金匱腎氣丸防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制研究

李偉杰 梁潤英

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的常見全身性骨骼疾病，典型臨床表現(xiàn)為疼痛、脆性骨折、脊柱變形等[1]；并且OP與年齡及性別關(guān)系密切[2]。當(dāng)前OP的主要治療藥物有骨吸收抑制劑、骨形成促成劑和其他機(jī)制類藥物，如長期使用則會有一定不良反應(yīng)；某些臨床基礎(chǔ)病的OP患者，使用這些藥物時(shí)也有一定限制[3]。中醫(yī)藥防治OP逐漸被普通民眾和患者認(rèn)可，引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[4-5]。據(jù)OP臨床表現(xiàn)將其歸于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”“骨枯”范疇，主要病機(jī)為腎精虧虛，髓海空虛，骨失濡養(yǎng)[6]。

金匱腎氣丸(Jinkui Shenqi Pills，JSP)出自漢·張仲景《金匱要略》，由熟干地黃、山藥、山茱萸、桂枝、附子、澤瀉、茯苓、牡丹皮組成，可補(bǔ)腎固本，填精益髓，腎之精氣旺，則骨髓得充、筋肉得養(yǎng)。但目前對該方防治OP作用機(jī)制的研究較少，故本研究以探索“藥物-疾病”之間的關(guān)系為本，從宏觀至微觀層面挖掘JSP防治OP的主要成分、關(guān)鍵靶標(biāo)基因和信號通路等，系統(tǒng)探討其作用機(jī)制，揭示中醫(yī)藥復(fù)方“多成分-多途徑-多靶點(diǎn)”的作用機(jī)理，為JSP防治OP的機(jī)制研究與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供參考依據(jù)，也為治療OP提供理論支撐，從而推動(dòng)經(jīng)方的現(xiàn)代化研究進(jìn)程。

1 資料與方法

1.1 JSP活性成分及潛在作用靶標(biāo)收集

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索JSP中熟地、山藥、山茱萸、桂枝、附子、澤瀉、茯苓、牡丹皮的活性成分；以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18篩選活性成分。將篩選得到的各中藥活性成分所對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白名輸入STRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫，映射出標(biāo)準(zhǔn)基因名。建立JSP“藥物-活性成分-靶標(biāo)基因(Herb-Ingredient-Target，H-I-T)”數(shù)據(jù)集，用Cytoscape3.6構(gòu)建“H-I-T”網(wǎng)絡(luò)圖，用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，以Degree≥50為標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)藥效和靶標(biāo)重要性，獲取和分析關(guān)鍵活性成分。

1.2 OP疾病基因、與JSP藥靶交集基因信息收集

以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞在DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www. genecards.org/)中查詢疾病基因后去重、整合，建立疾病基因數(shù)據(jù)集。取JSP活性成分靶標(biāo)和OP疾病基因交集，制作韋恩圖，探究JSP活性成分對OP靶標(biāo)的靶向作用。

1.3 JSP-OP交集靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選

將JSP-OP共同靶標(biāo)基因輸入STRING，設(shè)置“Homo sapiens”為物種，“high confidence(0.700)”為最低相互作用閾值，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)，得到蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)文本信息后輸入Cytoscape3.6，獲取可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖；關(guān)鍵基因在相關(guān)通路中會影響其他基因調(diào)控，用CytoHubba 插件[7]對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，MCC值越高節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要；Degree值越大越可靠，故以二者為參考，識別和篩選關(guān)鍵基因。

1.4 關(guān)鍵基因GO、KEGG通路富集分析

將關(guān)鍵基因輸入David(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，富集分析GO生物功能與KEGG通路，以P≤0.05表示結(jié)果顯著性，P值越小越顯著。按P值由小到大排序，將GO生物功能中富集度高的前10名生物途徑(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)及前30名 KEGG通過Omicshare工具( http://www.omicshare．com/tools/)用高級氣泡圖形式展現(xiàn)，再通過京都基因與基因組百科全書(https://www.kegg.jp/)描述通路，找出重要通路并標(biāo)記關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 JSP“藥物-活性成分-靶標(biāo)基因”數(shù)據(jù)收集結(jié)果與H-I-T網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.1金匱腎氣丸“藥物-活性成分-靶標(biāo)基因”數(shù)據(jù)：篩選后刪除重復(fù)項(xiàng)并剔除未匹配到靶標(biāo)者，符合OB≥30%、DL≥0.18并可進(jìn)一步研究的活性成分有47個(gè)，詳見圖1和表1。經(jīng)STRIN映射刪除重復(fù)項(xiàng)及非人體作用后的活性成分蛋白靶標(biāo)，得到藥靶基因196個(gè)。

圖1 活性成分及對應(yīng)靶標(biāo)基因數(shù)據(jù)Fig.1 Data of active ingredients and corresponding target genes

