結(jié)合虛擬單像素成像解卷積的雙邊照明光片熒光顯微技術(shù)*

胡金虎 林丹櫻? 張煒 張晨爽 屈軍樂(lè) 于斌?

1) (深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

2) (佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院,佛山 528137)

光片熒光顯微術(shù)(light-sheet fluorescence microscopy,LSFM)采用薄片光束從側(cè)面激發(fā)樣品,在垂直于光片方向上進(jìn)行成像,具有成像速度快、光學(xué)層析能力強(qiáng)以及光漂白和光毒性低等優(yōu)點(diǎn),適用于對(duì)較大活體生物樣品進(jìn)行高質(zhì)量、長(zhǎng)時(shí)間三維動(dòng)態(tài)觀測(cè).然而,傳統(tǒng)高斯光束LSFM存在分辨率低和成像視場(chǎng)小的問(wèn)題.本文在雙邊照明LSFM的基礎(chǔ)上,結(jié)合虛擬單像素成像解卷積技術(shù),提出了一種大視場(chǎng)高分辨雙邊照明LSFM,實(shí)現(xiàn)了視場(chǎng)和分辨率的同時(shí)提升.設(shè)計(jì)和搭建了雙邊照明LSFM,開(kāi)展了熒光珠和轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)樣品的三維光切片顯微成像實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了系統(tǒng)的三維高分辨成像能力,對(duì)于大視場(chǎng)、高分辨LSFM的發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義.

1 引言

光片熒光顯微術(shù)(light-sheet fluorescence microscopy,LSFM),也稱選擇性平面照明顯微術(shù)(selective plane illumination microscopy,SPIM)[1],它采用激發(fā)光路與探測(cè)光路相互垂直的特殊設(shè)計(jì),即利用薄片光束從側(cè)面激發(fā)樣品,并通過(guò)垂直光片方向的顯微物鏡和探測(cè)器獲取照明層面的熒光圖像,從而避免非成像平面的熒光信號(hào)干擾,實(shí)現(xiàn)厚樣品的三維層析成像.與同樣具有光學(xué)層析成像能力的共聚焦及雙光子熒光顯微成像技術(shù)相比,LSFM采用光片面照明寬場(chǎng)成像取代點(diǎn)掃描成像方式,成像速度快,樣品受光照時(shí)間大幅縮短,光漂白和光毒性低,適用于對(duì)較大活體生物樣品進(jìn)行高質(zhì)量、長(zhǎng)時(shí)間三維動(dòng)態(tài)觀測(cè).目前,LSFM已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域的研究[2].

早期LSFM或SPIM中的照明光片一般是由高斯光束通過(guò)狹縫和柱面鏡聚焦產(chǎn)生的[3,4],能量利用率低,且光片沿傳播方向的強(qiáng)度不均勻,容易受樣品吸收和散射影響,光片有效照明深度有限,成像視場(chǎng)較小.Swoger等[5]和Krzic等[6]提出了雙邊照明LSFM,利用兩個(gè)相反方向的高斯光片同時(shí)激發(fā)樣品,成功減少了散射的影響,提升了照明深度,擴(kuò)大了成像視場(chǎng).2008年,Keller等[7]提出利用高斯光束快速掃描形成虛擬光片以進(jìn)一步改善高斯光片的光強(qiáng)均勻性,不僅光能利用率高(可達(dá)95%),還可以生成多種類型的光片.但由于掃描速度很快,需要比靜態(tài)高斯光片更高的峰值激發(fā)功率.隨后LSFM研究進(jìn)入一個(gè)高速發(fā)展階段,各種新型的LSFM相繼出現(xiàn),并被廣泛應(yīng)用于斑馬魚(yú)、果蠅等模式生物的發(fā)育過(guò)程研究[8,9].

