天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究進(jìn)展

魏永忠,吳酉芝,3,吳相歡,焦凌霞

（1.上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品學(xué)院,上海 金山 201514;2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 閔行 200240）

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）通常被稱作耐熱菌、嗜酸耐熱菌、耐酸耐熱菌等[1].目前研究表明,35%的果汁產(chǎn)品變質(zhì)都與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染有關(guān)[2],該菌導(dǎo)致橙汁、獼猴桃汁及果醬等酸性果蔬制品腐敗變質(zhì)[3],酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌給水果加工產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)影響.目前國際貿(mào)易中明確規(guī)定每10 mL的濃縮果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的數(shù)量不超過1個[4],因此,果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的存在對果汁工業(yè)出口滅菌工藝也帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn).酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢具有很強(qiáng)的抗逆性,通過巴氏殺菌不僅不能完全殺滅該菌的芽孢,反而能激活休眠的芽孢進(jìn)而促進(jìn)其萌發(fā)生長[5].通過高溫處理控制該菌具有較好的效果,但對果汁的營養(yǎng)、風(fēng)味及功能特性影響較大,且其他控制方法需要耗費較大的資金投入,因此在工業(yè)應(yīng)用中存在很大的局限性[6].

由于絕大部分人對果汁中添加化學(xué)抑菌劑認(rèn)可度不高,所以開發(fā)出安全有效且不會對果汁品質(zhì)造成影響的新型天然抑菌劑迫在眉睫,尋找天然抑菌化合物是目前食品工業(yè)研究的熱點之一[7].且隨著消費者健康意識的增強(qiáng),具有抑菌性能的天然物質(zhì)及其衍生物逐漸引起科研人員的重視,近年來對天然植物提取物安全性和抗菌活性的研究越來越多[8].天然抑菌劑具有低刺激性、無污染、安全、來源廣等優(yōu)點,可以在不影響食品品質(zhì)和營養(yǎng)風(fēng)味的情況下有效抑制微生物,使食品保持原有的感官狀態(tài)[9-10],降低殺菌溫度、時間及能耗,提高設(shè)備殺菌的效率和企業(yè)效益,因此在果汁工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景[11].本文系統(tǒng)地概述了天然化合物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌活性、機(jī)制及應(yīng)用工藝的研究進(jìn)展,以期為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的防治尋找新方法.

1 抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的天然化合物

目前果汁產(chǎn)品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的防治以高溫處理為主,但是這種傳統(tǒng)的方法對果汁的營養(yǎng)、風(fēng)味及功能特性影響較大.其他控制方法包括高壓靜水壓力、超臨界二氧化碳和紫外線輻射等非熱法巴氏殺菌技術(shù),需要耗費較大的初始資金,因此在實踐操作中存在很大的局限性[6].且由于現(xiàn)在人們健康意識逐步增強(qiáng),在果汁中添加化學(xué)抑菌劑認(rèn)可度不高.在這一背景下,開發(fā)抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的天然化合物受到廣泛關(guān)注.因此,本文將就抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的天然化合物進(jìn)行綜述,為尋找安全高效天然抑菌劑提供理論基礎(chǔ).

1.1 植物源天然化合物

植物源天然化合物是以天然中草藥為原料,采用物理和化學(xué)等手段按照其最終產(chǎn)品用途定向提取的一種或多種有效成分的化合物,且在提取過程中不會改變其有效成分結(jié)構(gòu).隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,中草藥的天然化合物提取分離技術(shù)不斷提升,對植物源天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究逐步從粗提物精進(jìn)至單一化合物的研究.

1.1.1 桉樹提取物桉樹葉常被用作提取精油的原料,具有較強(qiáng)的抗菌、消炎、防腐等作用,在食品、化工、醫(yī)藥等方面有著廣泛的用途[12].桉樹提取物對革蘭氏陽性菌有較好的抑菌效果,對革蘭氏陰性菌無太大影響,推測從桉樹中提取的化合物不能通過革蘭氏陰性菌的脂多糖層.Takahashi等[13]測定了26種桉樹葉提取物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌效果,研究表明,藍(lán)桉、斑葉桉和蛇葉桉提取物的黃酮類化合物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的有顯著的抑菌效果.

