蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母生理特性的影響

楊 超，肖 媚，張 菡，2，彭幫柱*

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 武漢 430070 2 西安彩虹星球農(nóng)業(yè)科技有限公司 西安 710061）

蘋果中富含維生素、礦物質(zhì)、多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其發(fā)酵制品蘋果酒中含有大量的氨基酸和有機(jī)酸等物質(zhì)，具有較高的保健價(jià)值，產(chǎn)量?jī)H次于葡萄酒[1]。多酚類化合物具有極強(qiáng)的抗氧化作用，酚類物質(zhì)的種類及含量被用于評(píng)價(jià)果酒的品質(zhì)[2-4]。蘋果中多酚類物質(zhì)有兒茶素類、原花青素類、酚酸類、黃酮醇類、花色苷類、二氫查耳酮類等[5-7]。綠原酸作為蘋果多酚中的代表性物質(zhì)，是一種羥基肉桂酸類多酚，因芳香環(huán)上的鄰羥基而具有很高的抗氧化活性[8]。綠原酸在蘋果和蘋果酒中含量相對(duì)較高[9]，其在蘋果中含量為0.02～4.39 mg/g DW[10-11]，其在蘋果酒中含量為24.84～90 mg/L[12]。在蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中，綠原酸會(huì)不斷的被釀酒酵母代謝，最終存在于蘋果酒中。

在蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中，綠原酸的含量會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而有所降低[13]。Nguela 等[14]研究了酵母和多酚之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)多酚類化合物引起酵母的生長(zhǎng)和代謝紊亂可能主要與它們和酵母細(xì)胞的質(zhì)膜相互作用有關(guān)，從靜止、中期到發(fā)酵結(jié)束，酵母菌會(huì)表現(xiàn)出適應(yīng)性反應(yīng)，從而降低死亡率。通過(guò)探究原花色素對(duì)釀酒酵母的影響，發(fā)現(xiàn)原花色素可以提高發(fā)酵末期釀酒酵母的數(shù)量和存活率，同時(shí)會(huì)提高胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性，降低胞內(nèi)丙二醛（MDA）的含量，其作用效果與濃度相關(guān)[15]。Jia 等[16]研究原花色素在銅脅迫下對(duì)葡萄酒酵母的生長(zhǎng)和酒精發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)原花色素和Cu2+均可在發(fā)酵初期對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、CO2釋放量、糖消耗和乙醇生成產(chǎn)生明顯的抑制作用，原花色素可以提高葡萄酒酵母在銅脅迫下抵抗有害作用的能力，并維持細(xì)胞的代謝活性。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析原花色素對(duì)釀酒酵母的影響，發(fā)現(xiàn)原花色素作用涉及6 個(gè)代謝途徑，包括維生素B6、硫胺素、氨基酸、氨酰基-tRNA、碳水化合物和類固醇代謝途徑。作者提出原花色素可以作為細(xì)胞外激活劑來(lái)增強(qiáng)維生素B6、硫胺素、碳水化合物和類固醇的代謝效率[17]。

在發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母能對(duì)各種物質(zhì)的脅迫和環(huán)境的變化做出相應(yīng)的代謝應(yīng)答。當(dāng)菌體受到外界脅迫時(shí)，釀酒酵母會(huì)通過(guò)改變其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)等來(lái)抵御外界傷害并維持自身活性[18]。SOD 與CAT 是生物氧化防御系統(tǒng)的抗氧化物酶[19-20]，MDA 作為脂類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物可以體現(xiàn)生物體內(nèi)氧化應(yīng)激程度。為探究蘋果多酚物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)釀酒酵母生理特性的影響，本研究通過(guò)在蘋果酒發(fā)酵體系中加入不同質(zhì)量濃度的綠原酸，揭示釀酒酵母在綠原酸脅迫下的代謝應(yīng)答，以期闡明蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中多酚影響釀酒酵母的代謝規(guī)律和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 31084，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。紅富士蘋果，中國(guó)山東煙臺(tái)，色澤紅潤(rùn)，無(wú)蟲(chóng)害和機(jī)械損傷，4 ℃冷藏備用。