然而這些基于高斯光束的LSFM技術(shù)在應(yīng)用于強(qiáng)散射的活體組織等厚樣品成像時(shí),其視場(chǎng)和分辨能力仍十分有限.為此,貝塞爾光束、艾里光束等無(wú)衍射光束被相繼應(yīng)用于產(chǎn)生數(shù)字掃描的照明光片并較好地解決了LSFM視場(chǎng)受限的問(wèn)題[10?13].但無(wú)衍射光束光片存在旁瓣,會(huì)導(dǎo)致非焦平面的樣品激發(fā),既降低了成像質(zhì)量,又增大了對(duì)樣品的光毒性,因此需要設(shè)法消除其影響[14].此外,也有文獻(xiàn)[15]報(bào)道了利用平鋪拼接的方法實(shí)現(xiàn)了大視場(chǎng)成像.為了進(jìn)一步提高LSFM的空間分辨率,研究人員還將LSFM與多種超分辨熒光顯微術(shù)結(jié)合[16?23],以期實(shí)現(xiàn)對(duì)活體生物厚樣品的超高時(shí)空分辨顯微成像.例如,2014年,Betzig研究組[24]發(fā)明了晶格光片顯微術(shù)(lattice light-sheet microscopy,LLSM),利用貝塞爾光學(xué)晶格大幅減小了光片厚度并抑制了旁瓣,提升了LSFM的層析能力和掃描速度,結(jié)合結(jié)構(gòu)光照明超分辨技術(shù),LLSM可成功以較高的時(shí)空分辨率研究活細(xì)胞內(nèi)甚至活體組織內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程.然而,受生物樣品散射影響,其典型的成像深度也只有20 μm,限制了在活體厚樣品中的應(yīng)用,且這種技術(shù)光學(xué)掃描系統(tǒng)復(fù)雜,不便推廣應(yīng)用.

綜上,如何在保持LSFM成像速度快、光學(xué)層析能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)厚樣品的大視場(chǎng)、高分辨三維成像,仍然是LSFM發(fā)展及其推廣應(yīng)用面臨的關(guān)鍵問(wèn)題.研究和開(kāi)發(fā)新型LSFM系統(tǒng)和方法,進(jìn)一步提升其性能,使其更適用于活體厚樣品的高分辨快速三維成像,對(duì)于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究具有重要的意義.

本課題組在前期研究工作中提出了一種新的寬場(chǎng)超分辨成像解卷積算法,即虛擬單像素成像(virtual single-pixel imaging,v-SPI)[25]技術(shù),采用數(shù)字結(jié)構(gòu)光模板調(diào)制寬場(chǎng)熒光圖像,并根據(jù)積分等量關(guān)系將虛擬調(diào)制圖像轉(zhuǎn)換為單像素成像數(shù)據(jù),進(jìn)而結(jié)合單像素圖像重構(gòu)技術(shù)獲得寬場(chǎng)超分辨圖像.v-SPI可將寬場(chǎng)熒光顯微成像的橫向分辨率提高2倍,與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)可相比擬,但由于只需采集單幅寬場(chǎng)圖像,成像速度至少提高了9倍.在此基礎(chǔ)上,本文提出了基于v-SPI的大視場(chǎng)高分辨雙邊照明LSFM (dual-sided illumination LSFM,dLSFM)成像方法和系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)高斯光束LSFM視場(chǎng)和分辨率的同時(shí)提升.設(shè)計(jì)和搭建了dLSFM系統(tǒng),開(kāi)展了熒光珠和斑馬魚(yú)樣品的三維光切片顯微成像實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了系統(tǒng)的分辨率和視場(chǎng);編制了v-SPI圖像重構(gòu)程序,實(shí)現(xiàn)了厚樣品的高分辨光切片層析成像和三維圖像重構(gòu);實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,系統(tǒng)具有同時(shí)提升LSFM視場(chǎng)和分辨率的能力,為高分辨率LSFM進(jìn)一步發(fā)展及其在活體厚樣品快速高分辨成像方面的應(yīng)用提供理論和技術(shù)基礎(chǔ).