1.1.2 石榴提取物石榴提取物是一種強(qiáng)抗氧化劑,具有抗關(guān)節(jié)炎、減輕糖尿病、改善視力、保護(hù)心臟等多種功效[14],該提取物中的酚類物質(zhì)可產(chǎn)生高分子單寧,可與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合,降低細(xì)胞的通透性,也可與機(jī)體中的金屬離子相結(jié)合影響其酶活性,使其具有抑菌性[15-16].Turkyilmaz等[17]研究發(fā)現(xiàn),石榴提取物對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較好的抑菌效果.Molva等[18]發(fā)現(xiàn)新鮮石榴汁處理過的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌落數(shù)下降明顯,且通過掃描電鏡觀察處理過的菌體表面受損穿孔嚴(yán)重.這一結(jié)果表明,石榴提取物具有抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的作用.

1.1.3 迷迭香提取物迷迭香中提取出的迷迭香精油、抗氧化劑等提取物具有抑菌、抑制油脂氧化和改善食品風(fēng)味等作用,已廣泛應(yīng)用于食品加工等多個領(lǐng)域中[19-20].據(jù)報道,酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體的生長在迷迭香提取物的作用下會受到抑制,但其芽孢的生長不受影響[21].Piskernik等[22]研究表明,在含105CFU/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的蘋果汁中,加入不同迷迭香提取物后,酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢數(shù)均受到不同程度的抑制.因此,迷迭香提取物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體及芽孢均有一定程度的抑制作用.

1.1.4 胡椒屬提取物胡椒屬中一些物種因具有生物活性而具有重要的藥用特性.有報道稱Peltatum胡椒具有抗流感和抗氧化能力,且可被用于治療瘧疾.從該胡椒的葉子中獲得的提取物具有多種生物學(xué)功能,包括殺幼蟲能力[23].Ruiz等[24]研究表明,異戊烯基色烯是胡椒提取物中抑菌的主要成分,且在相同濃度胡椒提取物的作用下試驗組酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢數(shù)均受到明顯抑制.Isabela等[25]研究發(fā)現(xiàn),Peltatum胡椒提取物在低濃度下可使酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢菌落數(shù)明顯降低.

1.1.5 檸檬烯檸檬烯又稱苧烯,廣泛存在于橙皮精油等天然植物精油中,可揮發(fā)出檸檬香氣,具有良好的抑菌性[26].Maldonado等[27]研究了檸檬烯對麥芽汁肉湯培養(yǎng)基（MEB培養(yǎng)基）和檸檬濃縮汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的影響,結(jié)果表明,檸檬烯在MEB培養(yǎng)基和檸檬濃縮汁中均能完全抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子的萌發(fā).

1.1.6 蛋白酶類木瓜和菠蘿蛋白酶分別是從番木瓜和菠蘿中提取的蛋白水解酶.研究表明木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶對多種細(xì)菌都有抑制作用,且無毒無害,不易突變[28].Anjos等[29]研究了這兩種蛋白酶對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌效果,發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌均具有抑制作用.

1.1.7 百里香酚百里香酚是百里香精油的一種成分,主要由百里香草、香青蘭、麝香草等天然傘形科植物提取而成,且具有抗氧化性、抗炎抑菌等功能[30-31],可在貯藏期間保證食品品質(zhì).據(jù)報道,百里香酚對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和口腔致病菌等均能有效地控制[32].Rui等[33]研究發(fā)現(xiàn),質(zhì)量濃度均為0.25 mg/mL的百里香酚對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體MIC和MBC具有較強(qiáng)的抑制作用.

1.1.8 肉桂酸和綠原酸肉桂酸是一種酚類化合物,存在于許多水果（如蔓越莓和李子）和香料（如肉桂和丁香）中.已有研究表明,這種天然化合物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長有抑制作用[34].綠原酸廣泛存在于水果和蔬菜（如胡蘿卜、梨、西紅柿和紅薯）以及咖啡和茶中,是一種多酚物質(zhì).據(jù)報道,綠原酸可作為細(xì)菌病原體、酵母菌和霉菌的抗菌劑[35-36].Rui等[37]研究發(fā)現(xiàn),肉桂酸和綠原酸在AAM培養(yǎng)基中對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌均具有良好的抑制作用,且在蘋果汁中的抑菌效果也相差不大.

