中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)刺激模型構(gòu)建

王水濤，何盛盛，江玲麗，高有領(lǐng)，*

(1.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315100)

中華鱉()營養(yǎng)豐富，富含不飽和脂肪酸、必需氨基酸、維生素和微量元素，具有良好的養(yǎng)殖效益，是我國重要的特種經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物。近年來，隨著消費(fèi)市場的成熟，中華鱉養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅速，2019年我國所有種類鱉的產(chǎn)量達(dá)到32.55萬t，其中，中華鱉占了絕大部分，但頻發(fā)的病害，嚴(yán)重制約中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。危害中華鱉的病原種類繁多，其中，病毒性疾病由于缺乏有效的診斷方法和防治方法，危害性遠(yuǎn)高于其他病原引起的疾病。先前，對(duì)中華鱉病毒性疾病的研究主要集中在組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)變化和電鏡觀察等方面，這些方法雖然能分離和鑒定出一些病毒病，但關(guān)于大部分病毒病的發(fā)生和致病機(jī)理尚不明確。病毒只能在天然宿主或其他合適的活細(xì)胞內(nèi)繁殖，且病毒感染宿主時(shí)有種屬特異性；因此，建立中華鱉源細(xì)胞系對(duì)其免疫學(xué)和病原微生物學(xué)研究來說都非常重要。目前，研究人員已在中華鱉的細(xì)胞系建立和培養(yǎng)條件優(yōu)化方面取得了一些進(jìn)展：李曉莉等建立了中華鱉腎、脾細(xì)胞系；郭海杰建立了中華鱉心細(xì)胞系，并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。與畜禽類和魚類相比，國內(nèi)外關(guān)于鱉類細(xì)胞研究的廣度和深度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。而且，上述關(guān)于鱉的細(xì)胞原代培養(yǎng)方法均需從成體中采集組織塊，并基于組織塊遷移法開展。該類方法雖已被證實(shí)可行，但也存在著一些缺點(diǎn)，例如：由于成體難以徹底消毒，細(xì)胞污染的概率較大；且培養(yǎng)液中存在大塊的組織塊，易造成培養(yǎng)的細(xì)胞類型不單一。本實(shí)驗(yàn)擬使用無菌的鱉胚胎，采用胰蛋白酶消化結(jié)合細(xì)胞過濾器的方法，解決上述問題。

維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)可以識(shí)別病毒RNA，激活干擾素生成通路并生成干擾素，從而發(fā)揮抗病毒的作用。在RIG-Ⅰ識(shí)別并區(qū)別對(duì)待外源病毒RNA和自身RNA的過程中，-甲基腺苷(mA)修飾發(fā)揮重要的作用。機(jī)體自身的RNA經(jīng)過mA修飾以后，不會(huì)激活干擾素系統(tǒng)，而外源的病毒RNA未經(jīng)mA修飾，可激活該系統(tǒng)，進(jìn)而產(chǎn)生干擾素。在mA修飾環(huán)狀RNA的過程中，mA甲基化識(shí)別蛋白(YTHDF2)具有重要的作用。RIG-Ⅰ識(shí)別病毒RNA后，其分子構(gòu)象發(fā)生改變，與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)產(chǎn)生作用。MAVS進(jìn)入線粒體，激活干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)，再經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)，生成干擾素(IFN-α/β)，并產(chǎn)生后續(xù)的抗病毒反應(yīng)。鑒于中華鱉在該方向的研究尚存在空白，因此有必要針對(duì)上述因子開展相關(guān)研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)旨在建立基于中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)體系，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用RNA病毒模擬物——聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)刺激該細(xì)胞，研究其對(duì)細(xì)胞形態(tài)和干擾素生成通路相關(guān)因子的影響，最終構(gòu)建基于中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞Poly I:C的刺激模型，為深入研究中華鱉抗病毒免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用中華鱉胚胎由本實(shí)驗(yàn)室自行孵化得到。

主要試劑包括：DMEM高糖培養(yǎng)基、D-Hanks緩沖液、胰蛋白酶、秋水仙素、二甲基亞砜(DMSO)和100×雙抗(500 U·mL青霉素和500 U·mL鏈霉素)，購于北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)，購于Bovogen公司；一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、一抗RIG-Ⅰ、一抗MAVS、一抗干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)、二抗HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG、RIPA裂解液和TBST緩沖溶液，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、TriZol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，購于美國Thermo Fisher公司；poly I:C，購于美國Sigma公司；Lipofectmine 3000試劑，購于美國Invitrogen公司；異丙醇，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR反應(yīng)試劑，購于日本Takara公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑UltraSYBR Mixture，購于江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；臺(tái)盼藍(lán)染液、5×SDS-PAGE上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

