基于魔芋葡甘聚糖的微纖絲膜的制備及其抗菌性能研究

穆若郡，步倪彤，王 林，龐 杰

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002）

食品在保藏過程中易發(fā)生腐敗變質(zhì)，保鮮膜是常用的解決方法之一[1]，目前被廣泛應(yīng)用于制作食品保鮮膜的材料主要有塑料、金屬、紙等[2]。這些材料雖能夠達(dá)到保鮮食品的目的，但存在一些缺點，如：材料不易降解[3]，金屬離子析出[4]和機械性能差[5]等問題。開發(fā)新型無毒、可降解且機械性能高的包裝材料成為研究者需要攻克的難題。常見的無毒可降解材料包括天然多糖、蛋白質(zhì)[6]以及合成的高分子材料，如聚乳酸、聚乙烯醇和聚乙二醇等[7]。為了提高膜的機械性能，Guo 等[8]將甲基纖維素（MC）和聚乳酸（PLA）混合，結(jié)果表明，MC/PLA質(zhì)量比在99∶1～9∶1 范圍時，MC/PLA 膜的拉伸強度和延伸率均顯著提高，甲基纖維素/聚乳酸（97∶3）膜的拉伸強度和伸長率是最優(yōu)的，分別比純甲基纖維素膜高30%和35%。Pan 等[9]將氧化石墨烯加入殼聚糖中，結(jié)果表明，納米復(fù)合材料的斷裂強度和拉伸模量分別顯著提高了93%和51%。Narges 等[10]通過澆注法將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.1%，0.5%，1%） 的納米殼聚糖或納米纖維素加入羧甲基纖維素（CMC）膜溶液中，結(jié)果表明，納米復(fù)合膜的拉伸強度和斷裂伸長率隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高。目前，將功能性的天然物質(zhì)添加到高分子聚合物中是研究熱點。

魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）是從魔芋塊莖中提取的多糖之一，是一種非常重要的生物可再生資源。KGM 的分子鏈由D-葡萄糖和甘露糖以1∶1.6 的物質(zhì)的量比通過分子β-1，4-糖苷鍵連接，每19 個糖殘基上有1 個乙?；鵞11]。由于KGM 具有可生物降解性、高黏度、無毒性、成膜能力以及資源豐富[12]，因此被廣泛應(yīng)用于制備食品包裝薄膜。Lin 等[13]用KGM 開發(fā)一種新型的高性能活性食品包裝：魔芋葡甘聚糖/聚乳酸/反式-肉桂酸微膜（KPTMF）。Zou 等[14]以高直鏈玉米淀粉（HCS）和KGM 為基料，研制甘油增塑復(fù)合膜-HCS/KGM 復(fù)合膜。Wu 等[15]將紅甘藍(lán)花青素（RCA）固定在氧化甲殼素納米晶體（O-ChNCs）/KGM 基質(zhì)中，制備一種智能活性膜。然而，KGM水溶性高，力學(xué)性能差，無抗菌性，限制了其發(fā)展[16-17]。近年來，研究者提出許多構(gòu)建活性食品包裝膜的方法。Lei 等[18]通過鑄造法將果膠芋葡甘露聚糖與茶多酚結(jié)合形成復(fù)合可食用薄膜，雖然制備工藝簡單、環(huán)保，但是所得膜缺乏較大的比表面積，且其分子質(zhì)量對所載生物活性化合物的活性有很大影響。Aydogdu 等[19]利用靜電紡絲技術(shù)制備載沒食子酸羥丙基甲基纖維素納米纖維，用于活性食品包裝，雖然得到的薄膜具有較大的比表面積，但是活性物質(zhì)通常揮發(fā)性強，對高壓和高溫敏感，靜電紡絲后其生物活性可能相對較低。