綠原酸（純度為98%），上海阿拉丁生化科技有限公司；過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、總蛋白定量測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。3-辛醇（純度為98%）、酵母膏、蛋白胨、無(wú)水葡萄糖、氯化鈉，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。PBS磷酸鹽緩沖劑，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent6890N/5975，美國(guó)Agilent 公司；纖維萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美國(guó)Supeleo 公司；LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B生化培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；1510全波長(zhǎng)讀數(shù)儀，Thermo Fisher Scientific 公司；UV3600 紫外分光光度計(jì)，英國(guó)愛(ài)丁堡公司；恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；JYZ-V906 榨汁機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果汁的制備 參考肖媚等[7]的方法，略作修改。將紅富士蘋果洗凈、切塊、榨汁后用紗布過(guò)濾，取200 mL 于500 mL 錐形瓶中，分裝。65 ℃水浴鍋中恒溫水浴30 min，并不斷攪拌使其受熱均勻。水浴滅菌結(jié)束后，置于無(wú)菌操作臺(tái)紫外殺菌15 min，將綠原酸溶于超純水后用0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌。待蘋果汁自然冷卻后，加入終質(zhì)量濃度分別為0，0.1，1.0 g/L 的綠原酸。

1.3.2 蘋果汁的發(fā)酵 將釀酒酵母菌種接種于150 mL 液體YPD 培養(yǎng)基中（酵母膏1%，蛋白胨2%，無(wú)水葡萄糖2%，121 ℃滅菌20 min），于28℃、120 r/min 培養(yǎng)20 h，酵母活化培養(yǎng)兩代后，用無(wú)菌水洗滌2 次，收集菌體，用適量滅菌蘋果汁復(fù)溶后以1%接種量加入到含有不同質(zhì)量濃度綠原酸的蘋果汁中，28 ℃下靜置培養(yǎng)。每隔1 d 取樣，并置于-20 ℃保存待用。

1.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子歧化，生成過(guò)氧化氫以及單質(zhì)氧。水溶性四唑鹽WST-1 能夠和超氧陰離子反應(yīng)生成水溶性的染料[21]。首先解凍發(fā)酵樣品，取發(fā)酵液5 mL，4 ℃3 000 r/min 離心10 min，棄去上清液。菌液經(jīng)4 ℃PBS 溶液洗滌2 次，用PBS 溶液重懸。采用高通量組織研磨儀破碎酵母細(xì)胞，破碎條件參考文獻(xiàn)[22]～[23]，重復(fù)3 次。破碎后的釀酒酵母細(xì)胞于4 ℃5 000 r/min 離心10 min，取上清液并參照SOD 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 過(guò)氧化氫酶（CAT）的測(cè)定 采用鉬酸胺法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT），通過(guò)加入鉬酸銨能迅速終止CAT 分解H2O2的反應(yīng)，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物，于405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其變化量，計(jì)算釀酒酵母中CAT 的酶活[23-24]。發(fā)酵樣品處理方法同1.3.3 節(jié)所述，并參照CAT 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 丙二醛（MDA）的測(cè)定 過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）發(fā)生縮合反應(yīng)，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰[23-24]。發(fā)酵樣品處理方法同1.3.3 節(jié)所述，并參照MDA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中主要香氣成分的測(cè)定

1.3.6.1 香氣成分富集 參照Yang 等[25]方法，采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）富集蘋果酒中的香氣成分，將4.8 mL 蘋果酒發(fā)酵上清液和0.2 mL 質(zhì)量濃度為327.2 μg/L 的內(nèi)標(biāo)物3-辛醇加入到15 mL 裝有磁性轉(zhuǎn)子的頂空瓶中，加入2 g 的NaCl，于45 ℃條件下平衡10 min 后采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭頂空萃取40 min。

1.3.6.2 香氣成分檢測(cè) 將已吸附蘋果酒香氣成分的萃取頭插入氣相色譜柱進(jìn)口，250 ℃下解析5 min。色譜柱為HP-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），氣相色譜條件和質(zhì)譜條件參考楊穎迪等[22]和葉萌祺[26]的方法。

1.3.6.3 香氣成分定性與定量 通過(guò)對(duì)比NIST 05 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析，試驗(yàn)結(jié)果保留Qual＞60 的鑒定結(jié)果；以3-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)對(duì)樣品液中定性檢測(cè)出來(lái)的醇類、酸類、酯類等物質(zhì)的峰面積按公式（1）計(jì)算出各香氣成分的含量。

