MicroRNA在膽囊癌發(fā)病機(jī)制及診斷價(jià)值的研究進(jìn)展*

李 壯 張 鵬 孫艷軍 盛明輝 王文飛 孫登群,

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽省合肥市 230022； 2 武警安徽省總隊(duì)醫(yī)院普外科

膽囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是一種常伴有局部浸潤(rùn)、早期廣泛的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和多發(fā)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的侵襲性疾病。由于沒(méi)有具體的臨床體征、癥狀或可靠的敏感標(biāo)記，出現(xiàn)的癥狀常被誤診為膽絞痛或慢性膽囊炎，進(jìn)一步延誤診斷。對(duì)于晚期GBC患者，需要聯(lián)合化療、放療、靶向治療和免疫治療，以提高患者的總生存率，通常晚期患者因癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移難以根治性切除而療效欠佳,故其患者總體預(yù)后極不理想。因此識(shí)別新的生物標(biāo)志物對(duì)于GBC患者的早期診斷和有效治療至關(guān)重要。據(jù)資料顯示microRNA能調(diào)節(jié)人類1/3的基因，microRNA與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生亦有非常密切的關(guān)系，許多研究發(fā)現(xiàn)改變miRNAs的表達(dá)與癌癥進(jìn)展有關(guān)，其中包括GBC[1]。因此深入探尋miRNA對(duì)GBC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性對(duì)突破現(xiàn)階段GBC的診療治療有重要意義。

1 MicroRNA 的概述

MicroRNAs(miRNAs)是一種短的(19～25個(gè)核苷酸)非編碼RNA，起著基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)人類1/3的基因[2]。到目前為止，被鑒定出的miRNA已經(jīng)高達(dá)上萬(wàn)個(gè)，并被證明參與調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過(guò)程以及眾多的發(fā)育和生理過(guò)程。這些基因主要通過(guò)與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，從而要么在轉(zhuǎn)錄上破壞/降解，要么抑制(或兩者兼而有之)，這取決于miRNA-mRNA的互補(bǔ)程度[3]。

一般來(lái)說(shuō)，miRNAs參與了重要基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這些基因控制著腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵信號(hào)通路，如凋亡、細(xì)胞增殖、血管生成和微環(huán)境的調(diào)節(jié)。各種研究表明miRNAs基因調(diào)控影響與多種信號(hào)通路有關(guān)，如p53、HIF-1α、RAS、AKT、AMPK和cMyc等導(dǎo)致癌癥代謝缺陷的信號(hào)通路。研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA在人類腫瘤中的表達(dá)普遍下調(diào)，而一些研究也報(bào)道了miRNA在癌癥中的過(guò)度表達(dá)[4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miRNA既可以作為癌基因，也可以作為腫瘤抑制因子。由于miRNA在體液中穩(wěn)定表達(dá),且檢測(cè)miRNA水平日趨精準(zhǔn)，miRNA的表達(dá)有助于作為癌癥患者診斷、預(yù)后和治療選擇的新的腫瘤生物標(biāo)志物[5]。

2 MicroRNA調(diào)控相關(guān)通路參與膽囊癌的發(fā)病

膽囊癌的形成是一個(gè)多階段的過(guò)程，在接觸致癌物后，正常膽囊上皮由化生到異型增生再到原位癌，最后轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)性癌。整個(gè)致癌過(guò)程是緩慢的，可能需要長(zhǎng)達(dá)15年的時(shí)間。在分子水平上，惡性轉(zhuǎn)化是由于某些基因突變隨時(shí)間聚集而發(fā)生的，因此原癌基因和抑癌基因、不同的信號(hào)通路等多方面下影響著膽囊癌的進(jìn)展。

2.1 PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路 PTEN是一種具有脂質(zhì)和蛋白雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制因子，可負(fù)向調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移，且PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲[6]。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中miR-205、miR-122、miR-21的表達(dá)能夠抑制PTEN的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。miR-99a-5p在膽囊癌患者組織中普遍低表達(dá)，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)miR-99a-5p能使Akt蛋白的酸磷化水平下降，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路[8]。Xuan等[9]探討了ORA(黃芩素A)對(duì)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)ORA可抑制PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響膽囊癌GBC-SD的進(jìn)展。進(jìn)一步研究證明ORA在體內(nèi)能抑制膽囊腫瘤的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明ORA可能在不久的將來(lái)成為一種潛在的抗腫瘤藥物用于人類膽囊癌的治療。

