雙孢菇邊角料制備ACE抑制肽

王 睿，贠建民，何 奎，武淑娟，畢 陽，趙風(fēng)云

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730070）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），是世界范圍內(nèi)廣泛種植的一種食用菌，我國年產(chǎn)量已超過100萬t，年出口量保持在50 萬t 左右[1]。雙孢蘑菇蛋白質(zhì)含量高，占鮮重的3.5%～4.5%，是普通蔬菜的幾倍至幾十倍，在食用菌中位居前列，是一種潛在的蛋白質(zhì)資源，有“植物肉”之稱[2]。雙孢蘑菇除了鮮銷外，大多加工成罐藏產(chǎn)品為主[3]，加工過程中約10%的食用菌菇柄、殘次品和碎屑等邊角料被廢棄，不僅增加環(huán)境污染，還會造成資源浪費[4]。然而，這些邊角料同樣具有高蛋白、低脂肪的特點，使其成為制備生物活性肽的潛在熱門原料。

生物活性肽是一種對機體生命活動有益或具有特定生理調(diào)節(jié)作用的肽類化合物[5]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE），是人體血壓調(diào)節(jié)的一種關(guān)鍵限速酶。ACE 抑制肽是具有ACE 抑制活性的肽類物質(zhì)，一方面能夠阻止ACE 催化緩激肽的水解，使其具有正常的收縮血管能力，另一方面還能阻止ACE 催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有收縮血管能力的血管緊張素Ⅱ，降血壓作用顯著[6-7]。此外，與合成的降壓藥物不同，ACE 抑制肽具有安全性高，毒副作用小，可長期食用等優(yōu)點，因此，食源性ACE 抑制肽成為近年來的研究焦點[8]。

目前，以食用菌為原料獲取ACE 抑制肽的方法主要有水提法、硫酸銨沉淀法和甲醇沉淀法等[9]。研究者多以大白口蘑[10]、蟹味菇[11]、茶樹菇[12-13]、靈芝[14]、側(cè)耳菌[15]等栽培食用菌子實體和灰樹花、雙色牛肝菌等野生食用菌為原料，利用直接提取法制備ACE 抑制肽。受資源限制，若以子實體整菇為原料，則生產(chǎn)成本較高[16]。以上這些方法雖然提取工藝簡單、快捷、提取率較高，但是得到的ACE抑制肽種類比較單一，且原料利用率較低。而采用酶法水解制備ACE 抑制肽，不僅可以更充分地利用原料中的蛋白資源，而且有可能獲得種類更豐富的ACE 抑制肽。然而，酶法水解雙孢菇邊角料蛋白制備ACE 抑制肽的研究尚未見報道。

鑒于此，本試驗以工廠生產(chǎn)的雙孢菇菇柄、異形菇等邊角料為原料，利用堿溶酸沉法提取雙孢菇邊角料蛋白，超聲波處理后，分別選用胰蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對其進行酶解，通過測定蛋白的水解度和ACE 抑制率來確定最佳的蛋白酶種類。采用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法，優(yōu)化蛋白酶酶解工藝條件，以期獲得新的ACE 抑制肽，為雙孢菇產(chǎn)業(yè)邊角料高值利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢菇邊角料，天水眾興菌業(yè)科技有限公司。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），美國Sigma 公司；N-[3-（2-呋喃基） 丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG），西寶生物科技（上海）股份有限公司；堿性蛋白酶（20 萬u/g）、胰蛋白酶（250 USP u/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 u/mg）、茚三酮、硼酸、硼砂、氫氧化鈉，源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204B 電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；TU-1810 系列紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HBS-1096A 酶標分析儀，南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；101-1-S-H電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；DFY-200 高速多功能粉碎機，上海塞耐力有限公司；HWS-26 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LGJ-10FD 型冷凍干燥機，北京亞星儀科科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料的預(yù)處理 將雙孢蘑菇邊角料進行干制：1～4 h，38～40 ℃；4～8 h，40～45 ℃；8～12 h，45～50 ℃；12～16 h，50～53 ℃；17 h 以后，55～60 ℃，直至恒重，用粉碎機粉碎干制好的原料。