1.1.9 丁香油丁香油是一種從丁香花蕾中提取的天然植物精油,由于其主要化合物質(zhì)含丁香酚量為63%~85%,可與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用并破壞DNA的合成,從而達(dá)到抑菌效果[38-39].Alina等[40]研究發(fā)現(xiàn)丁香油通過使酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜釋放胞外多糖,從而導(dǎo)致其黏附力下降,誘導(dǎo)其從加工產(chǎn)品表面脫落.生物被膜的減少使得酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌表面的形態(tài)如高度、表面粗糙度和表面面積的差異等發(fā)生了實質(zhì)性的變化,酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體生長因此受到抑制.

1.1.10 香豆酸香豆酸廣泛存在于禾本科植物的莖干中,是一類生物活性較高的內(nèi)酯類化合物,通常作為食品添加劑應(yīng)用于食品當(dāng)中[41].Li等[42]研究發(fā)現(xiàn),香豆酸對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞和孢子均具有一定的抑制作用.

1.2 動物源天然化合物

動物源天然化合物對果蔬制品有較好的保鮮及抑菌效果,且原料來源較為豐富,不危害環(huán)境.隨著近年來動物源天然化合物成為天然抑菌劑的研究熱點,國內(nèi)外學(xué)者開始將其應(yīng)用于抑制果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究.

1.2.1 殼聚糖殼聚糖一般可從蟹、蝦及小龍蝦的殼中提取.其具有優(yōu)良的生物相容性、微生物降解性、安全性及抗菌活性等良好性能[43].殼聚糖一般用于真菌、細(xì)菌和病毒的抑菌劑[44].Falcone等[45]研究了殼聚糖對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的影響,發(fā)現(xiàn)高殼聚糖添加量會形成孢子薄片,此時能有效抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子的生長.Tastan和Baysal等[46]研究殼聚糖對蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢生長影響時發(fā)現(xiàn),其對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢生長無明顯影響.因此,殼聚糖對果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌活性仍需更進(jìn)一步研究.

1.2.2 溶菌酶溶菌酶廣泛存在于唾液、眼淚、雞蛋等生物液體和組織中,是一種常見的綠色天然抑菌劑,主要作用于革蘭氏陽性菌,尤其是嗜熱菌[47].Molva等[48]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子分別接種于蘋果汁和培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,固定化溶菌酶對芽孢的抑制效果優(yōu)于對營養(yǎng)菌體的抑制,但溶菌酶的活性與劑量有關(guān),并且受外部條件的影響.

1.3 微生物源天然化合物

自然界中,微生物資源豐富且多樣,易獲取,成本低廉.近幾年,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,通過不斷對微生物的代謝產(chǎn)物（生物堿、激素、毒素及抗生素等）進(jìn)行研究和開發(fā),學(xué)者們也開始致力于尋找能夠抑制果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌活性的微生物源天然化合物.

1.3.1 腸道菌素腸道菌素（Enterocin AS-48）是一種細(xì)菌素,在化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)、遺傳決定因素以及對食源性抗菌活性方面有著廣泛的研究[49].Grande等[50]研究發(fā)現(xiàn),在37℃條件下,Enterocin AS-48可有效滅活天然橙汁和蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體,接種了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的桃汁和葡萄柚汁,在添加了Enterocin AS-48后可被有效保護(hù)60 d不受污染.因此,Enterocin AS-48對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有一定抑制作用.

1.3.2 雙歧桿菌素雙歧桿菌素（Bificin C6165）是一種新型可用于抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)菌素,是腸道的重要有益微生物代謝產(chǎn)物之一,具有多重生物功能,如抗衰老、增強(qiáng)免疫、改善腸道等.Pei等[51]研究發(fā)現(xiàn),存在于商業(yè)果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞可被雙歧桿菌素C6165滅活,在低pH值（3.5）和高溫下（45℃）其抑菌活性更強(qiáng).

1.3.3 乳酸鏈球菌素乳酸鏈球菌素（Nisin）是食品藥品管理局允許使用的一種天然肽類細(xì)菌素.Nisin可有效抑制革蘭氏陽性菌以及部分芽孢桿菌的孢子,由于其高效、無毒、安全,目前被大部分國家作為食品防腐劑[52].Komitopoulou等[53]研究了Nisin的抑菌活性發(fā)現(xiàn),在25℃條件下,Nisin對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子形成具有一定抑制作用.Yamazaki等[54]研究發(fā)現(xiàn),在pH值較低的酸性果汁中Nisin對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌有良好的抑菌效果,因此Nisin抑菌活性受pH值的影響.Aryádina等[55]研究發(fā)現(xiàn),Nisin對果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有殺菌作用.