微流體紡絲技術(shù)是制備超細(xì)微納米纖維的主要技術(shù)之一[20]，該技術(shù)以簡單、安全、多樣化、低成本和可擴展制造能力而廣受關(guān)注。Mu 等[21]利用微流體紡絲技術(shù)構(gòu)建有序的微纖維陣列，獲得的超細(xì)纖維尺寸一致且寬度均勻。Zhang 等[22]利用微流體紡絲技術(shù)制備新型微液反應(yīng)器，并產(chǎn)生熒光超細(xì)纖維。Hu 等[23]通過微流體紡絲技術(shù)獲得強海藻酸鈣微纖維，且所制備的海藻酸鈣微纖維的最大強度達(dá)185.1 MPa。

本研究以KGM 為原料，結(jié)合PAAM，首先制備KGM/PAAM 溶膠，利用流變性能測試確定性能穩(wěn)定的微流紡絲液；其次結(jié)合微流體紡絲技術(shù)，制備KGM/PAAM 微纖絲膜，并表征其結(jié)構(gòu)和性能；最后驗證微纖絲膜的抗菌性能。本研究為開發(fā)新型抗菌可降解包裝材料提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋葡甘聚糖（KGM），中國云南三愛魔芋食品有限公司；聚丙烯酰胺（PAAM），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；去離子水，自制。

1.2 儀器與設(shè)備

JNS/MF 型微流體紡絲機，南京捷納思新材料有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；JEOLJSM6380LV 型掃描電鏡，日本電子株會社；AV-ATAR360 傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet 尼高力公司；AB-50 電子分析天平，瑞士Mette 公司；R30A 電動攪拌器，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；NovaNanoSEM230 場發(fā)射掃描電鏡，美國FEI 公司；DSC200F3 差示掃描量熱計，耐馳（上海）機械儀器有限公司；XRD-6000 衍射儀，日本島津公司；SC083654 實驗室專用超純水機，廈門精藝興業(yè)科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 PAAM 溶膠的制備 準(zhǔn)確稱取99 g 去離子水放入燒杯中，以500 r/min 的轉(zhuǎn)速，在50 ℃水浴加熱下，加入1 g PAAM 固體粉末使之完全溶解，即得所需1%的PAAM 溶膠。

1.3.2 KGM 溶膠的制備 準(zhǔn)確稱取99 g 去離子水放入燒杯中，以500 r/min 的轉(zhuǎn)速，在50 ℃水浴加熱下，緩慢加入1 g KGM，勻速攪拌1 h 形成1%的KGM 溶膠。

1.3.3 KGM/PAAM 微流體紡絲溶膠的制備 取一定量的KGM 溶膠和PAAM 溶膠，利用注射器將兩種溶膠按不同比例均勻混合，超聲波脫氣30 min，制得不同比例的KGM/PAAM 微流紡絲溶膠。

1.3.4 KGM/PAAM 微纖絲膜的制備 將制得的KGM/PAAM 微流紡絲溶膠利用微流體紡絲機制備微纖絲膜。微流體流速固定在0.1 mL/h，電機轉(zhuǎn)速固定在800 r/min，將收集得到微纖絲膜置于真空干燥箱中干燥24 h，得到干燥的KGM/PAAM 微纖絲膜。

1.3.5 負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜的制備 對制得的不同比例KGM/PAAM 微流紡絲溶膠進(jìn)行流變性能測試，確定性能穩(wěn)定的微流紡絲溶膠，加入適量氧氟沙星顆粒，利用注射器均勻混合，使用微流體紡絲機制備微纖絲膜。微流體流速固定在0.1 mL/h，電機轉(zhuǎn)速固定在800 r/min，將收集得到的微纖絲膜置于真空干燥箱中干燥24 h，得到干燥的負(fù)載氧氟沙星KGM/PAAM 微纖絲膜。

1.4 測試與表征

1.4.1 流變性能測試 KGM/PAAM 溶膠流變特性的測試：使用MCR301 Rheoplus 流變儀進(jìn)行測試，采用標(biāo)準(zhǔn)平行板（PP-50，50 mm 直徑，1 mm 間隙）進(jìn)行研究。在25 ℃下，0.1～300 s-1剪切速率范圍內(nèi)，測試不同比例的KGM/PAAM 溶膠的剪切應(yīng)力。