1.3.2 超聲波輔助提取食用菌蛋白 將雙孢菇邊角料粉末以一定的料水比制成溶液，經(jīng)過超聲波處理后，用1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 值為10.0，浸提2 h，以6 000 r/min 速度離心15 min，取上清液，用1 mol/L 的HCL 調(diào)節(jié)上清液的pH 值為4.5，靜沉2 h，8 000 r/min 離心20 min，并收集沉淀。

1.3.3 超聲波輔助酶法水解雙孢菇子實體蛋白 將收集得到的雙孢菇邊角料蛋白溶液，以一定的功率超聲一定時間，然后用不同的蛋白酶酶解食用菌蛋白溶液，酶解完成后，在90 ℃水浴中滅酶10 min，冷卻離心（10 000 r/min，4 ℃，20 min），收集上清液，用0.45 μm 膜過濾，將濾液凍干。

1.3.4 蛋白酶的篩選 分別使用胃蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶對溶液進行依次酶解，以蛋白水解度和ACE 抑制率為指標，篩選出最佳的蛋白酶。

1.3.5 單因素實驗設(shè)計 分別以酶解溫度（30～50℃）、酶解時間（30～150 min）、酶解pH 值（7～9）、蛋白酶添加量（3～7 mg/100 mL）和料水比（1∶10～1∶50）為單因素，以蛋白水解度和ACE 抑制率為指標，確定最佳的酶解溫度、時間、pH 值、添加量和料水比。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 分別選擇酶解時間、酶解溫度、酶解pH 值和蛋白酶添加量4 個因素進行進一步優(yōu)化。以單因素實驗確定的最佳因素水平為中點，以ACE 抑制率為響應(yīng)值。利用CCD（Central Composite Design） 進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。4 因素3 水平編碼表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼值表Table 1 Coding values of response surface test factor levels

1.3.7 測定方法

1.3.7.1 蛋白質(zhì)含量的測定 總蛋白質(zhì)含量測定采用堿溶法，即樣品先用2 mol/L NaOH 提取4 h后，采用福林酚法測定可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.7.2 蛋白提取率的測定 蛋白提取率按公式（1）計算。

式中，a——雙孢菇提取量 （g）；b——樣品中蛋白質(zhì)含量（g）。

1.3.7.3 水解度的測定 標準曲線的繪制：將甘氨酸置于50 ℃烘箱中干燥。稱取0.1 g 甘氨酸置于小燒杯中，加入少量的去離子水溶解后，轉(zhuǎn)入100 mL 的容量瓶中定容。取2 mL 甘氨酸溶液定容至100 mL，此時該溶液中甘氨酸為20 μg/mL。分別取20 μg/mL 甘氨酸溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL 置于試管中，分別加入1.0 mL 茚三酮顯色劑，混合均勻，置于沸水中加熱15 min，靜置冷卻至室溫，加入5 mL 質(zhì)量分數(shù)40%的乙醇溶液，混合均勻，15 min 后以0 號管為空白對照，于570 nm 波長處測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算出酶解前、后中游離氨基的含量，總蛋白質(zhì)含量測定采用堿溶法。水解度按公式（2）計算。

1.3.7.4 ACE 抑制肽活性測定 參考Shalaby 等[17]的方法，并稍作修改。將1.0 mmol/L FAPGG 溶解于pH 值為7.5、含有0.3 mol/L NaCl 的Tris-HCl（50 mmol/L）中配制底物溶液，置于37 ℃水浴鍋中保溫。取10 μL 酶解液加入96 孔板中，然后加入150 μL 的底物溶液，迅速將孔板放入酶標儀中，于340 nm 波長下測定吸光值，每30 s 記錄1 次，共30 min?？瞻捉M以10 μL 的緩沖液代替酶解液，對照組以10 μL 的0.25 U/mL 的ACE 溶液代替酶解液。以吸光值變化（ΔA）對時間做出曲線，計算斜率。ACE 抑制率按公式（3）計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所有試驗重復(fù)3 次，結(jié)果以“平均值±標準偏差”表示，并采用Design Expert 10 和Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

