評判模型的質量，當R2Y 和Q2值大于0.9 時，認為建立的模型有非常優(yōu)秀的可靠性和預測度。參數R2和Q2的差值最好處于0.2～0.3之間。試驗中使用置換檢驗模式對模型進行檢驗，模型參數直觀表示為R2的截距小于0.3 并接近于0，Q2的截距小于0.05[22]。

1.4.2 差異代謝物的定性 差異化合物的篩選遵循單維變量統(tǒng)計分析和多維變量統(tǒng)計分析相結合的方式。使用SIMCA 軟件建立OPLS-DA 模型，根據模型輸出變量重要性投影值 （Variable importance in projection，VIP），結合顯著性統(tǒng)計值進行潛在差異化合物的篩選。試驗中設定的差異化合物定性標準為“VIP≥1.5 & P ＜0.05”。潛在差異化合物的初步篩選使用PeakView 2.2 軟件（AB SCIEX）中的Formular Finder 插件，選擇質量誤差在±5×10-6u 以內的化學式進行數據庫檢索和物質鑒定。差異化合物的對比確證使用人類代謝組數據庫（Human metabolome database，HMDB）（http：//www.hmdb.ca）、MassBank（https：//massbank.eu/MassBank） 和在線軟件MS-DIAL（http：//prime.psc.riken.jp/compms/msdial/ main.html）[23-24]。

1.4.3 差異代謝物可視化分析和代謝通路分析GraphPad Prism 8.0.2.（263）軟件用于差異化合物火山圖繪制。MetaboAnalyst 5.0 在線數據處理軟件 （https：//www.metaboanalyst.ca） 中的Statistical Analysis 模塊用于差異化合物層次聚類分析，軟件的Pathway Analysis 模塊結合京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）（https：//www.kegg.jp）用于代謝通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 菌株藥物敏感性試驗

基于CLSI 判別標準，對40 株單增李斯特菌進行9 種常見抗生素藥物敏感性測定。測定結果（表4）表明：所有菌株對慶大霉素、氨芐西林、青霉素、萬古霉素、紅霉素、利福平、四環(huán)素等7 種抗生素均表現為敏感。菌株對復方新諾明和環(huán)丙沙星有耐藥現象，耐藥率分別為30%（12/40）和100%（40/40）。單增李斯特菌對環(huán)丙沙星的耐藥分析研究將在其它試驗中開展。

表4 單增李斯特菌常見抗生素藥敏性結果Table 4 Results of drug sensitivity to common antibiotics of L.monocytogenes

（續(xù)表4）

2.2 化學計量學分析

基于UPLC-QTOF-MS，在正、負離子模式下對單增李斯特菌胞內代謝產物進行分離、檢測。在MarkerView 軟件輸出的數據矩陣中，選擇單同位素峰用于后續(xù)化學計量化學分析。根據總離子流圖結果（圖1），正、負離子模式下Markerview 軟件峰提取時間分別設置為0.6～5.0 min 和0.6～6.0 min。在正、負離子模式下，分別獲得3 795 個和4 174 個峰，化學計量學中用這些峰來說明SXT耐藥株和敏感株的差異代謝特征[25]。

圖1 SXT 耐藥株和敏感株的UPLC-QTOF-MS 總離子流圖Fig.1 UPLC-QTOF-MS total ion chromatogram of SXT-resistant strains and sensitive strains

使用SIMCA 軟件進行化學計量學分析。根據菌株復方新諾明藥敏試驗結果，將試驗菌株分為SXT 耐藥株和敏感株，根據分組建立OPLS-DA 模型。如OPLS-DA 得分圖所示（圖2a，3a），SXT 耐藥株和敏感株的樣本點距離較遠，并有明顯的聚集趨勢，說明耐藥株和敏感株在代謝輪廓上存在差異。為直觀表示模型擬合程度，OPLS-DA 在正、負離子模式下的擬合參數分別為：正離子模式下，R2Y=0.991；Q2=0.981，負離子模式下，R2Y=0.992；Q2=0.988，2 種電離模式下的模型參數指標均接近于1，說明模型OPLS-DA 具備很強的解釋和預測能力，能有效區(qū)分SXT 耐藥株和敏感株。

圖2 正離子模式下SXT 耐藥株和敏感株OPLS-DA 得分圖（a）及置換檢驗圖（b）Fig.2 OPLS-DA score plot （a） and permutation test （b） of SXT-resistant strains and sensitive strains in positive ion mode

圖3 負離子模式下SXT 耐藥株和敏感株OPLS-DA 得分圖（a）及置換檢驗圖（b）Fig.3 OPLS-DA score plot （a） and permutation test （b） of SXT-resistant strains and sensitive strains in negative ion mode

為驗證建立的OPLS-DA 模型的預測能力和解釋能力，選擇置換檢驗進行驗證。200 次迭代循環(huán)的置換檢驗結果如圖2b 和3b 所示，正、負離子模式下的原始模型Q2檢驗結果分別為-0.385 和-0.397，數值均小于0.05。這說明建立的OPLS-DA模型能夠用于單增李斯特菌復方新諾明耐藥株和敏感株的鑒別，試驗數據可用于菌株代謝特征分析。