1.4.2 傅里葉紅外光譜（FT-IR） KGM/PAAM 微纖絲膜用KBr 研磨成粉末并壓平成薄片，用AVATAR360 型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）在4 000～400 cm-1波長范圍內(nèi)掃描測定，分辨率為4 cm-1。

1.4.3 熱重分析（TGA） 使用DSC200F3 型差示掃描量熱計 （DSC） 在N2環(huán)境下，稱取2.0 mg KGM/PAAM 微纖絲膜，分別密封于坩堝中，得到了樣品在以10 k/min 的速率在40～600 ℃之間的熱行為，以空密封坩堝作參照對象，每個試驗重復(fù)3 次。

1.4.4 掃描電鏡測試 （SEM） 在13.3 Pa 真空度下，將KGM/PAAM 微纖絲膜固定在覆蓋碳條的圓柱形顯微鏡短板上，涂上100～200 ? 厚度的金層，然后用JEOLJSM 6380LV 型掃描電子顯微鏡在加速電壓為15 kV 下觀察其表面形貌。

1.4.5 X 射線光電子能譜（XRD） 制備的KGM/PAAM 微纖絲膜采用XRD-6000 衍射儀進(jìn)行分析，衍射掃描區(qū)域為5°～60°，掃描速度為0.1°/s。

1.5 抗菌性能測試

1） 根據(jù)抑菌圈，評價負(fù)載氧氟沙星KGM/PAAM 微纖絲膜對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的大腸桿菌的抑菌效果[24]。所有菌株均在37 ℃瓊脂板上培養(yǎng)24 h。將3～5 個細(xì)菌分離菌落放入5 mL Luria-Bertani 培養(yǎng)基 （LB 培養(yǎng)基）中，制備接種菌（1%胰蛋白酶，0.5%酵母提取物，1%NaCl，滅菌時間為120 ℃，20 min），然后在37 ℃的條件下孵育24 h。將得到的菌懸液用相同的LB 培養(yǎng)基稀釋，在625 nm 波長處用紫外可見分光計測定菌濃度。隨后，將0.1 mL 含有大約106～107CFU/mL 被測細(xì)菌的接種物接種在固體LB 培養(yǎng)基表面。最后，用直徑6 mm 的模具將微纖絲膜切成圓盤狀，然后放置在LB 平板上。在37℃孵育24 h 后測定抑制區(qū)直徑。

2） 分別制備TCBS 和Chromagar 平板，接種副溶血性弧菌，將微纖絲膜切成半圓形（尺寸為平板培養(yǎng)基的一半）放置在平板上，在37 ℃孵育24 h 后觀察平板。

2 結(jié)果與分析

2.1 KGM//PAAM 溶膠的流變性質(zhì)與微纖絲膜的微觀形貌

為了獲得性能優(yōu)良的KGM 溶膠，本研究將PAAM 與KGM 按一定比例混合，兩種高分子在水中形成纏結(jié)網(wǎng)絡(luò) （圖1a）。通過流變性測試 （圖1b），隨著剪切速率的增加，KGM、PAAM、KGM∶PAAM（質(zhì)量比）=1∶1 的剪切應(yīng)力逐漸變大，然而當(dāng)剪切速率達(dá)到一定值后，剪切應(yīng)力的變化平緩，表現(xiàn)出剪切稀化現(xiàn)象，這是由于剪切速率的增大使得高分子化合物的分子鏈發(fā)生定向排列[25]，與單一KGM 溶膠相比，加入同比例的PAAM 使得剪切應(yīng)力有較大的變化，分子間協(xié)同增效作用更強，形成的溶膠更加均勻、穩(wěn)定，流動性更強；當(dāng)KGM∶PAAM（質(zhì)量比）=3∶7 或KGM∶PAAM（質(zhì)量比）=7∶3 時，隨著剪切速率的不斷增加，剪切應(yīng)力呈不規(guī)則變化，在形成溶膠的過程中，PAAM 易纏結(jié)成塊，形成的KGM/PAAM 溶膠流動性較差，本研究最終選定了KGM∶PAAM（質(zhì)量比）=1∶1 作為紡絲溶膠，利用微流體紡絲技術(shù)制備了KGM/PAAM 微纖絲膜（圖1c）。通過SEM 觀察到平行排列和矩形網(wǎng)格的微觀結(jié)構(gòu)，微纖絲膜的寬度約為100 μm，進(jìn)一步將氧氟沙星顆粒負(fù)載于微纖絲膜中，顆?？梢跃鶆虻姆稚⒃谀さ奈⒗w絲中（圖1c）。