2.2 c-FLIP信號(hào)通路 c-FLIP是一種重要的參與細(xì)胞凋亡的抑制蛋白，Zong等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-125b在膽囊癌組織中的表達(dá)明顯降低，miR-125b的表達(dá)與膽囊癌的分級(jí)顯著相關(guān)(P=0.036 1)。miR-125b通過(guò)與c-FLIP mRNA的3’端非編碼區(qū)相互作用而抑制c-FLIP的表達(dá)從而起到抑制膽囊癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，揭示了miR-125b-c-flip信號(hào)在膽囊癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要作用。c-FLIP豐富了miR-125b的靶基因通路，有望成為治療GBC的新靶點(diǎn)。

2.3 Notch信號(hào)通路 研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著廣泛而密切的關(guān)系，并可根據(jù)組織或細(xì)胞類型的不同具有致癌或腫瘤抑制功能。已確定4個(gè)Notch受體(Notch 1～4)和5個(gè)Notch配體在Notch信號(hào)通路中發(fā)揮作用[11]。Hua等[12]研究表明miR-1-5p在膽囊癌組織中的表達(dá)明顯低于非腫瘤組織，體外實(shí)驗(yàn)表明miR-1-5p可抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲。miRNAs通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)發(fā)揮其關(guān)鍵作用，Notch2是miR-1-5p的直接靶基因，miR-1-5p通過(guò)靶向Notch2的表達(dá)在膽囊癌細(xì)胞中發(fā)揮腫瘤抑制作用，并為miR-1-5p/Notch2信號(hào)在人膽囊癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲中的精確表達(dá)提供了分子基礎(chǔ)。

2.4 ANGPT2信號(hào)通路 Diao等[13]通過(guò)免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄—定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p在GBC組織中表達(dá)下調(diào), 過(guò)表達(dá)顯著抑制GBC-SD細(xì)胞的增殖和遷移。從熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血管生成素-2(ANGPT2)是GBC中miR-135a-5p的潛在靶基因，抑制ANGPT2表達(dá)可顯著抑制膽囊癌的增殖、遷移和侵襲。因此miR-135a-5p可能是GBC進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物和GBC治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。

2.5 JAK/STAT信號(hào)通路 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)被Janus激酶(JAK)磷酸化、二聚化，然后通過(guò)核膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。該通路被稱為Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號(hào)通路，又稱IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該信號(hào)通路與多種機(jī)體功能相關(guān)，并參與一些重要的生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)。Ishigami等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-31在膽管癌組織中的高表達(dá)，miR-31高表達(dá)與預(yù)后顯著相關(guān)(P=0.043)，miR-31在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，它不僅促進(jìn)細(xì)胞增殖，而且抑制凋亡。IL-6受體是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)的強(qiáng)誘導(dǎo)因子，lL-6的STAT3信號(hào)是癌細(xì)胞增殖和存活的重要促進(jìn)劑。miR-31的靶基因位點(diǎn)STAT-3結(jié)合位點(diǎn)，抑制STAT-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著抑制miR-31的表達(dá)和細(xì)胞增殖。結(jié)論：IL-6-STAT-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控膽管癌細(xì)胞增殖和miR-31表達(dá),提示miR-31可能是一個(gè)很有前途的生物標(biāo)志物。

