CCK-8與MTT法檢測(cè)左歸丸含藥血清干預(yù)BMSCs增殖條件的比較

劉飛祥 譚峰 樊巧玲 李星 葉素敏 張明玥 柴毅 麥聰英 吳丹

南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的一類(lèi)祖細(xì)胞，具有自我復(fù)制及向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等方向分化的能力[1-2]。左歸丸(Zuoguiwan，ZGW)出自《景岳全書(shū)》，由鹿角膠、山藥、川牛膝、山茱萸、龜板膠、熟地、菟絲子和枸杞子八味藥物組成，具有滋陰補(bǔ)腎、填精益髓的作用[3]。研究表明[4-6]，ZGW含藥血清能夠通過(guò)調(diào)節(jié)骨保護(hù)蛋白/核因子κB受體激活因子配體/核因子κB受體活化因子等多條信號(hào)通路，促進(jìn)BMSCs的增殖。在觀察ZGW含藥血清促進(jìn)BMSCs增殖作用的實(shí)驗(yàn)中，常需要用MTT法或CCK-8法對(duì)其進(jìn)行增殖能力檢測(cè)。然而相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的兩種方法，在檢測(cè)大鼠BMSCs增殖時(shí)的所采用的細(xì)胞接種密度差異較大，檢測(cè)波長(zhǎng)不一，孵育時(shí)間不同，給實(shí)驗(yàn)開(kāi)展造成了一定困難[7-9]。鑒于此，筆者就兩種方法在檢測(cè)ZGW含藥血清干預(yù)BMSCs增殖時(shí)所需要的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了比較，以期為相關(guān)人員提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：10只一周齡SPF級(jí)SD乳大鼠和20只8周齡SPF級(jí)SD大鼠均由南京市青龍山動(dòng)物繁殖中心提供，合格證號(hào)為SCXK(SU)2017-0001，8周齡SPF級(jí)SD大鼠在南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的同意(倫理號(hào)：201803A002)。

1.1.2儀器與試劑：MTT試劑盒(江蘇凱基)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué))，α-MEM(美國(guó)Gibco)，F(xiàn)BS胎牛血清(美國(guó)Gibco)，雙抗(美國(guó)Gibco)，二甲基亞楓(DMSO，美國(guó)Sigma)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó) PerkinElmer)。

1.2 方法

1.2.1ZGW凍干粉的制作：熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、川牛膝、菟絲子、龜甲膠和鹿角膠購(gòu)買(mǎi)于南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂。ZGW凍干粉的制作，即中藥(龜甲膠和鹿角膠除外)粉碎后分別煎煮2 h，然后過(guò)濾濃縮，洋化龜甲膠和鹿角膠，上Freeze Dryers凍干機(jī)-50 ℃干燥48 h，低溫干燥保存。

1.2.2含藥血清的制備：20只8周齡SPF級(jí)SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后分別給予ZGW(4.6 g/kg凍干粉)連續(xù)灌胃7 d。末次給藥2 h后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，以3 000 r/min，離心 15 min，然后血清過(guò)濾除菌、滅活，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?.5% ZGW含藥血清的配制：2.5 mL ZGW大鼠血清，86.5 mL α-MEM培養(yǎng)液，10 mL FBS，1 mL青鏈霉素。

1.2.3BMSCs的提?。喝榇笫箢i椎脫臼法處死，取脛骨和股骨，暴露骨髓腔，斷端朝下放入無(wú)菌 EP管中，12 000 r/min離心30 s；離心管中加入10% α-MEM培養(yǎng)液，200 μm濾網(wǎng)過(guò)濾；然后紅細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min；10% α-MEM培養(yǎng)液洗滌2次；然后接種于6孔板中，并在6 h、24 h后進(jìn)行換液，之后每2～3 d更換新鮮的培養(yǎng)液，此時(shí)標(biāo)記為P0。P0細(xì)胞在12 d后即融合至80%～90%，可進(jìn)行傳代。