DMEM高糖培養(yǎng)基和FBS按9∶1的比例混合后，再加入1%(體積分?jǐn)?shù))的100×雙抗配制成完全培養(yǎng)基。

細(xì)胞凍存液由DMEM、FBS、DMSO按70%、20%、10%的比例(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))配制。

1.2 原代培養(yǎng)

取孵化至第23期的中華鱉胚胎，用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇對(duì)殼表面進(jìn)行消毒，然后移入細(xì)胞操作間，在無菌條件下用眼科剪剪破卵殼，取出胚胎肝組織，用D-Hanks緩沖液(含1×雙抗)清洗2遍以去除血細(xì)胞。之后，將其移入裝有500 μL 0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)胰蛋白酶的1.5 mL離心管中，用眼科彎頭剪刀將組織塊剪成約1 mm的塊狀，再將其轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加入3.5 mL 0.25%胰蛋白酶，混合后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃消化20 min(每隔5 min輕輕晃動(dòng)1次)，再加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化。消化后用40 μm細(xì)胞過濾器過濾至新的50 mL離心管中，之后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000×離心10 min，棄上清后，將所得沉淀用適量的完全培養(yǎng)基懸浮后移入到25 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T25)中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，隨后逐日在DM4000型顯微鏡(德國Leica)下觀察細(xì)胞貼壁和生長狀況，每2 d更換一次培養(yǎng)液。

1.3 傳代培養(yǎng)

觀察原代細(xì)胞培養(yǎng)情況，待細(xì)胞鋪滿單層時(shí)，吸出舊培養(yǎng)基，用5 mL D-Hanks緩沖液清洗一次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃消化3 min，之后拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁使細(xì)胞脫壁，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1∶5的比例接種至75 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T75)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)。后續(xù)細(xì)胞傳代均按1∶5的比例進(jìn)行。

1.4 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

選取形態(tài)均一、生長旺盛并處于指數(shù)生長期、細(xì)胞貼壁90%以上的1瓶細(xì)胞，利用0.25%胰蛋白酶使細(xì)胞脫落下來，隨即將細(xì)胞與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000×離心3 min以去除培養(yǎng)基與胰蛋白酶。加入適量預(yù)先配制好的細(xì)胞凍存液，輕輕吹打，混合均勻，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)后，調(diào)節(jié)凍存液劑量，使細(xì)胞濃度達(dá)到10mL，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至2 mL凍存管中，然后將其放在預(yù)冷的程序降溫盒(需加入異丙醇)中進(jìn)行凍存。凍存程序如下：4 ℃存放6 h，之后轉(zhuǎn)移至-20 ℃放置24 h，再于-80 ℃放置24 h，最后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

復(fù)蘇時(shí)，從液氮中取出凍存的細(xì)胞，快速置于37 ℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)凍存管使其快速解凍。完全融化的細(xì)胞懸液經(jīng)1 000 ×室溫離心5 min后棄上清，加入3 mL新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃條件下培養(yǎng)。

取凍存前、后的細(xì)胞懸液，將其與0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臺(tái)盼藍(lán)染液按1∶4的比例混合后，滴加至血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在顯微鏡下觀察：死細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞則呈透明卵圓形。用活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的比例表示細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞生長曲線測定

將中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞經(jīng)消化后制成終濃度為2×10mL的細(xì)胞懸液，接種至24孔培養(yǎng)板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃條件下培養(yǎng)。自接種結(jié)束開始計(jì)時(shí)，于培養(yǎng)后8 d內(nèi)每天用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞的數(shù)量，每隔2 d給細(xì)胞換液1次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以每1 mL培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，并計(jì)算中華鱉細(xì)胞的倍增時(shí)間。

1.6 細(xì)胞染色體觀察與分子鑒定

取穩(wěn)定生長于6孔板48 h的第10代細(xì)胞，加入終濃度1 μg·mL的秋水仙素于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)6 h，用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化后回收細(xì)胞。經(jīng)低滲、預(yù)固定、固定、染色、干燥、封片后觀察。