式中，C1——香氣成分質(zhì)量濃度（μg/L）；C0——內(nèi)標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度 （μg/L）；A1——香氣成分峰面積；A0——內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗(yàn)重復(fù)至少3 次，采用Excel 2016 處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Origin 2018 繪圖，SPSS 11.0 （IBM 公司） 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），檢測(cè)平均值的顯著性水平 （S-N-K法），顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是生物氧化防御系統(tǒng)的抗氧化物酶[19]。發(fā)酵過(guò)程中，綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母的SOD 活性影響如圖1所示。從圖1可以看出，在發(fā)酵第1 天，不同質(zhì)量濃度間SOD 活性具有顯著差異（P＜0.05），1.0 g/L 綠原酸促進(jìn)作用最為明顯，且此時(shí)SOD 酶活達(dá)到最高值（20.19±1.61）U/mg 蛋白。在發(fā)酵第2 天，對(duì)照組（0 g/L 綠原酸）、0.01 g/L 綠原酸、0.1 g/L 綠原酸發(fā)酵體系中，釀酒酵母胞內(nèi)SOD 活性逐漸增強(qiáng)，而1.0 g/L 綠原酸發(fā)酵體系中SOD 活性開(kāi)始減弱。發(fā)酵4 d 后，不同質(zhì)量濃度綠原酸發(fā)酵體系中釀酒酵母胞內(nèi)SOD 活性均逐漸降低，然而均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。上述結(jié)果分析表明綠原酸的存在提高了釀酒酵母胞內(nèi)SOD 活性。

圖1 不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母CICC 31084 的SOD 活性的影響Fig.1 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on SOD activity of Saccharomyces cerevisiae CICC 31084

2.2 綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響

過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）在釀酒酵母對(duì)H2O2引起的氧化脅迫中起著至關(guān)重要的作用[20]，通過(guò)測(cè)定在不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫下釀酒酵母胞內(nèi)抗氧化酶活性，探究綠原酸對(duì)釀酒酵母的氧化脅迫。由圖2可知，發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母CAT活性均呈先降低后升高的趨勢(shì)。在發(fā)酵第1 天，不同質(zhì)量濃度綠原酸作用下釀酒酵母CAT 活性與對(duì)照組均有顯著差異（P＜0.05）。在低質(zhì)量濃度0.01 g/L 綠原酸作用下釀酒酵母CAT 活性高于對(duì)照組，而在質(zhì)量濃度為0.1，1.0 g/L 綠原酸作用下釀酒酵母CAT 活性均低于對(duì)照組。發(fā)酵2 d 后，釀酒酵母CAT 活性開(kāi)始降低，在發(fā)酵4～6 d，CAT 活性降為最低，最低值分別為（4.27±0.43）U/mg 蛋白（0 g/L 綠原酸），（4.57±0.06）U/mg 蛋白（0.01 g/L 綠原酸），（1.31±0.08）U/mg 蛋白 （0.1 g/L 綠原酸），（0.40±0.02）U/mg 蛋白 （1.0 g/L 綠原酸）。發(fā)酵后期，釀酒酵母CAT 活性顯著增強(qiáng)，在綠原酸質(zhì)量濃度為0.01，0.1 g/L 的作用下，釀酒酵母活性高于對(duì)照組，高質(zhì)量濃度1.0 g/L 綠原酸低于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)果分析表明，低質(zhì)量濃度綠原酸（0.01 g/L）會(huì)提高整個(gè)發(fā)酵周期釀酒酵母CAT 活性，而高質(zhì)量濃度綠原酸（1.0 g/L）脅迫會(huì)降低釀酒酵母CAT 活性。

圖2 不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母CICC 31084 的CAT 活性的影響Fig.2 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on CAT activity of Saccharomyces cerevisiae CICC 31084

2.3 綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

丙二醛（MDA）作為膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，可以用來(lái)判斷釀酒酵母細(xì)胞膜氧化損傷程度[27]。發(fā)酵過(guò)程中不同質(zhì)量濃度的綠原酸對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)MDA 含量的影響，如圖3所示。從圖3可知，發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母胞內(nèi)MDA 含量呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢(shì)。在發(fā)酵前期，綠原酸的添加降低了釀酒酵母胞內(nèi)MDA 的含量，高質(zhì)量濃度1.0 g/L 綠原酸作用下MDA 含量最低，為（0.24±0.02）nmol/mg，與對(duì)照組相比具有顯著差異（P＜0.05）。發(fā)酵1 d 后細(xì)胞胞內(nèi)MDA 含量緩慢增加。發(fā)酵8 d 時(shí)，MDA 含量快速增加，分別達(dá)到最高值（8.64±0.30）nmol/mg （0 g/L 綠原酸），（12.42±0.23）nmol/mg（0.01 g/L 綠原酸），（13.38±0.27）nmol/mg（0.1 g/L 綠原酸），（11.40±0.48）nmol/mg（1.0 g/L 綠原酸）。發(fā)酵末期，細(xì)胞體內(nèi)MDA 含量降低，不同質(zhì)量濃度綠原酸作用MDA 含量均高于對(duì)照組，且有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，綠原酸的存在會(huì)降低發(fā)酵前期MDA 含量，提高發(fā)酵后期MDA 含量。

