富硒堇葉碎米薺中硒化合物的形態(tài)分析與鑒定

葉 梅，虞銳鵬，叢 欣，陳尚衛(wèi)，朱 松*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.恩施德源健康科技發(fā)展有限公司，湖北 恩施 445000）

硒是一種人體必需的微量元素，參與機(jī)體許多重要的代謝過程，適量的硒能起到抗氧化防御、維持氧化還原平衡作用，有效改善免疫系統(tǒng)功能［1-2］，降低患癌風(fēng)險(xiǎn)［3］；然而其不能在人體內(nèi)自主合成，須通過外界攝入維持正常水平。硒在自然界中分為有機(jī)硒和無機(jī)硒：無機(jī)硒主要為Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ），對機(jī)體的安全閾值較低；有機(jī)硒包括硒蛋白、硒肽、硒代氨基酸等經(jīng)代謝產(chǎn)生的一系列含硒化合物，對機(jī)體的安全閾值較高，生物利用度好［4］。因此，對于72%國土面積有不同程度缺硒的中國，科學(xué)安全高效地利用有機(jī)硒尤為重要［5］。

堇葉碎米薺是一種典型的富硒植物，能通過自身代謝途徑將無機(jī)硒高效地轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒［6-7］，2020年國家衛(wèi)生健康委員會已將堇葉碎米薺列為新食品原料。然而，目前對有機(jī)硒化合物的檢測手段大多是通過高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）［8-9］和高效液相色譜-氫化物原子熒光光譜（HPLC-HG-AFS）分析幾種常見的硒代氨基酸［10-11］，這主要是受限于硒化合物標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量與種類［12］。除此之外的未知硒化合物，必須采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定［13-14］。

液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)常用的離子源為電噴霧電離（ESI）源，不受多原子干擾，可用于硒的特異性檢測，且高分辨質(zhì)譜能很好地解決ICP-MS 受色譜分辨率限制而產(chǎn)生的共洗脫問題［13］。但隨著分辨率的提高，由于許多伴生的易電離物質(zhì)產(chǎn)生干擾，使得硒化合物的信號受到強(qiáng)烈抑制，而背景值逐漸升高（相較于ICP-MS 高2 個(gè)數(shù)量級），導(dǎo)致靈敏度下降。這就需要通過多維色譜分離純化、凍干濃縮等步驟獲得較高濃度和純度的含硒化合物［15］。常用的高分辨質(zhì)譜分析器主要包括飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）、軌道離子阱質(zhì)譜（Orbitrap MS）和傅里葉變換質(zhì)譜（FT-ICR-MS），其中Orbitrap MS 有利于對大分子量（500～1 000 Da）化合物的分析，但鑒定的硒化合物不夠全面［16-17］。FT-ICR-MS雖然具有極高的同位素保真度，但與液相色譜的兼容程度需進(jìn)一步改善［13］。TOF MS在色譜模式下的高數(shù)據(jù)采集速度使其能與超高效液相色譜（UPLC）耦合，從而在相對復(fù)雜的樣品中檢測大量的含硒化合物，一定程度上彌補(bǔ)了ESI 離子源的不足，是有利于鑒定低分子量硒化合物的質(zhì)譜儀器［13，18-19］。如Ward 等［20］將不同富硒酵母的硒化合物，經(jīng)超濾膜過濾截取、凍干復(fù)溶后，直接進(jìn)高效液相色譜-電噴霧電離源高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-ESI Q-TOF MS），測定了超過100 種含硒化合物。目前運(yùn)用液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用鑒定的富硒樣品絕大多數(shù)是蛋白含量較高，研究較為透徹的富硒酵母，對富硒植物中硒化合物的研究較少。本文以富硒堇葉碎米薺為研究對象，在HPLC-ICP-MS 定量分析常見硒化合物的基礎(chǔ)上，通過3 kDa 超濾離心管去除大分子雜質(zhì)、凍干濃縮等方法，采用超高效液相色譜-電噴霧電離源高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-Triple TOF MS）實(shí)現(xiàn)了對富硒堇葉碎米薺中未知硒化合物的鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