選取生長良好的中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞，消化后收集細(xì)胞沉淀，采用TriZol法提取細(xì)胞總RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，參考曹代男等的方法對(duì)成纖維細(xì)胞做分子鑒定，以波形蛋白基因和肌動(dòng)蛋白α2基因2作為鑒定因子，以基因作為對(duì)照因子(引物序列詳見表1)。PCR反應(yīng)體系：5 μL 2×GC Buffer Ⅱ，1.6 μL dNTP Mixture，0.4 μL cDNA，0.4 μL上游引物(10 μmol·μL)，0.4 μL下游引物(10 μmol·μL)，0.2 μL TaKaRa LA酶，2 μL ddHO。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃保溫。1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.7 Poly I:C轉(zhuǎn)染細(xì)胞

將中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞經(jīng)消化后制成終濃度為1.5×10mL的細(xì)胞懸液，接種至12孔培養(yǎng)板中(每孔1 mL)，待生長至約80%時(shí)更換新鮮的完全培養(yǎng)基。采用Lipofectmine 3000試劑進(jìn)行Poly I:C轉(zhuǎn)染，每孔加入1 μg Poly I:C，同時(shí)在對(duì)照組中加入相同體積的空白Opti-MEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組各設(shè)3個(gè)重復(fù)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。收集時(shí)吸干培養(yǎng)基，加入200 μL RIPA裂解液，放置于冰上，在搖床上裂解處理30 min，轉(zhuǎn)移裂解液至EP管中,并加入80 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃金屬浴處理10 min后，3 000×、4 ℃離心10 min，然后吸取上清液用于Western blot檢測。

用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的細(xì)胞采用6孔板進(jìn)行Poly I:C轉(zhuǎn)染，收集細(xì)胞時(shí)先吸干培養(yǎng)基，再加入1 mL TriZol試劑，冰上處理10 min后，按TriZol試劑說明書中的方法提取總RNA，按1.6節(jié)方法制備cDNA。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測和Western blot檢測

采用UltraSYBR Mixture試劑，以-為內(nèi)參基因，使用MyiQ2 Two Color實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)測定-Ⅰ、和2的相對(duì)表達(dá)量(引物序列詳見表1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。反應(yīng)體系：6.25 μL 2×UltraSYBR Mixture，1.0 μL cDNA，0.25 μL上游引物(10 μmol·μL)，0.25 μL下游引物(10 μmol·μL)和4.75 μL ddHO。

用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶，電泳結(jié)束后用濕法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h，再加入一抗在4 ℃孵育過夜，之后用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，再加入二抗于室溫下孵育1 h，用TBST緩沖液洗膜3次后，利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，最后在Amershan Imager 680系統(tǒng)(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB)上成像。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用Livak等的方法計(jì)算。采用Image-Pro Plus軟件量化Western blot圖像條帶的灰度值，獲得的數(shù)據(jù)在SPSS 22.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并開展獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，顯著性水平選定為α=0.05。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)24 h后可觀察到少量細(xì)胞貼壁，此時(shí)細(xì)胞多呈成纖維樣，細(xì)胞體積較小，細(xì)胞間隙較大(圖1)。148 h后，細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中生長較好，貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯增加，基本鋪滿單層，此時(shí)可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞形態(tài)上與原代細(xì)胞一致，但細(xì)胞突起開始拉長，體積逐漸變大。傳代細(xì)胞增殖速度較快，2～3 d即可傳代一次。隨著傳代的進(jìn)行，細(xì)胞生長逐漸趨于穩(wěn)定，至本研究成文時(shí)已成功傳至20代。

2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

將凍存1個(gè)月的細(xì)胞從液氮中取出進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)2 d后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞生長速度和形態(tài)與凍存前無明顯差別，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，細(xì)胞可鋪滿單層，且可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)冷凍前、后的細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色(圖2)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，細(xì)胞存活率分別為(90.51±0.46)%和(82.95±0.61)%。

圖1 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphology of primary culture and subculture of fibroblast from embryonic liver of Chinese soft-shelled turtle

正常細(xì)胞染色后呈白色，死亡細(xì)胞染色后呈藍(lán)色。Living cells display white color， while the dead ones display blue color.圖2 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞凍存前(a)、后(b)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果Fig.2 Trypan blue staining of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle before (a) and after (b) cryopreservation

2.3 細(xì)胞生長曲線測定

中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的生長曲線呈典型的“S”形(圖3)，符合細(xì)胞生長的一般規(guī)律。接種后細(xì)胞先處于潛伏期，2～7 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，8 d起細(xì)胞雖有生長，但速度減慢。經(jīng)計(jì)算，6代時(shí)細(xì)胞的倍增時(shí)間為59.9 h。