以上結(jié)果表明,天然動、植物以及微生物提取物存在著抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的能力,具備工業(yè)開發(fā)應(yīng)用前景,但仍需對其作用機(jī)制、工藝應(yīng)用進(jìn)一步深入探究.

2 天然化合物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌機(jī)制

天然化合物的抑菌機(jī)理研究成果較多,且絕大多數(shù)天然抑菌化合物來自于植物中[56].對于大多數(shù)天然抑菌物質(zhì)而言,主要是通過多位點機(jī)制殺死或抑制微生物的生長,其作用機(jī)理主要分為:通過影響細(xì)菌胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的合成（蛋白質(zhì)合成、DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄）,抑制微生物的生長與繁殖;破壞菌體細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),使菌體無法維持基本形態(tài),增加其通透性使胞內(nèi)物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)等）外泄;抑制細(xì)菌的能量代謝、呼吸作用等[57].

2.1 影響胞內(nèi)蛋白活性

蛋白質(zhì)作為細(xì)胞和組織的重要組成成分,是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ).當(dāng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受到阻礙時,將對細(xì)胞的生理機(jī)能造成嚴(yán)重危害.酶作為一類活細(xì)胞產(chǎn)生的特異性生物催化劑,絕大部分的酶屬于蛋白質(zhì)類,因此酶的活性在生命活動中起到了重要作用[58-59].

Li等[42]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)香豆酸的處理后,通過瓊脂糖凝膠阻滯和熒光光譜分析,發(fā)現(xiàn)香豆酸會嵌入酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的胞內(nèi)DNA雙螺旋槽中,從而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白降解.這一結(jié)果表明,香豆酸會對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞膜完整性進(jìn)行破壞,導(dǎo)致其胞內(nèi)ATP減少,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)畸形,從而造成正常的細(xì)胞功能出現(xiàn)損害,發(fā)揮抑菌效果.

2.2 抑制生物膜的形成

研究表明,細(xì)菌生物膜是一種被胞外聚合物所包裹的細(xì)菌群體,其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,內(nèi)部分布不均,同時也是絕大多數(shù)微生物在自然界當(dāng)中的一種生存方式.細(xì)菌可以通過形成生物膜來增強(qiáng)自身的抵抗力,促進(jìn)其增長與繁殖[60].對細(xì)菌生物膜進(jìn)行不斷研究發(fā)現(xiàn),由于細(xì)菌生物膜的特殊結(jié)構(gòu),除了能夠增強(qiáng)其抵抗惡劣的自然環(huán)境能力外,還能降低抗生素等抑菌劑的敏感性,因此尋找新型治療生物膜感染的天然抑菌劑迫在眉睫[61].

Alina等[40]研究發(fā)現(xiàn)丁香油通過使酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜釋放胞外多糖,從而導(dǎo)致其黏附力下降,誘導(dǎo)其從加工產(chǎn)品表面脫落.當(dāng)丁香精油體積分?jǐn)?shù)為0.05%時,可導(dǎo)致加工產(chǎn)品表面酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜減少25.1%~65.0%,生物膜的減少使得酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌表面的形態(tài)如高度、表面粗糙度和表面面積的差異等發(fā)生了實質(zhì)性的變化,菌體生長受到抑制.因此該結(jié)果表明,丁香油可作為一種良好的抗生物膜劑.

2.3 破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)

細(xì)胞膜作為阻擋胞外物質(zhì)自由出入細(xì)胞的屏障,能夠維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及物質(zhì)代謝正常,保證各種生化反應(yīng)有序進(jìn)行.當(dāng)細(xì)胞膜被破壞,菌體生命活動將會出現(xiàn)異常.研究發(fā)現(xiàn),天然抑菌劑能夠通過破壞微生物菌體和芽孢的形態(tài)及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),增加細(xì)胞通透性,使其胞內(nèi)成分（核酸、蛋白質(zhì)等）外泄,從而達(dá)到抑菌效果[62].