2 系統(tǒng)與方法

2.1 dLSFM系統(tǒng)設(shè)計(jì)與搭建

所搭建的雙邊LSFM系統(tǒng)示意圖如圖1所示.首先,波長(zhǎng)為488 nm的固體激光器(Sapphire 488-200 CW CDRH,Coherent,)發(fā)出的激光束經(jīng)透鏡L1 (f1=25 mm)和L2 (f2=250 mm)擴(kuò)束準(zhǔn)直后經(jīng)反射鏡M1、分束鏡BS分為兩束:一束沿原方向傳播,經(jīng)狹縫MS1、柱透鏡CL1聚焦后再經(jīng)過(guò)照明物鏡IO1(10×/NA0.3水鏡,尼康)形成光片;另一束經(jīng)反射鏡M2,M3和M4后,經(jīng)狹縫MS2和柱透鏡CL2進(jìn)入照明物鏡IO2,形成另一側(cè)的光片.其中,兩路光中狹縫、柱透鏡和物鏡的參數(shù)和相對(duì)位置保持相同,且物鏡的前焦面均要與柱透鏡的后焦面重合,光片的厚度和寬度可通過(guò)改變狹縫的寬度來(lái)調(diào)節(jié).這樣,兩束激發(fā)光以相反方向匯入樣品池,生成的兩束光片在同一焦面處對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā).樣品產(chǎn)生的熒光信號(hào)通過(guò)探測(cè)物鏡DO(40×/NA0.8水鏡,尼康)、濾光片F(xiàn)和管鏡TL,在高靈敏度sCMOS相機(jī)(ORCA-Fusion BT,像素?cái)?shù)2304 × 2304,像素尺寸6.5 μm × 6.5 μm,濱松)上成像.樣品固定在一個(gè)4D微米位移臺(tái)(USB 4D-Stage,Picard Industries,)上,可在電機(jī)系統(tǒng)控制下實(shí)現(xiàn)X,Y,Z和R方向上的移動(dòng),實(shí)現(xiàn)成像區(qū)域的選擇和軸向掃描三維成像.

圖1 dLSFM 系統(tǒng)光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of the dLSFM system.

2.2 光片性能參數(shù)分析

光片的厚度和寬度決定了LSFM的軸向分辨率和視場(chǎng),且二者相互制約,由照明物鏡的等效數(shù)值孔徑NAill決定.光片的厚度和寬度均隨著NAill值的增大而減小,即系統(tǒng)軸向分辨率提升的同時(shí)成像視場(chǎng)變小.理想的LSFM成像要求光片厚度盡可能薄且強(qiáng)度均勻,因此如何生成厚度薄而視場(chǎng)大的光片一直以來(lái)都是LSFM追求的重要目標(biāo).本文所搭建的雙邊照明LSFM系統(tǒng),與傳統(tǒng)單邊照明的高斯光束LSFM系統(tǒng)相比,能在保持光片厚度不變的情況下擴(kuò)大系統(tǒng)的視場(chǎng),還能通過(guò)改變狹縫的大小生成多種不同厚度和視場(chǎng)的光片,來(lái)適應(yīng)不同的樣品成像.在本文涉及的實(shí)驗(yàn)中,狹縫的寬度設(shè)置為6 mm,則相應(yīng)的照明物鏡NAill值為0.15.可利用均勻羅丹明溶液對(duì)光片的光學(xué)參數(shù)進(jìn)行標(biāo)定.此時(shí)需要將柱面鏡旋轉(zhuǎn)90°,使光片方向垂直于探測(cè)面,從側(cè)面采集光片圖像,結(jié)果如圖2所示.對(duì)其強(qiáng)度分布進(jìn)行高斯擬合,得到高斯光片束腰處的強(qiáng)度輪廓的半高寬(full width at half maximum,FWHM)厚度為1.9 μm,單邊照明時(shí)視場(chǎng)為53.8 μm,雙邊同時(shí)照明時(shí)在光片厚度不變的情況下視場(chǎng)為106.3 μm,近似為單邊照明時(shí)的2倍.

圖2 用于厚度和寬度標(biāo)定的光片側(cè)視圖 (a) 通道I單邊照明時(shí)的光片;(b) 雙邊照明時(shí)的光片;(c) 通道II單邊照明時(shí)的光片F(xiàn)ig.2.Side view images of light sheet for thickness and width calibration:(a) Single-sided illumination with the path I;(b) dualsided illumination;(c) single-sided illumination with path II.

2.3 超分辨圖像重構(gòu)方法

在寬場(chǎng)熒光顯微成像中,常用解卷積技術(shù)來(lái)濾除非焦面背景熒光噪聲,進(jìn)而提高焦面圖像的對(duì)比度.與傳統(tǒng)的解卷積方法相比,v-SPI方法除了提高圖像對(duì)比度,還可以顯著提高圖像的分辨率,實(shí)現(xiàn)單幀寬場(chǎng)圖像的超分辨重構(gòu)[25].其基本原理基于如下積分等量關(guān)系:

其中S為理想像(對(duì)應(yīng)樣品的真實(shí)分布),h為系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),?表示卷積運(yùn)算,因此S?h為寬場(chǎng)圖像;P為虛擬數(shù)字模板,?表示點(diǎn)積運(yùn)算,(S?h)·P表示對(duì)寬場(chǎng)圖像進(jìn)行虛擬調(diào)制.