2.4 細(xì)胞染色體觀察和分子鑒定

選取100個(gè)中期分裂相的成纖維細(xì)胞(第10代)進(jìn)行染色體觀察和數(shù)目統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目在66條的比例為72%(圖4)。PCR擴(kuò)增后，獲得基因條帶和2基因條帶(圖5，分別對(duì)應(yīng)于544 bp和628 bp處)。

2.5 Poly I:C轉(zhuǎn)染對(duì)中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的影響

圖3 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的生長曲線Fig.3 Growth curve of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

圖4 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞染色體Fig.4 Chromosome of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，ACTA2；2，VIM；3，GAPDH；4，H2O。M， DNA marker; 1， ACTA2; 2， VIM; 3， GAPDH; 4， H2O.圖5 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的分子鑒定Fig.5 Molecular identification of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

用Poly I:C轉(zhuǎn)染中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞，在31 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，大量細(xì)胞逐漸收縮成圓形，漂浮在培養(yǎng)瓶表面，而對(duì)照組的細(xì)胞仍密集均勻分布，細(xì)胞貼壁良好(圖6)。與對(duì)照組相比，Poly I:C轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了-Ⅰ基因的表達(dá)水平，而和2基因的表達(dá)量在Poly I:C轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào)(圖7)。與對(duì)照組相比，Poly I:C轉(zhuǎn)染后，RIG-Ⅰ、MAVS蛋白表達(dá)水平顯著增加，而IRF1蛋白表達(dá)水平無顯著變化(圖8、表2)。

3 討論

目前，由于缺乏中華鱉來源的細(xì)胞系，中華鱉病毒學(xué)、免疫學(xué)，以及功能基因組學(xué)等方面的工作難以展開或進(jìn)展緩慢。原代培養(yǎng)是細(xì)胞系建立中最為關(guān)鍵的一步，只有原代細(xì)胞分離成功，才有可能成功建立細(xì)胞系。目前，常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法有直接提取法、消化分解法和組織塊培養(yǎng)法。其中，常用于龜鱉類細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要是2類：一類是組織遷移法，一類是胰蛋白酶消化法。兩種方法均可成功獲得可傳代的細(xì)胞。胰蛋白酶消化法是一種常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，已在多個(gè)物種的原代培養(yǎng)中得到應(yīng)用。本研究在胰蛋白酶消化法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用40 μm細(xì)胞過濾器從組織中分離原代細(xì)胞，成功從中華鱉胚胎中分離、培養(yǎng)出肝成纖維細(xì)胞，得到了形狀、性能一致的細(xì)胞懸液，避免了培養(yǎng)液中大塊組織塊的存在，以及由此引起的多種細(xì)胞混雜，獲得的細(xì)胞可確定為單一的成纖維細(xì)胞。而且，本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)出的細(xì)胞貼壁較快，細(xì)胞量大，生長情況良好。

圖6 Poly I:C轉(zhuǎn)染中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞24 h后的形態(tài)Fig.6 Morphology of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C for 24 h

標(biāo)*或**的分別表示對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。* and ** indicate significant difference between the control group and the transfection group at P<0.05 and P<0.01， respectively.圖7 Poly I:C轉(zhuǎn)染對(duì)中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞RIG-Ⅰ、m6A和YTHDF2基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Relative gene expression of RIG-Ⅰ， m6A and YTHDF2 in embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C

圖8 Poly I:C轉(zhuǎn)染對(duì)中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞RIG-Ⅰ、MAVS和IRF1蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Protein expression of RIG-Ⅰ， MAVS and IRF1 in embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C

表2 Western blot條帶量化灰度值

在進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)操作時(shí)，如果組織滅菌不徹底，容易引起細(xì)胞培養(yǎng)污染。中華鱉胚胎以蛋的形式存在，作為原材料，具有蛋內(nèi)無菌、蛋表面滅菌操作容易的特點(diǎn)，操作相對(duì)簡便。此外，與成體相比，胚胎來源細(xì)胞分化能力強(qiáng)，活力好，生長快，傳代代數(shù)更多。本試驗(yàn)獲得的細(xì)胞已傳20代，細(xì)胞活力正常。我們認(rèn)為，選用鱉的胚胎來進(jìn)行原代培養(yǎng)，是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的一個(gè)關(guān)鍵所在。