1.2.4波長(zhǎng)檢測(cè)：按照1×104/孔的密度將P3細(xì)胞分別接種于2個(gè)96孔板中(MTT板，CCK-8板)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組4個(gè)復(fù)孔，4個(gè)不含細(xì)胞的空白對(duì)照孔，ZGW含藥血清培養(yǎng)48 h后，MTT板加100 μL/孔MTT液，37 ℃孵育4 h，CCK-8板加20 μL/孔CCK-8液，37 ℃孵育3 h。檢測(cè)前，MTT板吸去上液，加DMSO 150 μL/孔，37 ℃恒溫震蕩10 min，以充分溶解甲臢?？字屑尤氲腗TT液和CCK-8液的量是根據(jù)各說(shuō)明書(shū)中試劑與孔中培養(yǎng)液體積的比值進(jìn)行計(jì)算。兩組送酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以410、430、450、470、490、510、530、550、570、590 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)。

1.2.5靈敏度檢測(cè)：按照每孔8×104、4×104、2×104、1×104、0.5×104、0.25×104、0.1×104、0的濃度將P3細(xì)胞分別接種在MTT板、CCK-8板中(96孔板)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。ZGW含藥血清培養(yǎng)48 h后，MTT組加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，測(cè)定前吸去培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，37 ℃恒溫震蕩10 min；CCK-8組每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h后送酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，波長(zhǎng)分別為550 nm(MTT法)、450 nm(CCK-8法)。將每個(gè)細(xì)胞密度下所得的OD與其前一個(gè)密度條件下所得OD值相比，對(duì)所得的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而觀察在細(xì)胞密度翻倍的情況下，兩種方法的靈敏度情況。

1.2.6孵育時(shí)間：按照每孔1×104、0.5×104、0.25×104、0的細(xì)胞密度將P3細(xì)胞接種于6個(gè)96孔板中，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，ZGW含藥血清培養(yǎng)48 h后，分別加入MTT和CCK-8試劑，在孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、10 h時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，同一細(xì)胞濃度每次檢測(cè)4個(gè)復(fù)孔，波長(zhǎng)分別為550 nm(MTT試劑)、450 nm(CCK-8試劑)。

1.2.7生長(zhǎng)曲線(xiàn)：取指數(shù)生長(zhǎng)期的P3細(xì)胞，按照每孔0.05×104、0.1×104、0.25×104、0.5×104、1×104的細(xì)胞密度接種于8塊96孔板中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，在ZGW含藥血清干預(yù)1、2、3、5、7、9、11、13 d后，分別加入MTT和CCK-8試劑，孵育4 h和3 h后，以相應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 最佳波長(zhǎng)

在細(xì)胞密度同為1×104/孔時(shí)，MTT法檢測(cè)的OD值在550 nm達(dá)到峰值，并從550 nm處其OD值向兩側(cè)逐漸遞減；CCK-8法檢測(cè)的OD值在450 nm達(dá)到峰值，并從450 nm處其OD值向兩側(cè)逐漸遞減(圖1)。

2.2 靈敏度檢測(cè)

在特定波長(zhǎng)條件下，與CCK-8法相比較，在細(xì)胞密度為0.1×104/孔、2×104/孔、4×104/孔和8×104/孔時(shí)，MTT法對(duì)細(xì)胞在翻倍時(shí)OD值增加的響應(yīng)量無(wú)明顯變化，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與CCK-8法相比較，在細(xì)胞密度為0.25×104/孔、0.5×104/孔和1×104/孔時(shí)，MTT法對(duì)細(xì)胞在翻倍時(shí)OD值增加的響應(yīng)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2，表1)。

圖2 不同細(xì)胞密度下兩種試劑所檢測(cè)的OD值Fig.2 OD values of CCK-8 and MTT assay under different cell density

表1 不同細(xì)胞密度下兩種試劑的靈敏度Table 1 Sensitivity of CCK-8 and MTT assay under different cell density