2.6 EMT信號(hào)通路 上皮細(xì)胞—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-tomesenchymal transition，EMT)是介導(dǎo)包括膽囊癌在內(nèi)的多種癌癥惡變的關(guān)鍵步驟，miRNA可以通過(guò)抑制EMT發(fā)揮抑癌作用。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)在膽囊癌組織中miR-7-2-3p和miR-29c-3p的水平明顯降低，miR-7-2-3p和miR-29c-3p的過(guò)表達(dá)明顯削弱了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞中miR-7-2-3p和miR-29c-3p的Vimentin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)。MiR-7-2-3p和miR-29c3p過(guò)表達(dá)通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT表型，在體內(nèi)外抑制GBC轉(zhuǎn)移。Cui等[16]采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR30-b和miR-30d在膽囊癌組織中的表達(dá)水平均低于正常膽囊組織。miR-30b模擬、miR-30d模擬和miR-30b/-30d模擬引入GBC-SD細(xì)胞，并檢測(cè)了EMT特異性標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin和visionin的表達(dá)，這在miR-30b模擬、miR-30d模擬和miR-30b/-30d模擬處理的人GBC細(xì)胞中表現(xiàn)為E-cadherin增強(qiáng)，N-cadherin和vientin減少。結(jié)果提示miR-30b/-30d 能夠抑制GBC-SD的EMT和侵襲遷移。

3 MicroRNA誘導(dǎo)基因受體在膽囊癌中的作用機(jī)制

除了通路改變外，miRNA表達(dá)失調(diào)可能源于腫瘤抑制因子或致癌因子的改變，這些腫瘤抑制因子或致癌因子作為轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子在腫瘤性疾病的起始、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起到致癌基因或抑癌基因的作用。

3.1 miRNA致癌的作用機(jī)制 Tong等[17]發(fā)現(xiàn)與鄰近組織相比，膽囊癌組織中miR-197高表達(dá)，下調(diào)增殖相關(guān)蛋白p-ERK1/2和p-AKT的表達(dá)，上調(diào)凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2和c-caspase-3的表達(dá)，從而促進(jìn)了膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Song等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-552-3p在膽囊癌組織中表達(dá)上調(diào)，miR-552-3p在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明可促進(jìn)GBC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。重要的抑癌基因RGMA被確定為miR-552-3p的靶點(diǎn)，miR-552-3p通過(guò)直接靶向RGMA的3’-UTR區(qū)域，負(fù)調(diào)控GBC中RGMA的表達(dá)。miR-552-3p通過(guò)抑制腫瘤抑制基因RGMA，導(dǎo)致Akt/β-catenin和EMT信號(hào)通路的重新激活而促進(jìn)膽囊癌的惡性進(jìn)展。miR-552-3p可作為GBC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

3.2 miRNA抑癌的作用機(jī)制 文獻(xiàn)[4]報(bào)道m(xù)iRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)下游特定靶基因抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖。Gong等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-1231在膽囊癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織。miR-1231低表達(dá)的GBC患者腫瘤分期差，腫瘤體積較大，過(guò)表達(dá)降低了GBC細(xì)胞的增殖能力，miR-1231抑制GBC增殖并誘導(dǎo)其凋亡。miRNAs和靶基因之間相互作用可以影響病理進(jìn)展，經(jīng)測(cè)定FOXC2為miR-1231結(jié)合靶基因，F(xiàn)OXC2水平被負(fù)調(diào)控，miR-1231通過(guò)下調(diào)FOXC2，從而減輕GBC的惡性發(fā)展。Jiang等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-365在膽囊癌組織中表達(dá)下調(diào)，抑制膽囊癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和自我更新，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-365在膽囊癌中可能起到抑癌作用。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-188-5p在膽囊癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-188-5p過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)GBC細(xì)胞凋亡,同時(shí)miR-188-5P抑制劑轉(zhuǎn)染后凋亡細(xì)胞減少。在總體生存期方面，miR-188-5p低表達(dá)患者的預(yù)后明顯差于miR-188-5p高表達(dá)患者。劃痕實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-188-5p的NOZ細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量減少，而miR-188-5p下調(diào)則增強(qiáng)了GBC-SD細(xì)胞的侵襲能力。這些數(shù)據(jù)表明miR-188-5p具有抗腫瘤特性，可以抑制GBC的遷移和侵襲。

