赭曲霉毒素A降解酶Af-OTd的酶學(xué)性質(zhì)分析

宋 佳，范 寰，閆 雪，王文杰，趙 晨*

（1 國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院 糧食儲(chǔ)運(yùn)國(guó)家工程研究中心 北京 100037 2 天津市畜牧獸醫(yī)研究所 天津 300381 3 新希望六和股份有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都 610023）

赭曲霉毒素包括7 種結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，其中分布最廣，毒性最大，對(duì)農(nóng)產(chǎn)及食品污染最嚴(yán)重，對(duì)人類(lèi)健康影響最大的是赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）[1]。OTA 主要由赭曲霉、青霉、炭黑曲霉等霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]，常見(jiàn)于霉變谷物、飼料、咖啡豆、堅(jiān)果、葡萄等食品中[3-6]，物理和化學(xué)性質(zhì)極其穩(wěn)定，在產(chǎn)品中很難將其去除或降解[7]。OTA 具有強(qiáng)烈的腎毒性[8]、肝毒性[9]、免疫毒性[10]、致畸性[11]和致癌性[12]，是繼黃曲霉毒素后又一個(gè)引起世界廣泛關(guān)注的真菌毒素。開(kāi)發(fā)高效環(huán)保的脫毒方法，減少或脫除食品及其原料中的赭曲霉毒素A，對(duì)提高糧食及食品質(zhì)量，保障國(guó)民食品安全具有重要意義。

生物脫毒主要是通過(guò)生物吸附或酶促反應(yīng)降解毒素或修飾毒素分子結(jié)構(gòu)而達(dá)到脫毒的目的，與物理、化學(xué)脫毒方法相比，具有特異性強(qiáng)、高效等優(yōu)點(diǎn)[13]，目前已成為脫毒領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，許多微生物如細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌以及一些蛋白酶能夠吸附或降解OTA[14]。其中降解OTA 的過(guò)程中可能涉及兩條途徑：（1） 通過(guò)水解酰胺鍵生成L-β-苯丙氨酸和OTα 兩種無(wú)毒水解產(chǎn)物；（2） 通過(guò)內(nèi)酯環(huán)的水解而降解OTA，最終降解產(chǎn)物為開(kāi)環(huán)的OTA 內(nèi)酯（OP-OTA），與OTA 具有相似的毒性，前者通常被認(rèn)為是真正的解毒途徑[15]。羧肽酶是最早發(fā)現(xiàn)的能夠降解OTA 為無(wú)毒產(chǎn)物的一種酶[16]，除此之外，某些過(guò)氧化物酶、蛋白水解酶、脂酶都被發(fā)現(xiàn)可以降解OTA[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)室前期從糞產(chǎn)堿菌中鑒定出一種酰胺水解酶（WP_123049291.1），可高效降解OTA，命名為Af-OTd。本研究將af-OTd 基因在大腸桿菌BL21（DE3）中克隆、表達(dá)和純化，并探究溫度、pH、酒精含量、金屬離子等條件對(duì)重組表達(dá)后的Af-OTd 的酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞產(chǎn)堿菌、蛋白表達(dá)菌株大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）、表達(dá)載體pET28a（+），由本實(shí)驗(yàn)室保存；OTA 標(biāo)準(zhǔn)品，青島普瑞邦生物工程有限公司；LA Taq 酶，Takara 生物工程有限公司；Nco Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 連接酶，NEB 生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Gene Explorer PCR 儀，杭州博日科技有限公司；凝膠成像儀、AKTApurifier 蛋白快速純化系統(tǒng)，美國(guó)GE 公司；LC-10Avp plus 高效液相色譜儀，日本島津公司；低溫冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pET28a（+）-Af-OTd 的構(gòu)建 根據(jù)NCBI 序列信息，設(shè)計(jì)引物Af-OTd-F：CAGTC CATGGATGGGCGCCAGTAATCCCATGATG，Af-OTd-R：CAGTCTCGAGCGGCTTTTTGTTCTCCATC。以糞產(chǎn)堿菌基因組為模板擴(kuò)增目的基因，純化后的DNA 片段和pET28a （+） 質(zhì)粒分別進(jìn)行NcoⅠ，Xho Ⅰ雙酶切，膠回收正確片段進(jìn)行T-4 ligase 連接及電轉(zhuǎn)化，完成pET28a（+）-Af-OTd 重組載體的構(gòu)建并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆子用于下一步的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