U3000 高效液相色譜儀、iCAP TQ 三重四極桿電感耦合等離子質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；SCIEX ExionLC?AC超高效液相色譜、X500R Triple TOF MS 高分辨質(zhì)譜（美國AB SCIEX 公司）；恒溫金屬浴磁力攪拌器（德國IKA 公司）；5804R 臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Mars6 微波消解儀（美國CEM 公司）；LE204E 分析天平、FiveEasy Plus pH 計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；3 kDa 超濾離心管（15 mL，美國Millipore 公司）；冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TechMate C18-ST 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本Shiseido 公司）；Kinetex F5 超高效液相五氟苯基柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國Phenomenex公司）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）（中國計(jì)量科學(xué)院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；富硒堇葉碎米薺干粉（恩施德源健康科技發(fā)展有限公司）；堿性蛋白酶（諾維信生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶、蛋白酶K（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；磷酸氫二銨、10%四丁基氫氧化銨水溶液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硝酸、甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，美國Tedia公司）。實(shí)驗(yàn)所用超純水由Milli-Q系統(tǒng)（電阻率為18.2 MΩ·cm，美國Millipore公司）制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ICP-MS 測定總硒 取0.15 g富硒堇葉碎米薺干粉于微波消解管中，加3 mL 硝酸，冷消化過夜后加入5 mL 水，于微波消解儀中消解2 h。將消解后的溶液用水定容至相應(yīng)體積，充分搖勻。取約15 mL，過0.22 μm尼龍膜，于4 ℃保存待測。樣品平行實(shí)驗(yàn)3次，同時(shí)做試劑空白。

1.2.2 HPLC-ICP-MS 測定硒形態(tài) 混合硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取466.5 μL Se（Ⅳ）、482.0 μL Se（Ⅵ）、575.0 μL MeSeCys、452.5 μL SeCys2、507.5 μL SeMet溶液，用水定容于10 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的硒化合物儲備液（以硒計(jì)）?；旌吓渲瞥?00 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（以硒計(jì)），置于4 ℃冰箱保存。

樣品前處理：稱取0.1 g 富硒堇葉碎米薺干粉，經(jīng)5%堿性蛋白酶-胰蛋白酶-蛋白酶K 酶解后，400 r/min磁力攪拌4 h。4 ℃下以4 000 r/min離心30 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

HPLC條件：色譜柱為TechMate C18-ST反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為30 mmol/L磷酸氫二銨、0.5 mmol/L四丁基氫氧化銨、3%甲醇，以10%甲酸調(diào)流動相pH為6.0。柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。進(jìn)樣量為10 μL，分析時(shí)間為10 min。

ICP-MS條件：射頻功率為1 550 W，冷卻氣流量為14 L/min，輔助氣流量為0.8 L/min，霧化氣流量為1.025 L/min，O2流量為0.326 mL/min，泵轉(zhuǎn)速為40 r/min，測定模式為TQ-O2模式，Q1設(shè)置分析質(zhì)量數(shù)為m/z=80，Q3設(shè)置質(zhì)量數(shù)為m/z=96。

1.2.3 UPLC-ESI-Triple TOF MS 測定未知硒化合物 樣品前處理：將0.5 g 富硒堇葉碎米薺干粉經(jīng)酶解后，離心取上清液過15 mL 3 kDa 超濾離心管，4 000 r/min 離心2 h，-20 ℃冷凍干燥后，以1 mL初始流動相復(fù)溶，4 ℃下以14 000 r/min高速離心5 min，取上清液待檢測。

UPLC 條件：Kinetex F5 超高效液相五氟苯基柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫為40 ℃，進(jìn)樣盤溫度為4 ℃。流動相：A 為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸-水溶液，B 為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，3% B；1～15 min，3%～95% B；15～18 min，95% B；18.1～20 min，95%～3%B。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