4 MicroRNA在診斷評(píng)估膽囊癌中的相關(guān)研究

microRNA在膽囊癌診斷和預(yù)后評(píng)估中具有重要的價(jià)值意義。血清等標(biāo)本容易獲取，且其中的miRNA穩(wěn)定，因此為miRNA作為膽囊癌的一種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行臨床檢測(cè)提供了可能性。Li等[22]通過(guò)比較GBC組織和癌旁正常組織中miRNAs的差異表達(dá)，使用MiRNA微陣列分析評(píng)估40例膽囊癌患者外周血樣本中全基因組miRNA的表達(dá)，進(jìn)一步在血漿中驗(yàn)證miRNA21、miRNA187、miRNA143、miRNA202、miRNA335、let7a在膽囊癌患者血漿中的表達(dá)異常，對(duì)膽囊癌診斷具有重大臨床意義，對(duì)制定治療方案和預(yù)后判斷起到重要作用。血漿中miRNA特異表達(dá)譜可能是診斷膽囊癌一類新的血液腫瘤標(biāo)志物,通過(guò)對(duì)血漿中特異性miRNA表達(dá)譜的檢測(cè)來(lái)早期診斷膽囊癌，評(píng)估其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，可以彌補(bǔ)癌胚抗原(CEA)和糖類抗原19-9(CA19-9)早期診斷敏感性低的不足。Gupta等[23]評(píng)估了GBC中分子標(biāo)記物的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證明p53是最常見(jiàn)的陽(yáng)性標(biāo)記占74%，survivin占58%，COX-2(Cyclooxygenase-2)占44%，p16占42%，而Her 2-neu(Human epidermal growth factor receptor 2 )和EZH-2(Enhancer of zeste homolog-2)各占16%，不同分期的p16和p53分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 7.017,P= 0.037；χ2= 5.861,P= 0.033)。研究結(jié)果提示GBC中存在Her 2-neu、p53、p16、survivin、COX-2、ezh-2等分子標(biāo)志物的表達(dá)，今后可用于疾病的早期檢測(cè)和靶向治療。膽汁是膽管上皮細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，在脂肪代謝中發(fā)揮重要的作用。有研究顯示，膽汁外泌體中miR-191、miR-486-3p、miR-1274b、miR-16和miR-484 5種miRNA可作為膽管癌診斷組合，靈敏度和特異度分別為67%和96%，優(yōu)于血清糖類抗原19-9(CA19-9)檢測(cè)[24]。膽汁外泌體在疾病診斷中發(fā)揮重要作用，相對(duì)于其他體液，有關(guān)膽汁外泌體的研究較少，外泌體中所含遺傳信息及其相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入。

此外，有研究結(jié)果鑒定microRNA可作為膽癌患者診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物是有應(yīng)用前景的。Wang等[25]使用微陣列技術(shù)來(lái)鑒定長(zhǎng)期或短期生存的GBC患者中調(diào)節(jié)異常的miRNAs。與正常膽囊癌組織相比，長(zhǎng)期生存的GBC患者癌組織中有104個(gè)miRNAs表達(dá)異常，短期生存的GBC患者癌組織中有124個(gè)miRNAs表達(dá)異常。隨后通過(guò)Venn圖分析，發(fā)現(xiàn)只有hsa-miR-142-5p和hsa-miR-146b-5在長(zhǎng)期生存的GBC患者中表達(dá)下調(diào)，而22個(gè)miRNAs在短期生存的GBC患者中完全表達(dá)異常，說(shuō)明這些miRNAs可能與GBC患者的生存有關(guān)，提示它們可能是診斷膽囊癌預(yù)后的新指標(biāo)。這些臨床對(duì)照研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA在膽囊癌患者與健康人群之間存在顯著差異性表達(dá)，這為miRNA成為膽囊癌潛在診斷標(biāo)志物奠定了理論基礎(chǔ)。

5 小結(jié)與展望

膽囊癌的發(fā)病率近幾十年來(lái)呈上升趨勢(shì)，迫切需要研究新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物以及確定膽囊癌的潛在發(fā)病機(jī)制。目前miRNA已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)，要弄清miRNA在膽囊癌中的價(jià)值，還需要通過(guò)進(jìn)行更多的相關(guān)研究來(lái)進(jìn)一步探索它們。因此，在后續(xù)的研究中，筆者將繼續(xù)關(guān)注miRNA在膽囊癌中的相關(guān)研究進(jìn)展，以證實(shí)其臨床應(yīng)用的可靠性。