表1 47種重要活性成分及對應(yīng)靶標(biāo)數(shù)Table 1 Data of 47 active ingredients and corresponding targets

2.1.2金匱腎氣丸“H-I-T”網(wǎng)絡(luò)圖：圖2為“H-I-T”網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)有251個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 212條邊，圖中黃色菱形節(jié)點(diǎn)為JSP中藥物，紅色“V”形節(jié)點(diǎn)為藥物活性成分，綠色圓形節(jié)點(diǎn)為藥物活性成分的靶標(biāo)基因。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，Degree≥50的活性成分有：槲皮素(Quercetin，145)、豆甾淳(Stigmasterol，81)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol，62)、山柰酚(Kaempferol，57)，可能為JSP防治OP的主要活性成分。圖3為“H-I-T”部分聚集網(wǎng)絡(luò)，更清晰地展示了中藥、活性成分、靶標(biāo)基因間通過“邊”相連，它們之間相互作用，體現(xiàn)了JSP發(fā)揮治療作用時(shí)“多成分-多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。

圖2 中藥-活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)(H-I-T network)Fig.2 Herb-ingredient-target network

圖3 中藥-活性成分-靶標(biāo)部分聚集網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Herb-ingredient-target partial aggregation network

2.2 OP疾病基因及與JSP藥靶基因的交集基因信息

將在DisGeNET和GeneCards 檢索到的OP疾病基因去重后歸一整合，得到4 416個(gè)疾病基因。取疾病基因與196個(gè)JSP藥靶基因的交集，獲得145個(gè)JSP防治OP的潛在可能靶標(biāo)基因，Venn圖見圖4。

圖4 JSP-OP藥物靶標(biāo)基因與疾病基因Venn圖Fig.4 Venn diagram of JSP-OP

2.3 關(guān)鍵基因篩選結(jié)果及JSP-OP交集和關(guān)鍵靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)

取MCC值前50的基因，按Degree值由大到小排序，排名前30的基因即為關(guān)鍵基因，詳見表2。構(gòu)建JSP-OP交集和關(guān)鍵靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)后有8個(gè)基因未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，故該網(wǎng)絡(luò)有137個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 116條邊。圖5中八邊形節(jié)點(diǎn)為107個(gè)非關(guān)鍵基因，菱形節(jié)點(diǎn)為30個(gè)關(guān)鍵基因，節(jié)點(diǎn)越大說明其MCC和Degree值越高，在網(wǎng)絡(luò)中作用越顯著。圖與表結(jié)合，推測AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN可能為JSP防治OP的核心靶標(biāo)。

表2 30個(gè)關(guān)鍵基因信息數(shù)據(jù)Table 2 Information of 30 key genes

圖5 JSP-OP交集和關(guān)鍵靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network of JSP-OP target genes

2.4 關(guān)鍵基因 GO生物功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4.1GO生物功能富集分析結(jié)果：結(jié)合GO富集結(jié)果及氣泡圖，可得JSP-OP關(guān)鍵基因主要參與的生物途徑有藥物反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控和DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控；分子功能主要有酶、相同蛋白以及蛋白等的結(jié)合；關(guān)鍵基因主要調(diào)控核漿、胞漿、細(xì)胞核等細(xì)胞組分，詳見圖6。

圖6 GO生物功能富集分析Fig.6 GO biological enrichment analysis

2.4.2KEGG通路富集分析結(jié)果：通路富集后共得到85條相關(guān)信號通路，篩選后排名前30的通路詳細(xì)信息氣泡圖見圖7。根據(jù)氣泡大小及表現(xiàn)，忽略與“cancer”及其他明確疾病直接相關(guān)的通路，JSP-OP交集和關(guān)鍵基因所涉及的重要通路有：TNF、MAPK、PI3K-Akt等，通路詳圖見圖8～10。以紅色和綠色分別標(biāo)記JSP-OP交集關(guān)鍵基因與非關(guān)鍵基因可能作用的潛在靶標(biāo)。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathways of the intersecting target genes