ESI-Triple TOF MS 條件：電噴霧（ESI）正離子源，氣簾氣（CUR）為241 kPa；霧化氣（GS1）為379 kPa；輔助氣（GS2）為379 kPa；噴霧電壓（ISVF）為5 500 V；離子源溫度（TEM）為550 ℃，IDA 模式下設(shè)置去簇電壓（DP）為60 V，碰撞電壓（CE）為35 V，碰撞電壓差（CES）為15 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 富硒堇葉碎米薺中總硒及已知硒形態(tài)的含量

采用ICP-MS 測得富硒堇葉碎米薺的總硒含量為2 853.5 mg/kg；經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解后，采用HPLC-ICP-MS進(jìn)行形態(tài)分析，外標(biāo)法定量計(jì)算該堇葉碎米薺中5種硒形態(tài)SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）的含量分別為2 154.1、18.5、225.8、4.5、52.3 mg/kg。結(jié)果表明，該堇葉碎米薺中主要硒形態(tài)為有機(jī)硒（以SeCys2為主），有機(jī)硒含量達(dá)到總硒含量的76.3%?；鞓?biāo)和富硒堇葉碎米薺的HPLC-ICP-MS 圖如圖1所示，可見該堇葉碎米薺中存在多種微量的未知硒化合物，需進(jìn)一步采用高分辨質(zhì)譜分析鑒定。

圖1 200 μg/L混標(biāo)（以硒計(jì)）（A）和富硒堇葉碎米薺（B）的HPLC-ICP-MS圖Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatograms of 200 μg/L（as Se）mixed standard solution（A）and Se-enriched C. Violifolia（B）peak：1. SeCys2；2. MeSeCys；3. Se（Ⅳ）；4. SeMet；5. Se（Ⅵ）

2.2 富硒堇葉碎米薺中未知硒化合物的鑒定

2.2.1 數(shù)據(jù)依賴型掃描和動態(tài)背景扣除

Triple TOF 高分辨系統(tǒng)的采集速度高達(dá)100 Hz，采用數(shù)據(jù)依賴型掃描（IDA）［21］和動態(tài)背景扣除（DBS）的數(shù)據(jù)采集模式，能夠使?jié)饪s復(fù)溶后的堇葉碎米薺樣品經(jīng)一次進(jìn)樣后同時(shí)獲得高質(zhì)量的全掃描TOF MS譜圖和全面的TOF MS/MS譜圖。其中TOF MS譜圖的掃描范圍為m/z100～1 000；IDA模式選擇獲得15個(gè)產(chǎn)物離子的TOF MS/MS 譜圖，掃描范圍為m/z50～1 000。DBS可以過濾干擾雜質(zhì)，在通過高分辨和精確質(zhì)量數(shù)全掃描發(fā)現(xiàn)主要化學(xué)成分的同時(shí)，保證目標(biāo)物得到高質(zhì)量的TOF MS/MS 譜圖，這些高分辨率和精確質(zhì)量數(shù)譜圖可用于對目標(biāo)物的主要化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)闡明與確證。

2.2.2 同位素過濾和質(zhì)量虧損過濾

硒是一種同位素分布特征明顯的元素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硒有6個(gè)同位素峰，74Se同位素峰的豐度非常小，僅占最高豐度80Se 的1.79%。而76Se、77Se、78Se、80Se、82Se 同位素的豐度比約為19∶15∶48∶100∶18，可利用該特征通過同位素過濾方法挖掘數(shù)據(jù)，找到符合硒同位素分布的質(zhì)譜圖，進(jìn)而找到可能的含硒有機(jī)物。對于可能含有2～3個(gè)硒的有機(jī)小分子物質(zhì)，則須先通過元素組成計(jì)算工具M(jìn)ass Calculators得到不同的硒同位素分布情況，再進(jìn)行同位素過濾。需要注意的是，由于有時(shí)譜圖干涉或同位素強(qiáng)度比缺乏保真度，須通過人工處理進(jìn)行再次確認(rèn)［13］。

另外，硒的質(zhì)量虧損約為921 mDa，與常見元素有一定差異，因此也可利用特征質(zhì)量虧損過濾進(jìn)行含硒有機(jī)物的確認(rèn)［18］。