圖1 （a） KGM/PAAM 溶膠網(wǎng)絡(luò)示意圖；（b）KGM/PAAM 溶膠在不同剪切速率下隨剪切應(yīng)力變化的流變行為；（c）MST 制備微纖絲膜的形成過程以及負(fù)載氧氟沙星的SEM 圖像Fig.1 （a） The schematic representation of network of KGM/PAAM sol；（b） Rheology behavior of KGM/PAAM sols changes in shear stress with shear rate at different ratios；（c） The formation process of preparing microfibril film via MST and SEM images of microfibril film loaded with ofloxacin

2.2 KGM//PAAM 微纖絲膜的表征

本研究利用FT-IR、XRD 和TGA 對KGM 和KGM/PAAM 微纖絲膜進(jìn)行表征。圖2a 為KGM 和KGM/PAAM 復(fù)合材料在波數(shù)為4 000～400 cm-1時的FT-IR 光譜。兩者吸收帶都在3 446 cm-1附近，表示O-H 的拉伸振動，在2 927 cm-1處有較弱吸收峰，對應(yīng)于-CH2-的對稱及非對稱伸縮振動峰，881 cm-1處的吸收峰，對應(yīng)于多糖中的β-1，4 糖苷鍵。KGM/PAAM 光譜中，2 771 cm-1處的吸收峰可能是PAAM 中C-H 的特征伸縮振動。同時，在1 729 cm-1附近的吸收峰被分散，表明在堿性條件下加入PAAM 去除了KGM 中的乙?；鵞25]。如圖2b 所示，在KGM 中觀察到在2θ=22°處有一個明顯的峰，說明KGM 是一種非晶態(tài)材料[13]，此外，KGM/PAAM 中出現(xiàn)了一些衍射峰，說明微膜中KGM 和PAAM 之間存在分子間的相互作用[26]。圖2c 為KGM/PAAM 的TGA 曲線。質(zhì)量損失的第一階段（低于150 ℃）主要由于水分蒸發(fā)引起，這可能是伴隨著破壞分子間的氫鍵所導(dǎo)致的，兩者質(zhì)量損失相似[27]。第二階段是150～300 ℃，KGM/PAAM 質(zhì)量損失約為13%，而KGM 質(zhì)量損失較大，約45%，主要原因是主鏈降解的質(zhì)量損失和交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的破壞[28-29]。第三階段從300 ℃開始，到550 ℃以后趨于平緩，這一階段KGM/PAAM 的質(zhì)量損失低于KGM，而重量殘差高于KGM。這說明與PAAM 復(fù)合后制備的微纖絲膜的熱穩(wěn)定性增強。

圖2 KGM 和KGM/PAAM 的（a）FT-IR 光譜（b）XRD 圖譜和（c）TGA 曲線Fig.2 FT-IR spectrum （a） XRD pattern （b） and TGA curves （c） of KGM and KGM/PAAM