Rui等[33]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)百里香酚處理后的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體和芽孢的核酸和蛋白質(zhì)滲漏量明顯增加,對細(xì)菌蛋白質(zhì)的SDS分析發(fā)現(xiàn),可溶性蛋白損失嚴(yán)重,因此百里香酚通過破壞細(xì)胞和芽孢的完整性起到抑菌效果.經(jīng)肉桂酸和綠原酸處理后的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)受損嚴(yán)重,蛋白質(zhì)及核酸泄漏量增加[37].Aryádina等[55]研究發(fā)現(xiàn),通過AFM地形圖像顯示,在用Nisin處理后,酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞框架發(fā)生了顯著的結(jié)構(gòu)變化.Grande等[54]通過掃描電子顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)腸道菌素處理過的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體形態(tài)和孢子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了嚴(yán)重的損傷.以上結(jié)果表明,百里香酚、綠原酸、肉桂酸、Nisin以及腸道菌素均通過膜破壞的方式發(fā)揮抑菌效果.

目前,抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的天然化合物種類雖多,但對天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的機(jī)理研究卻比較淺顯,天然化合物對于抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的機(jī)理研究主要集中在:破壞胞內(nèi)蛋白和遺傳物質(zhì)、抑制生物膜的形成、損傷菌體細(xì)胞膜及細(xì)胞壁、破壞細(xì)菌形態(tài)等初步研究階段,仍需進(jìn)一步對其抑菌機(jī)理進(jìn)行研究.目前絕大多數(shù)天然化合物存在著難以應(yīng)用的問題,還需深入探索天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的工藝及其應(yīng)用.

3 天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌工藝及其應(yīng)用

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌給果汁行業(yè)帶來了巨大的影響及經(jīng)濟(jì)損失,因此果汁加工產(chǎn)業(yè)需要快速高效、綠色安全,且不影響果汁產(chǎn)品品質(zhì)的滅菌技術(shù)來控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌[63].目前抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的天然化合物及其相關(guān)作用機(jī)理已有不少研究,但其工業(yè)應(yīng)用較少.

3.1 天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌工藝

3.1.1 作用濃度隨著對天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究不斷深入,天然化合物合適抑菌濃度可為后續(xù)果汁加工產(chǎn)業(yè)提供理論數(shù)據(jù),既能解決某些天然化合物成本較高的問題,又能保證良好抑菌效果.

Takahashi等[13]通過研究發(fā)現(xiàn),桉樹提取物在較低質(zhì)量濃度下（1.0~31 g/L）有較好的抑菌效果,且利用桉樹提取物開發(fā)了新型的抗菌藥劑.這種抗菌劑目前被用于濕紙巾及其他商品的配方中,還未應(yīng)用于果汁,其對果汁的感官影響及抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步探索.Alina等[40]研究發(fā)現(xiàn)丁香油可作為一種良好的抗生物膜劑,添加體積分?jǐn)?shù)為0.05%的丁香精油即可導(dǎo)致表面上的生物膜減少25.1%~65.0%.此外,丁香油與蘋果或柑橘等多種果汁的感官特征相似,不影響產(chǎn)品的口感,甚至能提升香氣,但此方法開銷較大,因此在果汁中應(yīng)用需進(jìn)一步研究.Falcone等[45]研究了殼聚糖對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的影響,發(fā)現(xiàn)殼聚糖在培養(yǎng)基中的最佳添加量為1.4 g/L.殼聚糖因其安全性能較好在食品加工業(yè)中極具開發(fā)前景,但其在實際應(yīng)用中抑菌效果如何,仍有待深入研究.Ruiz等[24]研究表明,異戊烯基色烯是胡椒提取物中抑菌的主要成分,其最低抑菌質(zhì)量濃度為7.8 μg/mL.在果汁中添加胡椒提取物可有效的抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌,胡椒獨特的辛辣味對果汁的感官影響較大,因此在實際應(yīng)用中存在一定缺陷.Isabela等[25]研究發(fā)現(xiàn),Peltatum胡椒提取物的最低抑菌質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL.Maldonado等[27]研究表明,檸檬烯抑菌效果良好,在不同體積分?jǐn)?shù)下（0.08%,0.12%,0.16%）均能完全抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子的萌發(fā),其獨特的香氣能使果汁產(chǎn)品更富有風(fēng)味,可進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制及在果汁加工工藝中的應(yīng)用.Anjos等[29]研究了兩種蛋白酶對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌效果,發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的MIC和MBC分別為0.98 μg/mL和3.91 μg/mL,菠蘿蛋白酶對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的MIC和MBC分別為62.5 μg/mL和250 μg/mL,且兩種酶對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制有協(xié)同作用.木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌機(jī)制還需進(jìn)一步研究.Rui等[33]研究發(fā)現(xiàn),百里香酚對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體的MIC和MBC均為0.25 mg/mL.但由于組成的特殊性,是否會對人體造成影響,還需更進(jìn)一步研究.Rui等[37]研究發(fā)現(xiàn),肉桂酸和綠原酸在AAM培養(yǎng)基中對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的MIC值分別為0.37和2.00 mg/mL,MBC值分別為0.5和4.0 mg/mL,在蘋果汁中的抑菌效果也相差不大.這種酚類物質(zhì)由于其本身就存在于水果中,因此作為抑菌劑加入果汁中對其品質(zhì)影響較小,且安全性高.Li等[42]研究發(fā)現(xiàn),香豆酸對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子的MIC為0.2 mg/mL,但MBC＞1.6 mg/mL.而香豆酸對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的MIC和MBC均為0.2 mg/mL.在蘋果汁中添加香豆酸可增加總酚含量和ABTS自由基清除活性,且對pH值、總可溶性固形物、色澤和感官品質(zhì)無顯著影響.這些研究結(jié)果表明,香豆酸有望成為抑制果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的替代劑或補(bǔ)充劑,從而應(yīng)用于食品工業(yè)中.

