48例D變異型基因背景研究*

丁夢(mèng)圓 周秀 湯龍海 張輝 李艷 王明元

D變異型通常指D抗原數(shù)量表達(dá)下調(diào)或部分D表位缺失，包括弱D、部分D和Del表型[1]。D變異型的準(zhǔn)確鑒定對(duì)預(yù)測(cè)胎母免疫、減少溶血性輸血反應(yīng)具有重要意義。目前，D變異型的基因檢測(cè)已成為血清學(xué)有效的補(bǔ)充手段，但國(guó)內(nèi)人群的D變異型分子背景研究尚不完善。本研究通過(guò)對(duì)蘇州、徐州兩地的D變異型標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)，進(jìn)一步明確了該人群的RHD遺傳背景。

材料與方法

1 研究對(duì)象 收集2020年7月～2021年7月蘇州市中心血站和徐州市中心血站血型初篩RHD陰性或弱陽(yáng)性獻(xiàn)血者及兩地醫(yī)院送檢的RHD陰性或弱陽(yáng)性患者標(biāo)本，經(jīng)血清學(xué)鑒定為D變異型者共48例，均征得知情同意。

2 D變異型確認(rèn) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室收到的初篩陰性或弱陽(yáng)性的標(biāo)本使用另外三種抗-D試劑（兩家實(shí)驗(yàn)室均使用：D1：TH-28/MS-26，英國(guó)Millipore；D2：MS-26，北京金豪；D3：D175-2/D415 1E4，加拿大Dominion）進(jìn)行抗球蛋白試驗(yàn)（蘇州市中心血站使用低離子抗人球蛋白卡，瑞士Biorad；徐州市中心血站使用抗人球蛋白檢測(cè)試劑盒試管法，上海血液生物），有一種或多種抗-D試劑反應(yīng)陽(yáng)性者補(bǔ)做直接抗球蛋白試驗(yàn)，直抗陰性者判定為D變異型。同時(shí)對(duì)RhCE抗原進(jìn)行試管法鑒定[抗-C（MS-24），抗-c（MS-33），抗-E（MS-80，MS-258）和抗-e（MS-16，MS-21，MS-63），均來(lái)自上海血液生物]，對(duì)獻(xiàn)血者血漿進(jìn)行間接抗人球蛋白試管法抗體篩查（抗體篩選細(xì)胞，上海血液生物）。

3RHD基因檢測(cè) 提取D變異型標(biāo)本的基因組DNA，采用PCR-SSP方法（人類紅細(xì)胞RHD血型變異體基因分型試劑盒，天津秀鵬）對(duì)標(biāo)本RHD等位基因組成進(jìn)行初步鑒定。相關(guān)試劑和操作參照本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)[2]。對(duì)于有疑問(wèn)或無(wú)法鑒定的結(jié)果，委托秀鵬生物公司對(duì)RHD外顯子1-10進(jìn)行基因測(cè)序。

4 抗不同表位的抗-D單克隆抗體試劑測(cè)定 對(duì)含有新突變位點(diǎn)的標(biāo)本按上述血清學(xué)方法進(jìn)行抗不同表位的抗-D單克隆抗體試劑（DIAGAST）測(cè)定。

結(jié) 果

1 D變異型標(biāo)本血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果及RhCE抗原分型48例D變異型標(biāo)本與不同抗-D試劑的反應(yīng)強(qiáng)度見(jiàn)表1。17例RHD*15在間接抗人球蛋白試驗(yàn)中的強(qiáng)度可從0波動(dòng)到3+；同樣，9例RHD*06.03.01在確認(rèn)試驗(yàn)中可在陰性到4+之間分布。獻(xiàn)血者血漿中1例RHD*06.03.01標(biāo)本檢出抗-D抗體，其余均為抗篩陰性。

RHD等位基因組成與RhCE抗原的對(duì)應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2。RHD*15的常見(jiàn)分型為ccEe，占該等位基因組成的70.59%；RHD*06.03.01的常見(jiàn)分型為Ccee，占該等位基因組成的77.78%。