1.3.2 Af-OTd 降解酶的誘導(dǎo)表達(dá) 將1.3.1 節(jié)測(cè)序結(jié)果正確的pET28a（+）-Af-OTd 陽(yáng)性克隆子接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基（kan+質(zhì)量濃度：50 μg/mL） 中，37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)16 h 進(jìn)行活化。以1%的比例轉(zhuǎn)種于200 mL 含有相同抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)至OD600nm=0.6～0.8。將菌液分裝為4 等份于300 mL 搖瓶中，每份40 mL，并 按終濃度0，0.1，0.4，1 mmol/L 添加IPTG，置于25 ℃，180 r/min 過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)Af-OTd蛋白。離心收集菌體并用Binding Buffer（20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑；pH=7.4） 洗滌菌體2 次，10 mL Binding Buffer緩沖液重新懸浮菌體后于冰上超聲破碎。將充分破碎后的菌液4 ℃，12 000 r/min 離心30 min 去除細(xì)胞碎片，取上清離心，再次取上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，得Af-OTd 粗酶液。

通過(guò)AKTA 蛋白純化系統(tǒng)純化胞內(nèi)蛋白：用Binding Buffer 平衡Ni+層析柱后，Elution Buffer（20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L Imidazole；pH=7.4）洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)洗脫峰收集純化后的蛋白液。將所收集的蛋白液倒入超濾離心管 （3 ku，Millipore） 中，4 ℃，5 000×g 離心3 h，截留的上清液用保存緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，50%甘油；pH=7.4）重懸，-80 ℃保存，用于后續(xù)酶活測(cè)定。

1.3.3 Af-OTd 降解酶降解OTA 活性測(cè)定 取上述酶液990 μL 加入10 μL OTA 儲(chǔ)備溶液（甲醇∶乙腈=1∶1 溶解OTA 標(biāo)準(zhǔn)品，配成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液），37 ℃分別反應(yīng)15 min 和30 min 時(shí)取樣，HPLC-FLD 檢測(cè)OTA 濃度。色譜柱：C18 柱，柱長(zhǎng)150 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：乙腈∶水∶冰乙酸= 96∶102∶2；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)333 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。

1.3.4 溫度對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響 以O(shè)TA 降解率測(cè)定的方法為基礎(chǔ)，設(shè)定反應(yīng)溫度為30，40，50，60，70 ℃。反應(yīng)體系1 000 μL：990 μL酶液+10 μL OTA 儲(chǔ)備液。將反應(yīng)體系混勻后于不同溫度下反應(yīng)15 min 后加入等體積的流動(dòng)相終止反應(yīng)。檢測(cè)OTA 的殘留量，計(jì)算OTA 的降解率，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.3.5 pH 對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響 以O(shè)TA 降解率測(cè)定的方法為基礎(chǔ)，設(shè)定反應(yīng)pH 值為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0。反應(yīng)體系1 000 μL：990 μL 酶液+10 μL OTA 儲(chǔ)備液。將反應(yīng)體系混勻后于最適溫度下反應(yīng)15 min 后加入等體積的流動(dòng)相終止反應(yīng)。檢測(cè)OTA 的殘留量，計(jì)算OTA 的降解率，確定最佳反應(yīng)pH 值。

1.3.6 酒精含量對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響 以O(shè)TA 降解率測(cè)定的方法為基礎(chǔ)，設(shè)定反應(yīng)酒精含量為0%，2%，4%，6%，8%。反應(yīng)體系1 000 μL：910 μL 酶液+80 μL 不同濃度酒精+10 μL OTA 儲(chǔ)備液。將反應(yīng)體系混勻后于最適溫度和最適pH 條件下反應(yīng)15 min 后加入等體積的流動(dòng)相終止反應(yīng)。檢測(cè)OTA 的殘留量，計(jì)算OTA 的降解率，確定酒精含量對(duì)酶活的影響。