選擇復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶依次酶解原料蛋白，測定其水解度和ACE 抑制率，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，供試的5 種蛋白酶（復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶）均可酶解雙孢菇蛋白，并產(chǎn)生一定的ACE 抑制效應(yīng)，且與直接提取法制備ACE 抑制肽相比，采用5 種蛋白水解酶處理后，其水解度顯著提高，其抑制率均發(fā)生了明顯變化。其中，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解后的ACE 抑制率較低，而堿性蛋白酶的ACE 抑制率最高，其蛋白水解度也較高。通過直接提取也可以獲得具有活性的ACE 抑制肽，然而其ACE 抑制率低于通過超聲波輔助酶法制備的ACE 抑制率。因此，本試驗選用堿性蛋白酶酶解雙孢菇蛋白制備ACE 抑制肽。

圖1 不同蛋白酶對水解度和ACE 抑制率的影響Fig.1 Effects of different proteases on degree of hydrolysis and ACE inhibition rate

2.2 酶解條件的單因素實驗

2.2.1 料水比對酶解效果的影響 用不同的料水比溶解雙孢菇邊角料粉末，然后用1.0 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值為8.0，添加5 mg/100 mL 的堿性蛋白酶，40 ℃水浴酶解90 min，以水解度和ACE 抑制率為測定指標，來確定響應(yīng)面優(yōu)化的中心值。結(jié)果如圖2所示。

圖2 料水比對雙孢菇蛋白酶解的影響Fig.2 Effect of material water ratio on proteolysis of Agaricus bisporus protein

由圖2可知，隨著料水比比值的下降，ACE 抑制率整體呈上升趨勢，當達到1∶30 后，基本保持不變，相反，蛋白水解度呈下降趨勢。因此，本試驗確定最佳的料水比為1∶30。

2.2.2 蛋白酶添加量對酶解效果的影響 將原料蛋白以1∶30 的料水比制成溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，添加不同量的堿性蛋白酶，40 ℃水浴酶解90 min，以ACE 抑制率和蛋白水解度為指標來確定最佳的蛋白酶添量，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著蛋白酶添加量的增加，蛋白的水解度也隨之增大，然而當添加量達到6 mg/100 mL 時，ACE 抑制率最大。隨著蛋白酶添加量的增加，ACE 抑制率反而降低，可能是因為蛋白酶將其中一些具有活性的ACE 抑制肽酶解成一些游離的氨基酸和沒有活性的肽，從而造成ACE 抑制率的降低。本試驗選擇6 mg/100 mL 為蛋白酶添加量的中心點進行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖3 蛋白酶添加量對雙孢菇蛋白水解的影響Fig.3 Effect of protease addition on the hydrolysis of Agaricus bisporus protein

2.2.3 蛋白酶酶解溫度對酶解效果的影響 將原料蛋白以1∶30 的料水比制成溶液，調(diào)節(jié)溶液pH 值為8.0，添加5 mg/100 mL 的堿性蛋白酶在不同溫度中酶解90 min，以ACE 抑制率和蛋白水解度為指標，確定最佳的酶解溫度，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白水解度和ACE 抑制率均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，由于溫度對堿性蛋白酶的活力有一定的影響，從而造成蛋白水解度的降低；而隨著溫度的升高，一些對溫度敏感的活性肽其活性會受到抑制，甚至失活，從而造成ACE 抑制率降低。其中ACE 抑制率在40 ℃時最大，此時的蛋白水解度也相對較大。本試驗選擇40 ℃為酶解溫度中心點進行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖4 蛋白酶酶解溫度對雙孢菇蛋白水解的影響Fig.4 Effect of temperature on the hydrolysis of Agaricus bisporus protein