2.2.3 硒化合物分子式的確認(rèn)及結(jié)構(gòu)鑒定

依據(jù)上述步驟，除HPLC-ICP-MS 形態(tài)分析的5 種硒化合物外，本實(shí)驗(yàn)通過UPLC-ESI-Triple TOF MS 鑒定［22］出15 種硒化合物，其中有7 種已被報(bào)道（如表1）。在8 種未報(bào)道的硒化合物中，提出了3 種硒化合物的結(jié)構(gòu)式，分別為C4H7NO2Se（［M +H］+的m/z為181.971 5）、C5H8O2Se（［M +H］+的m/z為180.976 2）、C7H9NO2Se（［M+H］+的m/z為219.987 4），詳細(xì)的質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)特征信息見表2。以下是3種硒化合物結(jié)構(gòu)的鑒定過程。

表1 富硒堇葉碎米薺中鑒定的15種硒化合物Table 1 Se compounds identified in Se-enriched C. Violifolia

表2 富硒堇葉碎米薺中鑒定出的硒化合物的一級和二級質(zhì)譜信息Table 2 MS and MS/MS informations of Se compounds identified in Se-enriched C. Violifolia

2.2.3.1 C4H7NO2Se 通過同位素過濾和質(zhì)量虧損過濾，在保留時(shí)間3.05 min 位置，找到m/z為181.971 5 的化合物加氫母離子，其同位素分布和質(zhì)量虧損符合硒化合物的特征，提取離子流（XIC）圖和TOF MS 譜圖分別見圖2A、B。為進(jìn)一步確認(rèn)該化合物的元素組成，將其TOF MS 譜圖與Formular Finder的MS Details相鏈接，基于其精確質(zhì)量去除大量元素組成，設(shè)置最大元素組成為C50H200N10S5Se5以過濾最大和最小的潛在原子數(shù)量和原子類型，留下可能的元素組成形成元素組成列表。根據(jù)MS Rank 和Δppm（化合物母離子的精確質(zhì)量數(shù)和理論質(zhì)量數(shù)的偏差）對所有可能的結(jié)果進(jìn)行排序，Δppm 越小，表明提出的m/z與精確的單同位素質(zhì)量越接近，元素組成的可信度越高。另外，還需考慮元素組成的不飽和度（RDB值）是否符合組成化合物的規(guī)律。結(jié)果表明，該化合物的分子式僅有1 種元素組成為C4H7NO2Se，Δppm 為0.1 ppm，RDB 值為3，可信度較高，又由于該化合物的m/z值相對較低，分子組成簡單，其元素組成可以確定。根據(jù)Far等［15］的報(bào)道，該化合物的M+H 峰在富硒酵母中被鑒定為某些化合物的裂解產(chǎn)物，對應(yīng)于硒同型半胱氨酸（SeHCys）的源內(nèi)片段，如圖2C的結(jié)構(gòu)圖所示。TOF MS/MS譜圖（圖2C）通過Formular Finder擬合得到的分子組成與一級質(zhì)譜完全一致，MS Rank 和MS/MS Rank 均為1 時(shí)，其一級質(zhì)譜Δppm 為0.6 ppm，RDB 值為3，二級質(zhì)譜Δppm 為3.8 ppm。TOF MS/MS 譜圖中響應(yīng)值最高的m/z135.966 4 峰對應(yīng)的裂解片段為C3H6NSe，為母離子失去羧基（—COOH）后形成碳碳雙鍵（C====C）所得，與Far［15］和Ouerdane［16］的報(bào)道一致。且二級質(zhì)譜擬合出的其他可能的碎片CHSe、C2H5Se等也證實(shí)了該結(jié)構(gòu)的合理性。

圖2 硒化合物C4H7NO2Se的XIC圖（A）、MS圖（B）、MS/MS圖和結(jié)構(gòu)式（C）Fig.2 Extracted ion chromatogram（XIC，A），MS spectrum（B），MS/MS spectrum and putative chemical structural formula（C）of Se compound C4H7NO2Se