v-SPI技術(shù)首先采用虛擬數(shù)字模板調(diào)制普通寬場(chǎng)熒光圖像,然后根據(jù)該積分等量關(guān)系將虛擬調(diào)制圖像轉(zhuǎn)換為單像素成像數(shù)據(jù),再結(jié)合單像素圖像重構(gòu)技術(shù)實(shí)現(xiàn)超分辨圖像的重構(gòu).根據(jù)采集的熒光圖像、數(shù)字模板和系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)計(jì)算出積分值和卷積模板.因此,可以采用SPI方程求解方法重構(gòu)出待求的樣品分布.在實(shí)際樣品重構(gòu)過(guò)程中使用的是簡(jiǎn)單數(shù)字模板,每個(gè)模板上僅有一個(gè)像素亮度輪流設(shè)置為1,其余像素亮度設(shè)置為0.在本文中,v-SPI技術(shù)被用于改善dLSFM系統(tǒng)的空間分辨率,從而達(dá)到同時(shí)提升LSFM視場(chǎng)和分辨率的目的.

3 成像結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)分辨率標(biāo)定

為了驗(yàn)證dLSFM系統(tǒng)的成像能力,以直徑100 nm的熒光珠為樣品對(duì)該系統(tǒng)的分辨率進(jìn)行標(biāo)定.在實(shí)驗(yàn)之前,首先,利用體積濃度為1%的瓊脂糖溶液將原始熒光珠溶液(TetraSpeckTM微球,0.1 μm,1.8 × 1011個(gè)/mL,ThermoFisher)稀釋200倍左右,搖勻以后將混合溶液吸入到氟化乙烯丙烯(FEP)細(xì)管(外徑為1.6 mm,內(nèi)徑為0.8 mm)中,在室溫下放置5 min左右,混合溶液成凝膠狀態(tài),然后將FEP浸入到充滿水的樣品池中,從FEP中推出熒光珠凝膠,對(duì)熒光珠進(jìn)行成像,結(jié)果如圖3所示.選取視場(chǎng)范圍內(nèi)的若干熒光珠圖像進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì),以每個(gè)熒光珠強(qiáng)度分布曲線的FWHM作為其尺寸并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(N=25),以其平均值表征系統(tǒng)的橫向分辨率(這里以X方向的分辨率為例).熒光珠尺寸的統(tǒng)計(jì)直方圖如圖3(b)和圖3(d)所示,其中前者為未采用v-SPI技術(shù)處理的結(jié)果,熒光珠直徑的平均值為407 nm±14 nm,后者為利用v-SPI處理后的結(jié)果,熒光珠直徑的平均值減小為300 nm±15 nm.可見(jiàn),雙邊照明LSFM系統(tǒng)獲取的光片熒光顯微圖像經(jīng)v-SPI技術(shù)處理后,橫向分辨率提升了約26%.

圖3 用于系統(tǒng)成像分辨率標(biāo)定的直徑100 nm熒光珠圖像及其尺寸統(tǒng)計(jì)直方圖 (a) 未經(jīng)v-SPI處理的圖像;(b) 圖(a)中熒光珠沿X方向強(qiáng)度曲線FWHM的直方圖分布(N=25);(c) 經(jīng)v-SPI處理的圖像;(d) 圖(c)中相同熒光珠沿X方向強(qiáng)度曲線FWHM的直方圖分布;為平均值Fig.3.Images of 100-nm-diameter fluorescent beads for system resolution calibration:(a) Image without v-SPI processing;(b) the corresponding histogram distribution of the intensity profile FWHM from 25 fluorescent beads in X direction;(c) image with v-SPI processing;(d) the corresponding FWHM histogram distribution from the same beads in X direction; is the average value.

3.2 成像視場(chǎng)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證雙邊照明LSFM系統(tǒng)的成像視場(chǎng),選用心血管特異標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(CZ62,s843 Tg/+,Tg(kdrl:EGFP),國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心)作為實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行成像.圖4所示為斑馬魚(yú)心臟附近血管結(jié)構(gòu)的成像結(jié)果,其中圖4(a)為通道I成像結(jié)果,圖4(b)為雙通道成像結(jié)果,圖4(c)為通道II成像結(jié)果.從圖4中可以可出,單通道成像,即采用單邊照明時(shí),由于樣品的散射,照明光束的穿透深度有限,成像視場(chǎng)受限;而雙邊照明可以成倍地增加穿透深度,擴(kuò)大了系統(tǒng)的成像視場(chǎng).