2.3 差異化合物分析

根據差異化合物篩選標準實現潛在差異化合物的篩選。通過查閱相關文獻和HMDB 對化合物的描述，最終確定耐藥SXT 菌株和敏感株的胞內差異化合物有21 種（表5）。耐藥前、后的化合物變化顯著，主要以氨基酸、核苷和核苷酸為主。比較耐藥株和敏感株的差異倍數（Fold change，FC）值發(fā)現，相比于敏感株，耐藥株中包括4-氨基丁酸、亮氨酸和色氨酸在內的14 種化合物表現為上調【log2（FC）＞0】，而腺苷二磷酸核糖和4-羥基肉桂酸等7 種物質表現為下調【log2（FC）＜0】。根據VIP 值分析發(fā)現，氨基酸類物質的VIP 值更大，說明菌株受到SXT 作用產生耐藥性后，氨基酸類物質的變化更為明顯，更能表現SXT 耐藥株和敏感株間的差異（圖4）。

圖4 復方新諾明耐藥株和敏感株差異代謝物火山圖Fig.4 Volcano map of the differential metabolites between SXT-resistant and sensitive strains

表5 復方新諾明耐藥株和敏感株差異化合物信息表Table 5 Overview of differential compounds in L.monocytogenes SXT-resistant and sensitive strains

為表示差異化合物豐度水平在SXT 耐藥株和敏感株之間的聚類程度，采用聚類熱圖進行可視化分析。如圖5所示，R SXT 和S SXT 分別代表SXT 耐藥株和SXT 敏感株。聚類結果表明40株單增李斯特菌被明顯地區(qū)分為2 簇，說明代謝組學數據可將SXT 耐藥株和敏感株區(qū)分開。熱圖中色標（2 至-2）表示SXT 作用菌株后細胞內差異化合物代謝水平由高到低的變化趨勢。根據色標值的變化，包括亮氨酸、異亮氨酸、4-氨基丁酸、鳥苷、尿苷二磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸半乳糖等15種化合物在SXT 耐藥株中有較高的代謝水平，相反，這些物質在敏感株中的代謝水平較低。明顯的代謝物豐度差異表明差異化合物可用于后續(xù)耐藥株和敏感株的代謝通路富集分析[26]。

圖5 SXT 耐藥株和敏感株差異代謝產物熱圖Fig.5 Heatmap of differential metabolites between SXT-resistant strains and sensitive strains

2.4 差異代謝通路研究

為確定菌株受到復方新諾明作用產生耐藥性前、后的相關代謝通路，基于KEGG 數據庫結合Metaboanalyst 軟件對定性的差異化合物進行代謝通路富集分析。分析發(fā)現，SXT 耐藥株和敏感株的代謝途徑一共有19 條（表6）。其中含2 個或2 個以上差異化合物的代謝途徑有6 條，通過歸類分析發(fā)現，6 條代謝途徑分為氨基酸代謝（2 條）、碳水化合物代謝（2 條）、核苷酸代謝（1 條）和遺傳信息的處理、翻譯（1 條）。與差異化合物相關的主要代謝途徑如圖6a 所示。

表6 SXT 耐藥株和敏感株代謝通路富集結果Table 6 Enrichment results of metabolic pathways of SXT-resistant strains and sensitive strains

為分析SXT 引起菌株耐藥性和敏感性的顯著性差異代謝途徑和重要代謝途徑，根據P＜0.05篩選耐藥株和敏感株的顯著性差異代謝途徑，結果發(fā)現分別屬于核苷酸代謝和遺傳信息處理、翻譯的嘌呤代謝（a）和氨?；鵷RNA 生物合成（b）代謝途徑。根據響應值（Impact）≥0.10 篩選，結果發(fā)現受到SXT 作用嚴重影響的4 條代謝途徑，分別為核黃素代謝（c），氨基糖和核苷酸糖代謝（d），甘油磷脂代謝（e），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（f），歸類表明代謝途徑分別屬于氨基酸代謝、碳水化合物代謝和脂質代謝。根據代謝途徑在代謝通路中的相關關系設定圖6b 的代謝網絡。

圖6 SXT 耐藥株和敏感株代謝通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of metabolic pathways of SXT-resistant strains and sensitive strains

3 結論與討論

本文基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用的非靶標代謝組學技術，研究單增李斯特菌復方新諾明耐藥株和敏感株之間的代謝物差異。據文獻報道，復方新諾明作用時細菌的二氫蝶呤合成酶和四氫葉酸的生物合成受阻，進而抑制核酸、蛋白質的合成，最終導致細菌生長繁殖障礙[27]。試驗中，差異化合物在代謝途徑中的調控變化表明：在氨?；鵷RNA 的生物合成途徑中，亮氨酸和色氨酸在SXT 耐藥株中表達上調，而亮氨酸用于維持細胞滲透穩(wěn)定，這說明菌株細胞難以抵抗SXT 的作用而生存菌株的抗性因亮氨酸的上調而降低[28-29]。色氨酸能夠提高細胞氧化活性，菌株可以通過調節(jié)氧化應激來增強抗性。腺苷用于酸化激活氨基酸，產生的氨酰基腺酸轉移至核糖核酸，從而生成氨?；鵷RNA[30]。試驗中鑒定的核苷酸類化合物（如腺苷）在SXT 耐藥株中表現為下調，這說明菌株受SXT 作用后，菌株的能量供應和氨基酸生物合成受到影響。甘油磷脂作為微生物細胞的膜脂類物質，控制著細胞的調控轉運、蛋白功能和信號轉導[31]。試驗中菌株在SXT 作用下，菌株細胞的甘油磷酸膽堿表達下調，說明SXT對細胞的作用使得細胞調控轉運、蛋白功能和信號轉導發(fā)生變化，從而影響菌株對抗生素的耐藥性[32]。此外，試驗分離的單增李斯特菌株對環(huán)丙沙星的耐藥性非常高，值得關注，將在后續(xù)研究中分析。