2.2.3.2 C5H8O2Sem/z為180.976 2的峰經(jīng)同位素過濾和質(zhì)量虧損過濾后，通過人工驗(yàn)證確認(rèn)為硒化合物，其保留時(shí)間為1.24 min，XIC圖和相應(yīng)TOF MS譜圖如圖3A、B所示。通過Formular Finder模式，發(fā)現(xiàn)該峰為某含硒化合物的M+H 峰，基于該M+H 峰的精確質(zhì)量數(shù)和最大元素組成擬合形成其所有可能的元素組成列表。根據(jù)MS Rank 和Δppm 對所有可能的元素組成進(jìn)行排序，當(dāng)元素組成為C5H8O280Se時(shí)，其MS Rank 為1，Δppm 為-0.2 ppm，RDB 值為3；當(dāng)元素組成為C5H8O278Se 時(shí)，其MS Rank 為1，Δppm 為0.5 ppm。該化合物的母離子在同位素80Se 和78Se 的精確質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)偏差均小于5 ppm，同位素豐度之比為100∶45.3，與理論離子比例偏差小于10%，表明該化合物的元素組成很可能為C5H8O2Se，但由于其元素組成列表還有其他可信度較高的可能性，最終分子式須通過TOF MS/MS譜圖進(jìn)一步確證。

圖3 硒化合物C5H8O2Se的XIC圖（A）、MS圖（B）、MS/MS圖和結(jié)構(gòu)式（C）Fig.3 Extracted ion chromatogram（A），MS spectrum（B），MS/MS spectrum and putative chemical structural formula（C）of Se compound C5H8O2Se

該前體離子（m/z為180.976 2）相應(yīng)的TOF MS/MS譜圖如圖3C所示，其多數(shù)碎片離子符合硒同位素分布模式，為含硒裂解碎片。將TOF MS/MS 譜圖與Formula Finder 的MS/MS Details 相鏈接，基于二級質(zhì)譜擬合出可能的母離子分子式和碎片分子式。結(jié)果表明，MS Rank 和MS/MS Rank 均為1 時(shí)，其一級質(zhì)譜Δppm 為-0.2 ppm，RDB 值為3，二級質(zhì)譜Δppm 為5.5 ppm，分子式與一級質(zhì)譜擬合出的分子式完全一致，可以推測該化合物的分子式極有可能為C5H8O2Se。

該化合物的前體母離子進(jìn)一步裂解后可能產(chǎn)生的碎片離子如表2 所示，根據(jù)Ward 等［20］的報(bào)道和SeMet 標(biāo)樣的二級譜圖，相似的裂解碎片CH3Se、C2H5Se、C4H7Se 表明該化合物很可能為SeMet 的前體離子（C5H12NO2Se+）失去NH4+后的產(chǎn)物。其次，裂解碎片C4H7O2為Ouerdane 等［24］報(bào)道的2 種甲基硒碳水化合物M+H 峰的前體母離子C5H11O3Se+、C6H13O3Se+的裂解碎片，推測該硒化合物的母離子C5H9O2Se+為甲基硒碳水化合物的母離子C5H11O3Se+中性丟失H2O 分子，產(chǎn)生的一種新的甲基硒碳水化合物（Methylseleno carbohydrate），進(jìn)一步驗(yàn)證了該化合物的結(jié)構(gòu)。將該化合物的結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入ChemDraw，通過Show Analysis Window 分析可能的裂解碎片與TOF MS/MS譜圖是否一致，結(jié)果表明該結(jié)構(gòu)式滿足該化合物的多數(shù)裂解碎片，如CH3Se、C2H5Se、C4H7Se、C4H5O2、C4H7O2，最后通過Check Structure 功能驗(yàn)證了該化合物結(jié)構(gòu)式的合理性。該甲基硒碳水化合物可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及裂解過程如圖3C所示。