圖4 斑馬魚(yú)血管結(jié)構(gòu)的大視場(chǎng)成像 (a) 通道I單邊照明成像;(b) 雙邊照明成像;(c) 通道II單邊照明成像Fig.4.Large FOV imaging of vascular structures in a zebrafish:(a) Single-sided illumination imaging with path I;(b) dual-sided illumination imaging;(c) single-sided illumination imaging with path II.

進(jìn)一步地,通過(guò)比較雙邊照明LSFM系統(tǒng)獲取的大視場(chǎng)生物樣品圖像在經(jīng)過(guò)v-SPI技術(shù)處理前后的效果,驗(yàn)證本文所提技術(shù)在同時(shí)提升視場(chǎng)和分辨率方面的能力,結(jié)果如圖5所示.實(shí)驗(yàn)樣品為神經(jīng)系統(tǒng)特異性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(CZ79,ml3Tg/+,Tg(mnx1:mGFP),國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心).圖5(a)為dLSFM系統(tǒng)采集的未經(jīng)特殊處理的原始圖像,圖5(b)為采用傳統(tǒng)Richardson-Lucy(RL)解卷積算法處理的圖像,圖5(c)為采用v-SPI算法處理的圖像,圖5(d)為對(duì)三個(gè)圖像中劃線的同一位置的歸一化強(qiáng)度曲線.對(duì)比圖像(圖5(c))和強(qiáng)度曲線(圖5(d))可以明顯看出,雙邊照明LSFM系統(tǒng)獲取的大視場(chǎng)生物樣品圖像經(jīng)v-SPI技術(shù)處理后,圖像的對(duì)比度和分辨率均得到明顯提升,且效果比傳統(tǒng)RL算法更好.該結(jié)果同時(shí)也和前文100 nm熒光珠的分辨率標(biāo)定結(jié)果相符合.可見(jiàn),結(jié)合了v-SPI技術(shù)的雙邊照明LSFM,可以在實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)成像的前提下獲得較高的分辨率,即同時(shí)實(shí)現(xiàn)LSFM視場(chǎng)和分辨率的提升,適合用于較厚生物樣品的成像.

圖5 斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元成像(a)未經(jīng)特殊處理的圖像;(b)RL解卷積處理的圖像;(c) v-SPI處理圖像;(d) 圖(a)?(c)中黃色色實(shí)線標(biāo)記位置的歸一化強(qiáng)度曲線Fig.5.Images of motoneurons in a zebrafish:(a) Image without special processing;(b) image with RL deconvolution;(c) image with v-SPI processing;(d) normalized intensity profiles along the yellow solid lines in panels (a)?(c).

3.3 厚樣品三維成像

為了驗(yàn)證系統(tǒng)對(duì)厚樣品的三維成像能力,利用上述神經(jīng)系統(tǒng)特異標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)作為樣品進(jìn)行成像,通過(guò)微米位移臺(tái)的軸向移動(dòng)采集運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的光切片數(shù)據(jù)并進(jìn)行三維重構(gòu).采集間隔為1 μm,共采集20幅源圖像進(jìn)行三維重構(gòu),結(jié)果如圖6所示,其中圖6(a)—(c)為不同采集深度的二維圖像,圖6(d)和圖6(e)為三維重建后不同視角的效果圖.所有圖像均已用v-SPI技術(shù)進(jìn)行處理.

圖6 斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的三維成像 (a)?(c) 不同軸向位置拍攝的圖像;(d),(e)三維重建效果圖Fig.6.Three-dimensional imaging of motoneurons in a zebrafish:(a)?(c) Images from different axial positions;(d),(e) three-dimensional reconstruction renderings.

4 結(jié)論

本文將雙邊照明光片熒光顯微技術(shù)與虛擬單像素成像技術(shù)相結(jié)合,發(fā)展了一種大視場(chǎng)高分辨光片熒光顯微成像技術(shù),相比傳統(tǒng)高斯光束LSFM,可將視場(chǎng)擴(kuò)大至原來(lái)的兩倍(達(dá)到約100 μm),同時(shí)可將系統(tǒng)橫向分辨率提升約26%,并實(shí)現(xiàn)了對(duì)斑馬魚(yú)等較大生物樣品的三維高分辨率層析成像,為進(jìn)一步開(kāi)展活體生物樣品快速高分辨成像以及生物樣品的超分辨成像奠定了基礎(chǔ).