1.3.7 金屬離子及EDTA 對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響 選取對(duì)蛋白酶具有影響作用的常見(jiàn)金屬陽(yáng)離子Ca2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，K+及金屬螯合劑EDTA，加入下述反應(yīng)體系中，使其終濃度為1 mmol/L。反應(yīng)體系1：980 μL 酶液+10 μL 100 mmol/L 金屬離子/EDTA 溶液+10 μL OTA 儲(chǔ)備液。反應(yīng)體系2：980 μL 酶液+5 μL 200 mmol/L金屬離子溶液+5 μL 200 mmol/L EDTA 溶液+10 μL OTA 儲(chǔ)備液。將反應(yīng)體系混勻后于最適溫度和最適pH 條件下反應(yīng)15 min 后加入等體積的流動(dòng)相以終止反應(yīng)。檢測(cè)OTA 的殘留量，計(jì)算OTA的降解率，初步確定金屬離子對(duì)酶活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Af-OTd 降解酶的表達(dá)與純化

通 過(guò)signalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析，Af-OTd 具有信號(hào)肽。為獲得胞內(nèi)表達(dá)Af-OTd，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增除信號(hào)肽外序列，并將信號(hào)肽后第一位氨基酸谷氨酰胺（CAA）替換為甘氨酸 （GGC），C 端與6xHis 標(biāo)簽融合表達(dá)。通過(guò)PCR 擴(kuò)增后得到的特異性目的基因條帶與pET28a（+）連接，成功構(gòu)建pET28a（+）-Af-OTd重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的重組菌株用于后續(xù)蛋白的表達(dá)純化。

重組菌株菌液分別以0，0.1，0.4，1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)，胞內(nèi)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠檢測(cè)，結(jié)果如圖1a 所示，1～6 泳道均在45 ku 附近出大小與預(yù)期相符的蛋白條帶，其中1、3、5 泳道（經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)）條帶比2、4、6 泳道（未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)）條帶顏色更深，說(shuō)明Af-OTd 基因在E.coli BL21（DE3）中成功表達(dá)，且IPTG 終濃度0.4 mmol/L 為蛋白最適誘導(dǎo)濃度。

圖1 Af-OTd 蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig.1 SDS-PAGE gel electrophoresis of Af-OTd protein

2.2 Af-OTd 降解酶酶活性的分析

按1.3.3 節(jié)反應(yīng)體系加入Af-OTd 純化后酶液和10 μL OTA 儲(chǔ)備液，OTA 終質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/mL。反應(yīng)時(shí)間2 min 時(shí)，HPLC 測(cè)定結(jié)果如圖2b 所示，與圖2a 相比，保留時(shí)間在8 min 左右的OTA 峰明顯縮小，經(jīng)計(jì)算，OTA 降解率超過(guò)60%。同時(shí)，在保留時(shí)間4.5 min 左右出現(xiàn)新峰，根據(jù)文獻(xiàn)[19]所述，該峰為降解產(chǎn)物OTα。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至15 min 時(shí)，OTA 被Af-OTd 完全降解，該結(jié)果說(shuō)明，純化的Af-OTd 具有高效的OTA 降解活性。

圖2 HPLC 檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間OTA 的色譜圖Fig2 HPLC Chromatograms of OTA for different reaction times

為利于后續(xù)酶學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果分析，將Af-OTd 酶液用保存緩沖液按照200，400，600，800，1 000 的倍數(shù)對(duì)酶液進(jìn)行稀釋?zhuān)糜谙嗤磻?yīng)體系中，在反應(yīng)時(shí)間為15 min 和30 min 時(shí)，分別加等體積的流動(dòng)相終止反應(yīng)。OTA 降解率結(jié)果如圖3所示，當(dāng)Af-OTd 稀釋600 倍，反應(yīng)時(shí)間15 min時(shí)，OTA 降解率未到95%，此時(shí)，在HLPC 色譜圖中便于觀察OTA 含量；反應(yīng)時(shí)間30 min 時(shí)，OTA降解率接近100%，該稀釋度利于對(duì)酶活在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，故后續(xù)試驗(yàn)使用稀釋600 倍的Af-OTd，取樣時(shí)間定為15 min。