圖3 不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母CICC 31084 胞內(nèi)MDA 的影響Fig.3 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on intracellular MDA of Saccharomyces cerevisiae CICC 31084

2.4 綠原酸脅迫對(duì)蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵香氣生成的影響

香氣物質(zhì)是影響蘋果酒品質(zhì)的重要因素之一，根據(jù)前期文獻(xiàn)資料選取苯乙醇、辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯為蘋果酒關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析[28]。添加不同質(zhì)量濃度綠原酸對(duì)蘋果酒關(guān)鍵香氣成分的影響，如圖4所示，各關(guān)鍵香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度隨著蘋果酒發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在發(fā)酵中期達(dá)到最大值，后逐漸降低趨于穩(wěn)定。

苯乙醇（2-phenylethanol）變化如圖4a 所示。外源綠原酸的添加促進(jìn)苯乙醇的生成。0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中苯乙醇含量均高于對(duì)照組（0 g/L 外源綠原酸），且變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致，在發(fā)酵前4 d 苯乙醇含量逐漸增加，發(fā)酵4 d 后苯乙醇含量呈現(xiàn)波動(dòng)變化。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中，發(fā)酵1 d 的苯乙醇含量低于對(duì)照組，發(fā)酵1 d 后苯乙醇含量逐漸增加且高于對(duì)照組，發(fā)酵8 d后苯乙醇含量降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，質(zhì)量濃度為0.1，1.0 g/L 的外源綠原酸發(fā)酵體系中苯乙醇含量高于對(duì)照組，分別為（10 324.63±34.14）μg/L（0.1 g/L 外源綠原酸），（10 183.36±124.71）μg/L（1.0 g/L 外源綠原酸），（9 514.63±424.26）μg/L （0 g/L 外源綠原酸）。

發(fā)酵過(guò)程中辛酸乙酯（Ethyl octanoate）含量變化如圖4b 所示。在0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中，辛酸乙酯含量逐漸增加，發(fā)酵2 d 后趨于穩(wěn)定，在發(fā)酵6 d 后辛酸乙酯含量逐漸降低。在0.1 g/L外源綠原酸發(fā)酵體系中，辛酸乙酯含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均高于對(duì)照組，發(fā)酵第4 天時(shí)辛酸乙酯含量達(dá)到最高值，且明顯高于對(duì)照組，低質(zhì)量濃度外源綠原酸促進(jìn)辛酸乙酯的生成，發(fā)酵4 d 后辛酸乙酯含量逐漸減少。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中，發(fā)酵前期辛酸乙酯含量逐漸增加且低于對(duì)照組，發(fā)酵4 d 后辛酸乙酯含量高于對(duì)照組，發(fā)酵第6 天辛酸乙酯含量達(dá)到最高，而最高值低于0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中辛酸乙酯含量的最高值，發(fā)酵6 d 后辛酸乙酯含量逐漸降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，辛酸乙酯含量分別為（4 950.53±71.42）μg/L（0 g/L 外源綠原酸），（5 161.59±79.07）μg/L （0.1 g/L外源綠原酸），（5 639.33±20.51）μg/L（1.0 g/L 外源綠原酸）。在發(fā)酵后期，辛酸乙酯質(zhì)量濃度逐漸降低，不同質(zhì)量濃度綠原酸作用無(wú)顯著差異。

圖4 蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中添加不同質(zhì)量濃度綠原酸對(duì)關(guān)鍵香氣生成的影響Fig.4 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on key aroma component productions of Saccharomyces cerevisiae during cider fermentation

發(fā)酵過(guò)程中乙酸苯乙酯 （Phenethyl acetate concentration）含量變化如圖4c 所示。0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸苯乙酯含量變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致，在發(fā)酵前4 d 乙酸苯乙酯含量逐漸增加，至第4 天達(dá)到最高值，后逐漸降低，且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)乙酸苯乙酯含量略微高于對(duì)照組。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中，乙酸苯乙酯含量在發(fā)酵初期第1 天時(shí)低于對(duì)照組，發(fā)酵1 d 后乙酸苯乙酯含量逐漸增加，且明顯高于對(duì)照組，發(fā)酵6 d 后乙酸苯乙酯含量達(dá)到最高值，后逐漸降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乙酸苯乙酯含量分別為（765.49±36.69）μg/L（0 g/L 外源綠原酸），（772.39±40.66）μg/L （0.1 g/L 外源綠原酸），（977.37±5.39）μg/L（1.0 g/L 外源綠原酸）。