細(xì)胞體外培養(yǎng)會(huì)受到營養(yǎng)(糖、氨基酸、維生素等)和培養(yǎng)環(huán)境(溫度、CO濃度、滲透壓和pH等)的影響。中華鱉細(xì)胞培養(yǎng)中，常用的溫度包括25 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃和32 ℃。本實(shí)驗(yàn)參照郭海杰培養(yǎng)中華鱉心肌細(xì)胞的營養(yǎng)條件和環(huán)境，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為31 ℃，選用DMEM高糖培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，F(xiàn)BS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。結(jié)果顯示，該條件下培養(yǎng)的中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞貼壁和增殖迅速，傳代后細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，按1∶5比例進(jìn)行傳代時(shí)，2～3 d即可傳代一次。

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)符合成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定為成纖維細(xì)胞。Wang等發(fā)現(xiàn)，錦鯉腦細(xì)胞在生長初期主要以成纖維細(xì)胞為主，但傳代至第20代時(shí)上皮樣細(xì)胞逐漸成為主要形態(tài)，因此僅憑形態(tài)學(xué)特征并不能準(zhǔn)確判斷其為成纖維細(xì)胞，通常還需要結(jié)合其他的特異性鑒定方法。關(guān)于成纖維細(xì)胞的鑒定，目前多采用免疫熒光的方法進(jìn)行鑒定。除此之外，也可以通過PCR法進(jìn)行鑒定。一般認(rèn)為，波形蛋白基因和肌動(dòng)蛋白基因2是成纖維細(xì)胞重要的分化標(biāo)記基因。主要負(fù)責(zé)維持細(xì)胞骨架的完整性，通常只在間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；2是細(xì)胞骨架微絲、微管，以及肌小節(jié)的主要組成部分，存在于細(xì)胞質(zhì)中。曹代男等采用和2鑒定紅耳龜胚胎的成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)檢測到了和2的電泳條帶，證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。

細(xì)胞核型正常是細(xì)胞研究工作的基礎(chǔ)。針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的克隆、基因編輯和轉(zhuǎn)基因等研究都需要核型正常的細(xì)胞。本研究所獲得的第10代細(xì)胞核型正常率為72%，表明培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)較好，屬于正常范疇。一般來說，隨著細(xì)胞傳代數(shù)的增加，細(xì)胞會(huì)越發(fā)衰老，核型異常的細(xì)胞比例會(huì)增大。本研究中細(xì)胞在第10代時(shí)核型正常比例仍較高，說明可用于后續(xù)研究。

干擾素生成通路的機(jī)制在前言中已做簡要介紹，本研究涉及的因子包括RIG-Ⅰ、mA、YTHDF2、MAVS和IRF1。根據(jù)已知物種的作用機(jī)制，對(duì)干擾素生成具有正向調(diào)節(jié)作用的包括RIG-Ⅰ、MAVS和IRF1，具有反向調(diào)節(jié)作用的包括mA和YTHDF2。Poly I:C是一種模擬病毒RNA作用的雙鏈RNA模擬物，是實(shí)驗(yàn)中常用的一種免疫刺激物。本研究中，Poly I:C轉(zhuǎn)染提高了RIG-Ⅰ的基因和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)了MAVS蛋白的表達(dá)水平，而和2基因的表達(dá)水平則顯著降低。這表明，Poly I:C轉(zhuǎn)染下，干擾素生成通路被激活，且促進(jìn)了干擾素的生成，進(jìn)而可產(chǎn)生抑制病毒的作用。由此可知，中華鱉干擾素生成通路的機(jī)制與其他物種存在一致性。Vats等證實(shí)，Poly I:C刺激能夠顯著提高水牛()成纖維細(xì)胞-Ⅰ基因的表達(dá)水平。在水生動(dòng)物中，Chen等研究表明，Poly I:C刺激草魚原代腎細(xì)胞24 h后，-Ⅰ基因的表達(dá)水平提高。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)2顯著降低了Poly I:C誘導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子3和干擾素基因-的表達(dá)水平。

本研究對(duì)干擾素生成通路進(jìn)行Poly I:C刺激實(shí)驗(yàn)時(shí)，檢測指標(biāo)包括基因表達(dá)(-Ⅰ、和2)和蛋白表達(dá)(RIG-Ⅰ，MAVS和IRF1)，除了RIG-Ⅰ同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR和Western blot檢測外，其他因子受限于現(xiàn)有的基因序列和抗體，均只進(jìn)行一種檢測，但是基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的單一結(jié)果也能夠說明因子的變化趨勢。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功建立了中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞具有可穩(wěn)定傳代、生長快和分化程度低等特點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，采用Poly I:C轉(zhuǎn)染的方法成功激活了細(xì)胞干擾素生成通路的相關(guān)因子，為后續(xù)該通路的研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。