圖3 不同稀釋倍數(shù)對(duì)Af-OTd 酶活性的影響Fig.3 Effects of different dilution times on Af-OTd enzyme activity

2.3 溫度對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響

Af-OTd 產(chǎn)生菌生存環(huán)境在30 ℃，本研究通過(guò)檢測(cè)Af-OTd 在不同溫度下的降解活性，確定其最適酶活溫度。由圖4可知，隨著溫度的升高，降解酶Af-OTd 對(duì)OTA 降解率逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)，OTA 降解率達(dá)99%，溫度繼續(xù)升高，OTA 降解率則呈下降趨勢(shì)，故50 ℃為Af-OTd降解OTA 的最適溫度。當(dāng)高于50 ℃時(shí)，Af-OTd活力開(kāi)始下降，在70 ℃時(shí)，OTA 降解率依然可以保持在60%左右，說(shuō)明高溫可能使酶分子表面構(gòu)象發(fā)生變化，而Af-OTd 已具有較好的耐高溫能力。

圖4 不同溫度對(duì)Af-OTd 酶活性的影響Fig.4 Effects of different temperature on Af-OTd enzyme activity

2.4 pH 對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響

pH 對(duì)酶活具有較大影響[20]，因此探究Af-OTd在不同pH 條件下的活性是十分必要的。按1.3.5節(jié)反應(yīng)體系在最適溫度50 ℃條件下反應(yīng)15 min后終止，計(jì)算OTA 降解率。圖5中可知，pH=7.5 是降解酶Af-OTd 的最適pH 值，OTA 降解率最高，堿性增強(qiáng)，OTA 降解率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)在pH<7的酸性條件下，降解效率大幅降低，該結(jié)果說(shuō)明Af-OTd 的耐酸性較弱。

圖5 不同pH 值對(duì)Af-OTd 酶活性的影響Fig.5 Effects of different pH values on Af-OTd enzyme activity

2.5 酒精含量對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響

OTA 常見(jiàn)于葡萄酒中[21]，因此本小節(jié)通過(guò)檢測(cè)Af-OTd 在不同酒精濃度條件下對(duì)OTA 的降解活性，探究其酒精耐受情況，為后續(xù)在葡萄酒生物脫毒領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。不同酒精濃度的反應(yīng)體系在pH=7.5，溫度為50 ℃條件下孵育15 min，OTA 降解率結(jié)果如圖6所示，酒精會(huì)降低降解酶Af-OTd 的酶活力，且隨著反應(yīng)體系內(nèi)酒精濃度的不斷加大，OTA 降解率大幅度降低，當(dāng)反應(yīng)體系內(nèi)酒精含量加至8%時(shí)，降解酶Af-OTd 的酶活力幾乎降至0，此時(shí)為其最大酒精耐受度。

圖6 酒精含量對(duì)Af-OTd 酶活性的影響Fig.6 Effect of alcohol content on Af-OTd enzyme activity

2.6 金屬離子及EDTA 對(duì)降解酶Af-OTd 酶活性的影響

水解酶類(lèi)蛋白一般為金屬蛋白，具有金屬中心結(jié)構(gòu)[22-23]。為探究Af-OTd 活性與金屬離子的關(guān)系，本試驗(yàn)使用金屬螯合劑EDTA 及部分金屬離子：Ca2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，K+探究其對(duì)Af-OTd 酶活性的影響。1 mmol/L 的EDTA 可完全抑制Af-OTd 降解活性，初步判斷該酶為金屬蛋白結(jié)構(gòu)。以未加金屬離子的反應(yīng)體系為對(duì)照，7 種金屬離子對(duì)Af-OTd 的酶活都具有抑制效果，其中Co2+，Cu2+，Mn2+，Zn2+抑制效果最為明顯，均超過(guò)90%（圖7）。為進(jìn)一步驗(yàn)證是否為金屬離子對(duì)Af-OTd 酶活產(chǎn)生的影響，在各反應(yīng)體系中同時(shí)加入1 mmol/L 金屬離子和1 mmol/L EDTA，7 種金屬離子對(duì)Af-OTd 酶活性的抑制效果均得到緩解（圖7）。