上述結(jié)果表明,絕大部分天然化合物在較低濃度下即可對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)菌體及其芽孢進(jìn)行抑制或殺滅.隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)部分天然化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊性,是否會對人體造成影響,以及部分天然化合物存在特殊氣味,對果汁產(chǎn)品的感官品質(zhì)等存在著一定的影響.因此,其實際應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究.

3.1.2 作用溫度對天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的作用溫度進(jìn)行研究,可為食品加工保藏提供新思路.

Pei等[53]研究發(fā)現(xiàn),存在于商業(yè)果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞可被質(zhì)量濃度為40 μg/mL的雙歧桿菌素C6165滅活,在低pH值（3.5）和高溫下（45℃）其抑菌活性更強(qiáng).通過顯微鏡觀察Bificin C6165處理過的菌體出現(xiàn)菌體損傷和細(xì)胞溶解的現(xiàn)象.添加Bificin C6165可降低酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的耐熱性,但對其孢子的抑制效果不顯著.因此,在食品工業(yè)應(yīng)用中仍需更進(jìn)一步研究.Soko owska等[48]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子分別接種于蘋果汁和培養(yǎng)基中,溶菌酶的MIC在27℃、35℃和43℃下分別為10 mg/L、2.5 mg/L和1.25 mg/L.在選定的非抑制劑量下,溶菌酶（0.3~2.5 mg/L）與相應(yīng)溫度下的對照相比延長了滯后時間.此外,滯后時間與溶菌酶質(zhì)量濃度在27℃和35℃之間存在很強(qiáng)的線性關(guān)系（R2＞0.98）.

以上研究表明,可通過有效控制物理變量提高天然化合物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑菌性能.

3.1.3 作用時間通過對天然化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的時間長短進(jìn)行研究,可為果汁產(chǎn)品儲存條件及保質(zhì)期提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)支持.