發(fā)酵過(guò)程中正己酸乙酯（Ethyl hexanoate）含量變化如圖4d 所示。正己酸乙酯含量呈先逐漸增加后逐漸降低的變化趨勢(shì)。0.1 g/L 外源綠原酸的添加明顯促進(jìn)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中正己酸乙酯的生成，而1.0 g/L 外源綠原酸的添加抑制了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中正己酸乙酯的生成。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，正己酸乙酯含量分別為（1 613.55±42.43）μg/L（0 g/L 外源綠原酸），（1 739.7873±67.44）μg/L（0.1 g/L 外源綠原酸），（1 343.82±45.97）μg/L（1.0 g/L 外源綠原酸）。

發(fā)酵過(guò)程中癸酸乙酯（Ethyl decanoate）含量變化如圖4e 所示。0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中，癸酸乙酯含量緩慢增加，發(fā)酵6 d 后癸酸乙酯含量逐漸降低。在0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中，癸酸乙酯含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均高于對(duì)照組，發(fā)酵第4 天時(shí)癸酸乙酯含量達(dá)到最高值，且明顯高于對(duì)照組，發(fā)酵4 d 后癸酸乙酯含量逐漸降低。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中，發(fā)酵前期癸酸乙酯含量逐漸增加且低于對(duì)照組，發(fā)酵4 d 后癸酸乙酯含量高于對(duì)照組，發(fā)酵第6 天癸酸乙酯含量達(dá)到最高，最高值低于0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系癸酸乙酯含量的最高值，發(fā)酵6 d 后癸酸乙酯含量逐漸降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，癸酸乙酯含量分別為（2 350.5±413.66）μg/L（0 g/L 外源綠原酸），（2 314.97±45.40）μg/L （0.1 g/L 外源綠原酸），（3 719.39±416.24）μg/L（1.0 g/L 外源綠原酸）。

發(fā)酵過(guò)程中乙酸異戊酯（Esoamyl acetate）含量變化如圖4f 所示。發(fā)酵過(guò)程中乙酸異戊酯含量呈先增加后逐漸降低的變化趨勢(shì)。發(fā)酵前期不同質(zhì)量濃度外源綠原酸作用效果較復(fù)雜，在發(fā)酵前3 d，添加外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸異戊酯含量低于對(duì)照組，此階段0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸異戊酯含量明顯小于對(duì)照組，發(fā)酵第4 天時(shí)添加外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸異戊酯含量開(kāi)始高于對(duì)照組。發(fā)酵中后期，外源綠原酸存在促進(jìn)乙酸異戊酯生成的作用，促進(jìn)效果與質(zhì)量濃度成正比。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乙酸異戊酯含量分別為（458.56±78.07）μg/L（0 g/L 外源綠原酸），（467.44±80.53）μg/L（0.1 g/L 外源綠原酸），（571.44±84.50）μg/L（1.0 g/L 外源綠原酸）。

對(duì)蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中不同質(zhì)量濃度外源綠原酸與關(guān)鍵香氣物質(zhì)生成量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)如表1所示。由表1可知，蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中苯乙醇、乙酸苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸異戊酯質(zhì)量濃度與外源綠原酸質(zhì)量濃度成正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.133，0.253，0.026，0.114。辛酸乙酯、正己酸乙酯與外源綠原酸質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.012，-0.248。

表1 蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中外源綠原酸質(zhì)量濃度與關(guān)鍵香氣成分生成量之間相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between chlorogenic acid mass concentration and key aroma component production during cider fermentation

3 結(jié)論

蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母CICC 31084 在綠原酸脅迫下，主要通過(guò)改變胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量來(lái)提高釀酒酵母的抗逆能力。其中，SOD 活性隨著綠原酸質(zhì)量濃度的升高而逐漸增加；低質(zhì)量濃度綠原酸脅迫促使釀酒酵母的CAT活性增加，高質(zhì)量濃度綠原酸脅迫降低了CAT 活性。綠原酸脅迫降低了發(fā)酵前期MDA 含量，發(fā)酵后期MDA 含量逐漸增加。蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中各關(guān)鍵香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在發(fā)酵中期，各香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，后逐漸降低并趨于穩(wěn)定。相關(guān)性分析表明關(guān)鍵香氣物質(zhì)苯乙醇、乙酸苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度與外源綠原酸質(zhì)量濃度成正相關(guān)關(guān)系；辛酸乙酯、正己酸乙酯的質(zhì)量濃度與外源綠原酸質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。