2.2.3.3 C7H9NO2Se MS 質(zhì)譜圖中，在m/z為219.987 4 處，發(fā)現(xiàn)符合硒同位素分布特征的硒化合物母離子，在總離子流（TIC）圖中，其保留時(shí)間為3.79 min。該硒化合物母離子在m/z219.987 4 處的同位素分布XIC 圖及相應(yīng)TOF MS 譜圖見圖4A、B。經(jīng)Formula Finder 進(jìn)行分子擬合后，結(jié)果表明元素組成為C7H9NO2Se 時(shí)，其MS Rank 為1，Δppm 為1.2 ppm，RDB 值為5，符合基本的化合物元素組成規(guī)律。該母離子經(jīng)二級裂解后產(chǎn)生的TOF MS/MS 譜圖如圖4C 所示。基于TOF MS/MS 進(jìn)行Formula Finder分子擬合，擬合出的分子式中，MS Rank 為1，MS/MS Rank 為1 的元素組成與TOF MS 譜圖擬合結(jié)果一致，其一級質(zhì)譜Δppm 為1.2 ppm，二級質(zhì)譜Δppm 為1.6 ppm，RDB 值為5，是一個(gè)多不飽和硒化合物。

圖4 硒化合物C7H9NO2Se的XIC圖（A）、MS圖（B）、MS/MS圖和結(jié)構(gòu)式（C）Fig.4 Extracted ion chromatogram（A），MS spectrum（B），MS/MS spectrum and putative chemical structural formula（C）of Se compound C7H9NO2Se

在TOF MS/MS 譜圖中，m/z173.981 7 為響應(yīng)強(qiáng)度最高的碎片，其響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到2×104，符合硒的質(zhì)量虧損特征，表明該硒化合物經(jīng)二級裂解最可能形成m/z173.981 7 的含硒裂解碎片離子，其擬合出的分子式為C6H8NSe，與硒化合物C7H9NO2Se相比，質(zhì)量數(shù)減少了46 Da，表明該化合物很可能含有1個(gè)羧基（—COOH），通過中性丟失失去1 個(gè)CO 和1 個(gè)H2O，由于該化合物的不飽和度較高（RDB 值為5），存在C6H9NSe、C4H5Se、C3H7Se等裂解碎片，表明該硒化合物存在1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)且含有2個(gè)C====C鍵；其次，許多裂解碎片的m/z值較大，表明該硒化合物的硒存在于環(huán)狀結(jié)構(gòu)中。據(jù)此，通過ChemSpider 找出最可能的硒化合物為硒代苯基丙氨酸（Seleno-phenyl-alanine），導(dǎo)入ChemDraw，嘗試斷裂可能的鍵，通過Show Analysis Window 得到可能的碎片并與TOF MS/MS譜圖擬合出的碎片相匹配，推測硒代苯基丙氨酸可能的結(jié)構(gòu)及裂解途徑如圖4C所示。

3 結(jié) 論

本文采用HPLC-ICP-MS對富硒堇葉碎米薺酶解液中的5種硒形態(tài)進(jìn)行了定量分析；將酶解液通過3 kDa 超濾管去除大分子物質(zhì)和純化后，冷凍干燥濃縮樣品中的硒化合物，避免了復(fù)雜的多維色譜純化過程；結(jié)合UPLC-ESI-Triple TOF MS 高分辨質(zhì)譜鑒定出富硒堇葉碎米薺中15 種未知硒化合物，包括7種已報(bào)道和8種未報(bào)道的硒化合物，提出了3種未報(bào)道硒化合物的可能結(jié)構(gòu)式。鑒定策略為：通過硒的同位素分布和質(zhì)量虧損特征發(fā)現(xiàn)含硒化合物后，利用含硒化合物的MS、MS/MS 譜圖和Formula Finder 擬合出可能的含硒化合物分子式，再通過ChemSpider 及文獻(xiàn)搜索，找到可能的含硒化合物結(jié)構(gòu)式，最后根據(jù)硒化合物的MS、MS/MS 譜圖和裂解碎片采用ChemDraw 驗(yàn)證硒化合物結(jié)構(gòu)式的可靠性。本研究為富硒植物中硒形態(tài)分析及未知硒化合物鑒定提供了思路。