圖8 TNF 信號通路Fig.8 TNF signaling pathway

3 討論

《素問·六節(jié)藏象論》言“腎者……其充在骨”，《靈樞·經(jīng)脈篇》又言：“足少陰氣絕，則骨枯”，而OP的中醫(yī)病因病機(jī)總以腎之虛損為主，故當(dāng)補(bǔ)腎固本、填精益髓；臨床實(shí)踐表明，金匱腎氣丸可使腎之精氣旺，骨髓得充、筋肉得養(yǎng)，對OP有很好的防治效果。槲皮素和山萘酚主要來自JSP中的牡丹皮，牡丹皮有活血散瘀之功，又能通利經(jīng)脈，可促使腎中精氣的蒸騰氣化；研究表明槲皮素能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化活性，抑制破骨細(xì)胞骨吸收、誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和骨向分化，并通過上調(diào)BMP2和Smad4 的表達(dá)改善骨質(zhì)疏松癥[8-9]；高劑量山萘酚可調(diào)節(jié)體內(nèi)Ca2+的代謝平衡，促進(jìn)骨膠原生成并減少骨小梁丟失，故對OP有治療作用[10]。β-谷甾醇和豆甾醇均屬植物甾醇類，主要存在熟地黃、山藥、山茱萸、桂枝中，JSP方以熟地為君，“填骨髓，長肌肉”，滋陰血補(bǔ)腎精；山藥健脾固腎，助地黃生腎精之功，山茱萸補(bǔ)益肝腎，兩藥合用，滋養(yǎng)腎精，亦可促使腎精發(fā)揮正常生理作用；桂枝溫通經(jīng)脈，輔地黃、山茱萸、山藥以陽中求陰，使腎中精氣充盛，機(jī)體氣化歸于正常；β-谷甾醇能促進(jìn)成骨作用、有效抑制破骨作用達(dá)到護(hù)骨的目的，且能作用于卵巢顆粒細(xì)胞(骨細(xì)胞外的另一靶部位)，促使其產(chǎn)生分別與成骨及破骨細(xì)胞膜上雌激素受體結(jié)合的E2，協(xié)同調(diào)節(jié)骨代謝平衡[11]。

圖9 MAPK 信號通路Fig.9 MAPK signaling pathway

圖10 PI3K-Akt 信號通路Fig.10 PI3K-Akt signaling pathway

NCOA2表達(dá)在多種激素反應(yīng)組織上，參與生殖發(fā)育、骨形態(tài)發(fā)生、癌癥及其他病理情況[12]。PTGS2又稱COX-2，與細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，中性粒細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥的機(jī)制之一是COX-2的分泌，下調(diào)COX-2能減輕炎癥反應(yīng)[13]。骨形成與骨破壞失衡是OP發(fā)病的重要原因，JSP中槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等重要活性成分通過整體調(diào)控激素水平、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等抑制骨吸收和促進(jìn)骨生成方面，促進(jìn)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞平衡；炎癥和破骨細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致OP[14]，以上重要活性成分均有抗炎作用，而PTGS2也可能是JSP防治OP的重要一環(huán)。綜上，JSP中槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等主要藥物活性及其對應(yīng)的較為顯著的靶標(biāo)基因NCOA2、PTGS2之間相互影響、相互作用，可能為防治OP的關(guān)鍵。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析和關(guān)鍵基因篩選結(jié)果表明，JSP作用于OP的關(guān)鍵靶標(biāo)基因?yàn)锳KT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN。AKT家族基因與骨骼肌肉的發(fā)育密切相關(guān)，可調(diào)控細(xì)胞生存、增殖、代謝、凋亡[15]，敲除大鼠AKT1與AKT2基因，其骨骼、肌肉表現(xiàn)為發(fā)育不全[16-17]，考慮破骨細(xì)胞活性大于成骨細(xì)胞。目前未見TP53與OP發(fā)生機(jī)制的研究，但可明確：藥物干預(yù)能激活相應(yīng)靶標(biāo)基因，引導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化及破骨細(xì)胞凋亡，提示JSP中相關(guān)活性成分通過TP53誘導(dǎo)成骨或破骨細(xì)胞生物學(xué)過程對OP產(chǎn)生影響。IL6是調(diào)節(jié)骨吸收的促炎細(xì)胞因子，其水平增加可刺激破骨細(xì)胞形成并誘導(dǎo)其活性增強(qiáng)，致骨代謝失衡性骨質(zhì)疏松，拮抗或敲除IL6可阻止骨小梁中破骨細(xì)胞增加[18-19]。MAPK1和MAPK8均屬M(fèi)APK激酶家族，參與細(xì)胞生長及分化調(diào)節(jié)，能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化，調(diào)節(jié)骨形成[20]；JUN為快速反應(yīng)基因，與靶基因上調(diào)節(jié)區(qū)AP-1位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化，并在其相關(guān)基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用[21]。OP與成骨細(xì)胞產(chǎn)生率和破骨細(xì)胞凋亡率密不可分，調(diào)控關(guān)鍵靶標(biāo)基因可使二者處于平衡狀態(tài)，即通過調(diào)節(jié)骨代謝防治OP[22]。

GO富集分析結(jié)果表明JSP發(fā)揮效應(yīng)的細(xì)胞場所與其生物功能過程相一致：在胞外及蛋白質(zhì)復(fù)合物上進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)合代謝、調(diào)控及酶結(jié)合，進(jìn)而參與到包括氧化、藥物、氨基酸等應(yīng)激反應(yīng)在內(nèi)的復(fù)雜生物過程；在細(xì)胞核區(qū)參與轉(zhuǎn)錄因子、DNA及RNA特異性結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、凋亡等細(xì)胞周期過程。上述JSP-OP關(guān)鍵基因調(diào)控成骨與破骨細(xì)胞所涉及的細(xì)胞增殖分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及受體結(jié)合等文獻(xiàn)報(bào)道，與本研究GO富集結(jié)果一致。