2.2.4 溶液pH 值對酶解效果的影響 將原料蛋白以1∶30 的料水比制成溶液，添加5 mg/100 mL 的堿性蛋白酶，將溶液置于40 ℃水浴鍋中，用1.0 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)上述溶液pH 值，分別在不同的pH 值下酶解90 min，以ACE 抑制率和蛋白水解度為指標，確定堿性蛋白酶的最佳pH 值，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著酶解pH 值的升高，蛋白水解度也逐漸增大。當pH 值增加到8.0 后，蛋白水解度變化不大，由于堿性蛋白酶對pH 值不敏感，因此蛋白水解度變化較?。欢鳤CE 抑制率隨著pH 值的升高呈先增加后減小的趨勢，由于一些對堿敏感的活性肽隨著pH 值的升高而失活，從而造成ACE 抑制率的降低。其中，pH 值為8.0時，ACE 抑制率最大。因此，本試驗以pH 8.0 為中心點進行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖5 溶液pH 對雙孢菇蛋白酶解的影響Fig.5 Effect of pH on proteolysis of Agaricus bisporus protein

2.2.5 酶解時間對酶解效果的影響 將原料蛋白以1∶30 的料水比制成溶液，調(diào)節(jié)溶液pH 值為8.0，添加5 mg/100 mL 的堿性蛋白酶在40 ℃水浴鍋中酶解不同時間，以ACE 抑制率和蛋白水解度為指標，確定最佳的酶解時間。結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，隨著酶解時間的延長，蛋白水解度顯著升高，然而當酶解時間達到90 min 時，蛋白水解度和ACE 抑制率均達到峰值，之后隨著酶解時間的延長，ACE 抑制率有所下將，可能因為有些活性肽被酶解成一些游離氨基酸或一些沒有活性的肽，進而造成ACE 抑制率的降低。因此，本試驗以90 min 為酶解時間的中心點進行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖6 酶解時間對雙孢菇蛋白酶解的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on proteolysis of Agaricus bisporus protein

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果可知，影響雙孢菇蛋白質(zhì)水解制備ACE 抑制肽的主要因素有：pH 值、酶添加量、水解時間和水解溫度。因此，選擇這4 個影響因素進行響應(yīng)面中心組合設(shè)計進行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析表見表3。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Response surface test results

對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，得到的二次多項式方程：

Y = 43.37+1.91A-0.12B-0.27C+1.05D+2.18AB-0.14AC+1.29AD+0.56BC + 1.09BD +2.75CD-4.86A2-4.35B2-3.26C2-2.89D2

式中，Y——ACE 抑制率 （%），A——蛋白酶添加量（mg/100 mL），B——酶解溫度（℃），C——酶解pH 值，D——酶解時間（min）。由表3可知，該模型顯著（F=8.89，P＜0.0001）。模型的決定系數(shù)R2=0.8924，并且失擬項不顯著，說明該模型擬合度較好，是相對可靠的。4 個因素的顯著性影響大小依次為：酶添加量＞酶解時間＞pH 值＞水解溫度。其中，蛋白酶添加量和酶解時間表現(xiàn)顯著，因此，可以看出蛋白酶添加量和酶解時間對于雙孢菇蛋白水解液ACE 抑制率的影響較大。由表3中的方差分析表可以看出，蛋白酶添加量與酶解溫度、酶解時間與溶液pH 值的交互作用較明顯（P＜0.05），其交互作用如圖7和圖8所示。

圖8 pH 值與酶解時間的交互作用Fig.8 Interaction between pH value and enzymolysis time

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

圖7 蛋白酶添加量與酶解溫度的交互作用Fig.7 Interaction between protease addition and enzymolysis temperature

以上兩圖可直觀反映pH 值與溫度、酶添加量與反應(yīng)時間的相互作用對ACE 抑制率的影響。網(wǎng)狀圖形上部空間曲面的陡峭程度反映的是此自變量因素對ACE 抑制率響應(yīng)值的影響程度，位于圖像下部等值線圖的橢圓離心率則反映了因素互相作用的效果大小。各曲面頂點是影響酶解效果各作用因素的最佳條件。用Design Expert 8.0 軟件預(yù)測得到的理論最優(yōu)酶解條件為：堿性蛋白酶添加量6.25 mg/100 mL，酶解溫度40.47 ℃，酶解時間92.97 min，酶解pH 值8.04，此時ACE 抑制率可達到43.75%。在該條件下進行驗證試驗，測得水解液的ACE 抑制率為43.4%。