2.3 孵育時(shí)間

在細(xì)胞密度為0.25×104/孔、0.5×104/孔和1×104/孔時(shí)，CCK-8法與MTT法檢測(cè)的OD值均與孵育時(shí)間呈正比。在細(xì)胞濃度為1×104/孔時(shí)，CCK-8法所測(cè)的OD值即將超過(guò)標(biāo)曲，而在孵育時(shí)間超過(guò)10 h后，不同細(xì)胞密度下所得的OD值也超過(guò)標(biāo)曲(圖3A)，這說(shuō)明CCK-8法試劑孵育時(shí)，細(xì)胞密度應(yīng)不超過(guò)1×104/孔，同時(shí)孵育時(shí)間應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)。而MTT法在檢測(cè)10 h后，檢測(cè)的OD值趨勢(shì)持續(xù)上升(圖3B)。

圖3 CCK-8法(A)與MTT法(B)的孵育時(shí)間Fig.3 Incubation time of CCK-8 (A) and MTT (B) assay

2.4 增殖曲線(xiàn)

采用CCK-8法檢測(cè)，在增殖的前7 d，BMSCs密度為0.05×104/孔和1×104/孔條件時(shí)，ZGW含藥血清干預(yù)后細(xì)胞的增長(zhǎng)趨勢(shì)較慢，OD值幅度變化較??；而細(xì)胞密度為0.25×104/孔和0.5×104/孔條件時(shí)，ZGW含藥血清干預(yù)后細(xì)胞的增長(zhǎng)趨勢(shì)較快，OD值幅度變化較大，在第7天OD值達(dá)酶標(biāo)儀上線(xiàn)，提前進(jìn)入平臺(tái)期；而細(xì)胞密度為0.1×104/孔時(shí)，經(jīng)含藥血清干預(yù)后的BMSCs在前5 d緩慢增殖，從第7天開(kāi)始呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，第11天時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈S形(圖4A)。

圖4 CCK-8法(A)和MTT法(B)檢測(cè)BMSCs的增殖實(shí)驗(yàn)Fig.4 Proliferation of BMSCs detected by using CCK-8 (A) and MTT (B) assay

采用MTT法檢測(cè)，BMSCs密度為0.05×104/孔條件時(shí)，經(jīng)ZGW含藥血清干預(yù)后的BMSCs在整個(gè)觀察期內(nèi)增殖速度非常緩慢，至觀察末期未進(jìn)入增長(zhǎng)平臺(tái)期；在細(xì)胞密度為0.1×104/孔條件下，雖然在第5天開(kāi)始，細(xì)胞成快速增長(zhǎng)，但細(xì)胞生長(zhǎng)第13天后尚未進(jìn)入平臺(tái)；BMSCs密度為0.5×104/孔和1×104/孔條件時(shí)，BMSCs增殖速度快，增長(zhǎng)幅度較大，在第7天進(jìn)入平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈S形；BMSCs密度為0.25×104/孔時(shí)，細(xì)胞傳代后第1～3天，吸光度變化不大，在第4～11天增勢(shì)明顯，在第11～13天進(jìn)入平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈S形(圖4B)。

3 討論

BMSCs主要存在于骨髓中，決定骨的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝。課題組前期關(guān)注左歸丸對(duì)BMSCs的增殖和分化研究[10-11]，然而在對(duì)BMSCs增殖實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道中CCK-8與MTT對(duì)細(xì)胞接種的密度、孵育時(shí)間、靈敏度存在一定爭(zhēng)議，不利于實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。因此開(kāi)展本次研究，以期為相關(guān)人員提供一定的參考。