Molva等[18]在新鮮石榴汁中加入106CFU/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌,處理約11 d后,菌落數(shù)下降.同時將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌加入含有石榴提取物的蘋果汁中處理24 h,可使初始菌落數(shù)下降明顯.石榴提取物可作為新型抑菌劑應(yīng)用于果汁保藏,但其抑菌時間較長,因此需改善和創(chuàng)新其抑菌方式,還需進(jìn)一步研究.Piskernik等[22]研究表明,在蘋果汁中加入迷迭香提取物并沒有改變蘋果汁的感官性質(zhì),且在含105CFU/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的蘋果汁中,加入V20和V40兩種迷迭香提取物培養(yǎng)8 h后,芽孢數(shù)下降,且加入迷迭香后果汁的氣味、色澤無明顯變化.迷迭香提取物可以作為蘋果汁的天然添加劑,進(jìn)一步應(yīng)用于果汁加工行業(yè)中.Li等[42]研究發(fā)現(xiàn),在MIC下往蘋果汁中添加香豆酸,可以讓酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體數(shù)量下降,并在7 d內(nèi)能有效抑制其孢子的萌發(fā).在4℃的低溫貯藏條件下,添加香豆酸可進(jìn)一步加速了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的死亡,且死亡時間與對照相比從5 d縮短至3 d.Grande等[54]研究發(fā)現(xiàn),在37℃條件下,質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的Enterocin AS-48可有效滅活天然橙汁和蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體,1 d未見細(xì)菌生長,接種了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的桃汁和葡萄柚汁,可有效保護(hù)60 d不受污染.腸道菌素在非熱條件下也有良好的抑菌效果,因此可有效避免高溫處理給果汁產(chǎn)品帶來的影響.但腸道菌素若應(yīng)用于果蔬產(chǎn)品加工中,攝入過量是否會引起健康問題,還需進(jìn)一步研究.

上述研究結(jié)果表明,不同天然合物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的作用時間不同,但部分天然化合物是否會由于食用過量對人體健康造成影響均未有定論.因此,尋找快速高效、綠色安全、未影響品質(zhì)的天然抑菌化合物及抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌工藝,仍是下一步研究的重點內(nèi)容.

3.2 在果汁工業(yè)中的應(yīng)用

目前,Nisin是市場上唯一被應(yīng)用于果汁工業(yè)中控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的天然抑菌化合物.1969年,世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織允許Nisin作為食品添加劑在全球范圍內(nèi)進(jìn)行使用,在1990年,我國也將Nisin作為食品添加劑允許應(yīng)用于食品當(dāng)中[64].Pasamontes等[65]在果汁中添加Nisin作為食品添加劑,發(fā)現(xiàn)其能夠明顯抑制果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌及其芽孢的生長.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Nisin用于蘋果汁中抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的效果并不理想.有研究通過將Nisin與其他物理化學(xué)等方式協(xié)同作用,以期達(dá)到更好的抑制果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的效果[66].因此,天然化合物對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制作用雖已有不少研究,但其如何在果汁工業(yè)中更好的應(yīng)用仍需更進(jìn)一步研究.

4 展望

天然化合物如植物源提取物、動物源提取物以及微生物源提取物等作為綠色抑菌劑而受到廣泛研究.開創(chuàng)新型技術(shù)來抑制和殺滅酸土脂環(huán)酸桿菌是目前主要研究和探索的方向,這些方法可以有效避免傳統(tǒng)理化殺菌技術(shù)影響產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)風(fēng)味的缺點,天然抑菌物質(zhì)雖然成為新型滅菌技術(shù)研究熱點及今后研究的重點方向,但仍然存在一些需重點深入研究的問題：（1）天然抑菌化合物提取率低等仍是目前急需解決的問題,需通過研究不同化合物自身的理化性質(zhì),尋找適宜方法來提高提取率,優(yōu)化提取工藝;（2）絕大部分植物抑菌劑還停留在對粗提物的研究上,起抑菌作用的具體化學(xué)成分尚未發(fā)現(xiàn);（3）某些果汁中某些組分可能會與抑菌物質(zhì)存在不定性的相互作用,導(dǎo)致其抑菌活性降低甚至喪失,在果汁工業(yè)中添加此類天然化合物仍有待進(jìn)一步研究和完善;（4）大部分天然抑菌化合物存在著特殊味道,可能會對果汁感官品質(zhì)造成一定的影響,存在著難以應(yīng)用的缺點;（5）雖然已知大量的天然化合物可有效抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長,但其機(jī)制研究主要停留在細(xì)胞膜組成變化、細(xì)菌菌體形態(tài)、孢子結(jié)構(gòu)變化、胞內(nèi)蛋白活性等初步研究階段,具體是何種抑菌基因表達(dá)起到的抑菌作用有待進(jìn)一步研究和發(fā)現(xiàn).隨著對天然抑菌化合物作用于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌調(diào)控機(jī)理的探索,開創(chuàng)既能殺菌又能維持食品風(fēng)味和品質(zhì)的綠色高效危害控制新技術(shù),不僅為控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染及食品保藏提供了理論基礎(chǔ),同時在醫(yī)藥加工、食品加工等實際應(yīng)用方面有著重要意義.