通路富集結(jié)果顯示，TNF、MAPK、PI3K-Akt等信號通路富集大量關(guān)鍵基因；HIF-1、Toll樣受體、雌激素、破骨細(xì)胞分化等信號通路富集較多關(guān)鍵基因；以上通路可能為JSP防治OP的關(guān)鍵通路。TNF信號通路主要傳導(dǎo)炎性因子，炎性因子TNF-α參與絕經(jīng)后OP的發(fā)生，抑制成骨細(xì)胞并促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，還可促進(jìn)RANKL的表達(dá)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[23-24]。MAPK信號通路通過調(diào)控細(xì)胞增殖分化發(fā)揮相應(yīng)生物功能，在骨代謝平衡方面作用重要[25]。PI3K-Akt信號通路在細(xì)胞生物過程和骨代謝方面都很重要，PI3K-Akt途徑的激活能刺激成骨細(xì)胞增殖和分化，并抑制其凋亡；還可影響破骨細(xì)胞形成及分化[26]；而PI3K-Akt與 MAPK信號通路可協(xié)同調(diào)控成骨及破骨細(xì)胞，影響二者增殖、分化與凋亡[27]。上調(diào)HIF-1信號通路可通過血管-成骨偶聯(lián)促進(jìn)骨和血管形成，增加破骨細(xì)胞的活性及數(shù)量，影響骨形成與吸收[28-29]。Toll樣受體信號通路與MAPK及Akt通路協(xié)同作用，降低受體磷酸化水平及破骨細(xì)胞的骨吸收[30]；骨細(xì)胞上的Toll樣受體4參與由TLR通路介導(dǎo)的下游NF-KB表達(dá)活化破骨細(xì)胞[31]。雌激素參與成骨與破骨細(xì)胞生物過程，維持二者動(dòng)態(tài)平衡，并影響間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向增殖、分化[32]；還可通過免疫細(xì)胞分泌的成骨細(xì)胞與細(xì)胞因子間接抑制破骨細(xì)胞分化、增殖，降低其活性[33]，故該通路在調(diào)節(jié)骨代謝平衡方面作用重大。破骨細(xì)胞分化通路直接與OP相關(guān)，TNF、IL-1、雌激素等作用于該通路，影響破骨細(xì)胞生長和凋亡；且破骨細(xì)胞受體內(nèi)、外因素和復(fù)雜信號通路共同調(diào)節(jié)；一旦平衡被打破，可致OP、股骨頭壞死、骨硬化病等多種骨代謝疾病[34-35]。

不同疾病之間相互關(guān)聯(lián)與影響，具有微妙的調(diào)控機(jī)制：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可使關(guān)節(jié)面軟骨及軟骨下骨因炎癥因子及增生的滑膜組織而破壞，致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、骨吸收進(jìn)程加快[36-37]；非酒精性脂肪肝影響諸多代謝通路來調(diào)節(jié)骨密度[38]；2型糖尿病患者體內(nèi)異常活化的炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等打破骨形成與吸收之間的代謝平衡，誘發(fā)OP[39]；據(jù)此可推測，JSP能通過類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病相關(guān)通路防治OP。

4 總結(jié)與思考

本研究依據(jù)數(shù)據(jù)庫信息，發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸中的槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等核心活性成分通過TNF、MAPK、PI3K-Akt、HIF-1等信號通路干預(yù)AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN等關(guān)鍵靶標(biāo)表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞生成、抑制破骨細(xì)胞分化，維持骨代謝平衡，從而防治骨質(zhì)疏松癥。在理論層面為金匱腎氣丸活性成分篩選、防治骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標(biāo)及通路預(yù)測提供數(shù)據(jù)支撐，有助于揭示金匱腎氣丸防治骨質(zhì)疏松癥的科學(xué)內(nèi)涵。但并未將金匱腎氣丸與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)證型做對應(yīng)；臨床應(yīng)用上，金匱腎氣丸各中藥活性成分及其含量在炮制過程中可能會相互作用甚至發(fā)生變化。故擬開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)、藥理藥效代謝學(xué)等更深入的探索性研究，驗(yàn)證并對應(yīng)本研究結(jié)果，積極探索中醫(yī)藥與骨質(zhì)疏松癥防治的結(jié)合點(diǎn)。為更好地傳承與發(fā)揚(yáng)仲景學(xué)術(shù)思想及經(jīng)方研究奠定基礎(chǔ)，推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展進(jìn)程。