圖7 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)Af-OTd 酶活性的影響Fig.7 Effects of metal ions and chemical reagents on Af-OTd enzyme activity

添加等摩爾Co2+與EDTA、Zn2+與EDTA 的兩組反應(yīng)，Af-OTd 酶活性不僅抑制效果被緩解，還呈現(xiàn)出促進(jìn)效果，初步分析，在調(diào)節(jié)1 mmol/L EDTA 溶液的pH 值時(shí)，EDTA 溶液有微量稀釋?zhuān)瑢?dǎo)致反應(yīng)體系中微量金屬離子剩余促進(jìn)了Af-OTd 酶活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，分別在反應(yīng)體系中添加1，10，100，1 000 μmol/L 的Co2+、Zn2+，探究微量金屬離子對(duì)Af-OTd 酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。Co2+，Zn2+在1，10 μmol/L 條件下，均促進(jìn)Af-OTd降解活性，當(dāng)繼續(xù)增大濃度到100 μmol/L 時(shí)，Co2+，Zn2+再次表現(xiàn)出抑制Af-OTd 酶活。

圖8 Co2+和Zn2+對(duì)Af-OTd 酶活性的影響Fig.8 Effects of Co2+ and Zn2+ on Af-OTd enzyme activity

綜上所述，金屬離子對(duì)降解酶Af-OTd 的酶活性具有顯著影響，其影響機(jī)制將在接下來(lái)對(duì)Af-OTd 的三維結(jié)構(gòu)解析工作中進(jìn)行深入分析。

3 結(jié)論

將實(shí)驗(yàn)室已獲得的OTA 降解酶Af-OTd 在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)及蛋白純化，并對(duì)部分酶學(xué)特性進(jìn)行初步探索。試驗(yàn)結(jié)果表明：Af-OTd 的酶活性受溫度、pH 值、酒精含量和金屬離子的影響。該酶表現(xiàn)出較寬的溫度范圍（30～70 ℃），50℃為其最適反應(yīng)溫度；該酶在弱堿性條件下的酶活更好，最適pH 值為7.5，酸性條件下酶活受影響較明顯；該酶對(duì)酒精呈現(xiàn)一定的耐受能力，當(dāng)酒精含量為4%時(shí)，OTA 降解率仍可維持在60%左右，然而當(dāng)酒精含量大于8%，OTA 降解率幾乎降為0。而常見(jiàn)赭曲霉毒素A 的葡萄酒酒精含量在8%～15%之間[24]，食品、飼料、包括葡萄酒的pH 值都為中性偏酸性[25]，因此后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)著重通過(guò)易錯(cuò)PCR 或定點(diǎn)突變等手段降低降解酶Af-OTd 的最適pH 值，提高其酒精耐受度，從而提升酶的品質(zhì)。同時(shí)，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Af-OTd 酶活與金屬離子有著密切的關(guān)系。一方面，在金屬螯合劑EDTA 及7種金屬離子單獨(dú)存在的反應(yīng)體系中，Af-OTd 的相對(duì)酶活力都出現(xiàn)不同程度的下降；另一方面，當(dāng)EDTA 分別與7 種金屬離子同時(shí)在反應(yīng)體系中時(shí)，相對(duì)酶活力較前一試驗(yàn)都有明顯提升。該現(xiàn)象可能與多種作用機(jī)制有關(guān)，如引起酶蛋白表面電荷的變化，從而影響酶的活性[26]；在此過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，微摩級(jí)的Co2+和Zn2+離子對(duì)Af-OTd 酶活性有明顯的促進(jìn)作用，這可能是Co2+和Zn2+離子作為輔因子與酶形成復(fù)合物，成為活性中心的組成部分[27]，也可能是作為酶的激活劑或輔基激活提高酶活力[28]，具體機(jī)制還需通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步分析。

本文實(shí)現(xiàn)Af-OTd 異源高效表達(dá)并完成該酶的酶學(xué)性質(zhì)的初步探究，為Af-OTd 性能的進(jìn)一步優(yōu)化積累了數(shù)據(jù)，將為促進(jìn)毒素脫毒酶在相關(guān)行業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。