CCK-8試劑生成的甲臢物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比[12]。該試劑無(wú)細(xì)胞毒性，隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞中的酶不斷產(chǎn)出甲臢物，OD值也會(huì)不斷增大，直至達(dá)到酶標(biāo)儀檢測(cè)的上限。若檢測(cè)間隔時(shí)間較長(zhǎng)，則所得OD值前后誤差較大，影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。MTT法的晶體生成量與活細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活化狀態(tài)呈線(xiàn)性關(guān)系[13]。MTT法在孵育結(jié)束后，需要加入DMSO溶解沉積在細(xì)胞中的甲臢晶體。由于MTT試劑有細(xì)胞毒性，因此新生結(jié)晶較少，且溶解甲臢的速度較慢，所以其OD值在一定時(shí)間內(nèi)幅度增加有限，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。

在特定波長(zhǎng)下測(cè)定的甲臢物和甲臢晶體有其特定的波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)條件下，甲臢物和甲臢晶體能吸收做多的光能量[14]。本研究中CCK-8法與MTT法在檢測(cè)左歸丸含藥血清干預(yù)BMSCs增殖時(shí)，其OD值趨勢(shì)分別是從450 nm和550 nm處向兩側(cè)遞減。因而，可以確定550 nm和450 nm分別是MTT法與CCK-8法在檢測(cè)BMSCs增殖時(shí)的最佳測(cè)量波長(zhǎng)。

靈敏度是反映一種方法對(duì)單位濃度或單位量待測(cè)物質(zhì)變化所致的響應(yīng)量變化程度[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞密度過(guò)低(≤0.1×104/孔)或細(xì)胞密度過(guò)高(>1×104/孔)時(shí)，CCK-8法和MTT法對(duì)細(xì)胞在翻倍時(shí)OD值的變化均不敏感，響應(yīng)量變化較小。當(dāng)細(xì)胞密度范圍在0.1×104/孔至1×104/孔時(shí)，MTT法對(duì)細(xì)胞密度在翻倍時(shí)的響應(yīng)量較大，靈敏度較高，而CCK-8法對(duì)細(xì)胞密度在翻倍時(shí)的響應(yīng)量較小，靈敏度相對(duì)較差，二者具有明顯差異。因此以往通過(guò)OD值的大小來(lái)判斷CCK-8 法比 MTT 法對(duì)細(xì)胞濃度變化更加靈敏的說(shuō)法有待商榷[16]。

BMSCs細(xì)胞體積較大，由于96孔板孔面積有限，且增殖實(shí)驗(yàn)時(shí)間干預(yù)跨度較長(zhǎng)，而細(xì)胞鋪滿(mǎn)96孔板需要7 d以上，細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)造成細(xì)胞提前進(jìn)入平臺(tái)期而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，密度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間延長(zhǎng)，所以細(xì)胞的接種密度對(duì)于正確反映細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)尤為關(guān)鍵[17]。本研究認(rèn)為，當(dāng)BMSCs接種密度分別高于0.25×104/孔和0.5×104/孔時(shí)，所測(cè)OD值因超酶標(biāo)儀上限，兩種試劑均提前出現(xiàn)假S型曲線(xiàn)。當(dāng)BMSCs接種密度0.1×104/孔時(shí)，由于細(xì)胞前期生長(zhǎng)緩慢，后期持續(xù)生長(zhǎng)，進(jìn)入平臺(tái)期延遲，也不能正確反映出細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，使用CCK-8和MTT試劑時(shí)，只有當(dāng)細(xì)胞接種密度分別控制在0.1×104/孔至0.25×104/孔之間和0.25×104/孔左右時(shí)，才能較好地反映出左歸丸含藥血清干預(yù)BMSCs的增殖趨勢(shì)。

綜上所述，在研究左歸丸含藥血清干預(yù)BMSCs增殖實(shí)驗(yàn)中，使用CCK-8試劑時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，孵育時(shí)間為3 h，細(xì)胞接種密度為0.1×104/孔；使用MTT試劑檢測(cè)時(shí)，波長(zhǎng)為550 nm，孵育時(shí)間為4 h，細(xì)胞接種密度以0.25×104/孔為最佳。MTT法對(duì)細(xì)胞密度在0.1×104/孔至1×104/孔時(shí)翻倍的響應(yīng)量較大，靈敏度較高，優(yōu)于CCK-8法。