2.3 負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜的抗菌性能

氧氟沙星的抗菌機制是通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，阻止細(xì)菌DNA 的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[12]。由于直接將氧氟沙星通過噴灑、涂抹的方式作用于食品表面會導(dǎo)致藥物性能的不穩(wěn)定，從而影響抗菌效果，通常會選擇一種負(fù)載體，由于膜具有無毒環(huán)保、成本低廉、能夠用于運輸藥物等優(yōu)點[30]，本研究將氧氟沙星負(fù)載于制備的KGM/PAAM 微纖絲膜。為了明確負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜的抗菌性能，本研究選擇副溶血弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為模型細(xì)菌。由圖3a 和圖3b 可知，在37 ℃孵育24 h 后，TCBS 和Chromagar 平板上沒有微纖絲膜的區(qū)域副溶血性弧菌密集分布，有微纖絲膜的區(qū)域未見副溶血性弧菌，由此可見，微纖絲膜對副溶血性弧菌有明顯的抑菌效果。由圖3c 和圖3d 可知，沒有負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜對大腸桿菌抑菌圈直徑為0 mm，沒有抑菌效果；負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜對大腸桿菌抑菌圈直徑為39.6 mm，由此可見，微纖絲膜對大腸桿菌產(chǎn)生了很好的抗菌效果。由圖3e 和圖3f 可知，沒有負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為0 mm，沒有抑菌效果；負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為31.5 mm，微纖絲膜對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了良好的抗菌效果。副溶血弧菌作為一種常見病原菌，易引起海產(chǎn)品中毒，本研究制備的微纖絲膜對副溶血弧菌有明顯的抑菌效果，為海產(chǎn)品保鮮研究提供了一定的理論指導(dǎo)，同時，微纖絲膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果，亦可用于肉制品、乳制品等食品的保鮮。

圖3 Chromagar 平板副溶血性弧菌分布圖（a）；TCBS 平板副溶血性弧菌分布圖 （b）；KGM/PAAM微纖絲膜對大腸桿菌的抑菌圈 （c）；負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜對大腸桿菌的抑制圈（d）；KGM/PAAM 微纖絲膜對金黃色葡萄球菌的抑制圈（e）；負(fù)載氧氟沙星的KGM/PAAM 微纖絲膜對金黃色葡萄球菌的抑制圈（f）Fig.3 Distribution of Vibrio parahaemolyticus on Chromagar tablet （a）；Distribution of Vibrio parah -aemolyticus on TCBS tablet （b）；the inhibition zone of KGM/PAAM microfibril film to E.coli （c）；the inhibition zone of KGM/PAAM microfibril film loaded with ofloxacin to E.coli （d）；the inhibition zone of KGM/PAAM microfibril film to Staphylococcus aureus （e）；the inhibition zone of KGM/PAAM microfibril film loaded with ofloxacin to Staphylococcus aureus （f）

3 結(jié)論

本研究以KGM 為原料，結(jié)合PAAM，獲得了不同質(zhì)量比的KGM/PAAM 溶膠，并對溶膠的流變性能進(jìn)行研究，最終選定了KGM∶PAAM（質(zhì)量比）=1∶1 作為紡絲溶膠，運用微流體紡絲技術(shù)，制備KGM/PAAM 微纖絲膜，SEM 觀察到平行排列和矩形網(wǎng)格的微觀結(jié)構(gòu)，膜的寬度為100 μm；FT-IR和XRD 表明KGM 和PAAM 之間存在分子相互作用；TGA 表明KGM/PAAM 的質(zhì)量損失低于KGM，說明與PAAM 復(fù)合后制備的微纖絲膜的熱穩(wěn)定性增強。進(jìn)一步將氧氟沙星負(fù)載于KGM/PAAM 微纖絲膜中，并進(jìn)行抗菌試驗，結(jié)果表明，微纖絲膜對副溶血性弧菌有明顯的抑菌效果，為海產(chǎn)品保鮮研究提供了一定的理論指導(dǎo)；同時微纖絲膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為39.6，31.5 mm，具有良好的抑菌特性，在食品包裝中具有一定的應(yīng)用價值。本研究為構(gòu)建新型抗菌材料提供了一定的理論基礎(chǔ)。