3 討論

食源性活性肽的研究與開發(fā)一直受到科學(xué)家們的高度關(guān)注[18-21]，特別是食源性血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽[22-24]。許新月[25]對杏鮑菇蛋白質(zhì)的提取以及復(fù)合酶酶解杏鮑菇蛋白質(zhì)提取ACE 抑制肽工藝進行了優(yōu)化，同時測定了ACE 抑制肽的體外降血壓活性，發(fā)現(xiàn)酶解溫度50 ℃、酶解pH 7.0、酶解時間60 min、堿性蛋白酶與復(fù)合蛋白酶配比為4∶3（質(zhì)量比）時，ACE 抑制率為67.1%。說明酶法水解食用菌蛋白可以獲得高效的ACE 抑制肽，并能更好的利用食用菌蛋白，從而提高原料的利用率，可為食用菌的高值利用提供一定的理論依據(jù)。然而，某些高蛋白含量的材料不一定都能夠通過酶解法制備ACE 抑制肽。因此，在制備食源性ACE 抑制肽的過程中，原料的選擇與制備條件對ACE 抑制肽的活性及得率具有十分重要的影響。

食用菌ACE 抑制肽的制備目前以直接提取法為主[9]，而直接提取法只適用于動植物中存在的一些天然生物活性肽，由于天然生物活性肽含量極微，組成復(fù)雜，提取分離純化成本高，種類單一，且此種方法分離的ACE 抑制肽來源有限。生物酶解法因具有生產(chǎn)條件溫和，水解過程可控，并且可以充分酶解原料中的蛋白，從而大大提高了獲得新型生物活性肽的可能性[26]。加入酶后，勢必會斷裂底物中更多的肽鍵位點，從而使目標蛋白中的小肽和游離氨基酸的量大大增加，提高蛋白質(zhì)的水解度[27-28]，同時，也增加了獲得潛在的生物活性肽的機會。然而，酶解法也可能會出現(xiàn)過度酶解的現(xiàn)象，從而造成一些ACE 抑制肽進一步被水解成小分子短肽或游離氨基酸，進而影響其ACE 抑制活性。同時，在本研究的單因素實驗中，發(fā)現(xiàn)溫度和pH 值對活性肽的影響也比較嚴重。由于酶解條件的控制對ACE 抑制肽活性的影響至關(guān)重要，因此，本研究優(yōu)化了酶解工藝，確保得到穩(wěn)定、高活性的ACE 抑制肽。

本研究利用雙孢菇工業(yè)化生產(chǎn)的一些殘次品，通過對蛋白酶酶解條件的優(yōu)化，獲得了具有潛在活性的ACE 抑制肽，并且計算了其得率，為24.36 mg/g，工業(yè)化生產(chǎn)前景良好，可為雙孢菇產(chǎn)業(yè)殘次副產(chǎn)物的高值利用提供有效途徑。然而通過酶法獲得的ACE 抑制肽，其具體的序列結(jié)構(gòu)、機體內(nèi)的穩(wěn)定性以及具體的作用機理尚不明確，接下來將做進一步研究。

4 結(jié)論

本試驗以工廠化生產(chǎn)的雙孢菇菇柄、異形菇等邊角料為原料，通過超聲波輔助酶法獲得了具有潛在活性的ACE 抑制肽，并對其工藝進行了優(yōu)化，確定了最佳蛋白酶為堿性蛋白酶，其優(yōu)化后的工藝參數(shù)為：堿性蛋白酶添加量6.25 mg/100 mL，酶解溫度40.47 ℃，酶解時間92.97 min，酶解pH值8.04，此時ACE 抑制率可達到43.75%。在該條件下進行驗證試驗，測得水解液的ACE 抑制率為43.4%，得率為24.36 mg/g，工業(yè)化生產(chǎn)前景良好。結(jié)果顯示，超聲波輔助酶法酶解雙孢菇蛋白制備ACE 抑制肽，可為酶法水解食用菌蛋白制備ACE抑制肽和雙孢菇產(chǎn)業(yè)邊角料高值利用提供一定的理論依據(jù)和新途徑。