表2 RhCE抗原在不同RHD等位基因中的分布情況

2 D變異型標(biāo)本基因檢測(cè)結(jié)果 基因分型結(jié)果（見(jiàn)表1）中，PCR-SSP方法直接確定RHD等位基因組成的有35例，包括RHD*15、RHD*06.03.01、RHD*15/RHD*01EL.01（推測(cè)的基因型）和RHD*01EL.01，其中RHD*15和RHD*06.03.01例數(shù)最多，分別有17例（34.69%）和9例（18.37%）。其余13例經(jīng)RHD測(cè)序后確定等位基因組成，其中5例為弱D（RHD*01W.72、RHD*01W.54、RHD*01W.10和RHD*11/RHD*01EL.01（推測(cè)的基因型）），4例為部分D（RHD*05.01、RHD*05.04、RHD*05.05和RHD*16.02），1例為RHD*01。另有3例單核苷酸突變的弱D標(biāo)本，分別為2例RHD*779G和1例509T＞G（GenBank：MZ423199），其中509T＞G為新發(fā)現(xiàn)突變（見(jiàn)圖1）。

圖1 RHD外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)509T＞G突變

表1 D變異型標(biāo)本與不同抗-D試劑的反應(yīng)強(qiáng)度

3 抗不同表位的抗-D單克隆抗體試劑測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果509T＞G突變的標(biāo)本經(jīng)多種單抗檢測(cè)與部分D表型接近，見(jiàn)表3。

表3 抗不同表位的抗-D單克隆抗體試劑測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

目前國(guó)內(nèi)D變異型的檢出主要依賴于RhD確認(rèn)試驗(yàn)[3]，但隨之出現(xiàn)的多次確認(rèn)結(jié)果不一致以及確認(rèn)結(jié)果為極弱陽(yáng)性等問(wèn)題，僅依靠2～3種抗-D試劑的間接抗人球蛋白試驗(yàn)無(wú)法得到確切結(jié)果，此時(shí)RHD基因檢測(cè)不失為有效的補(bǔ)充方法。由于RHD基因的分布存在種族和地區(qū)的差異[4]，故有必要對(duì)本地區(qū)的D變異型遺傳背景進(jìn)行調(diào)查，以便有針對(duì)性地檢測(cè)和指導(dǎo)輸血。

現(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示弱D15型、部分DⅥ.3型和DEL（K409K）為中國(guó)漢族人群常見(jiàn)的D變異型，占90%以上[3]。本研究結(jié)果也表明RHD*15和RHD*06.03.01最多，分別占34.69%和18.37%，與廣州[5]、石家莊[1]和東北[6]等地獻(xiàn)血者的調(diào)查結(jié)果基本一致。由于DEL被定義為僅能通過(guò)吸收放散試驗(yàn)檢出，在RhD陰性確認(rèn)中為陰性結(jié)果，故未被納入本次研究，DEL（K409K）即RHD*01EL.01的陽(yáng)性率較以往報(bào)道低[7]。但仍有3例RHD*01EL.01純合型和2例RHD*01EL.01雜合型被檢出，且3例RHD*01EL.01純合型標(biāo)本的血清學(xué)結(jié)果均為僅北京金豪抗-D出現(xiàn)“±”，ZHANG[6]等曾在45例血清學(xué)弱D標(biāo)本中檢出3例RHD*01EL.01；HE[8]等報(bào)道32例D變異型標(biāo)本中等位基因組成為RHD*01EL.01的有8例，通過(guò)測(cè)序和多重連接依賴性探針擴(kuò)增（MLPA）推出其中6例為RHD1227A/RHD雜合型，并認(rèn)為RHD1227G＞A可使正常D基因表達(dá)減弱，而攜帶有RHD1227G＞A的D基因不一定呈現(xiàn)為典型的DEL，因此同一基因在不同狀態(tài)下可能會(huì)表達(dá)不止一種表型。同樣，本研究在D變異型標(biāo)本中檢出1例RHD陽(yáng)性標(biāo)本，經(jīng)RHD測(cè)序確認(rèn)為RHD*01，推測(cè)其在基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)生了改變。梁延連[9]等曾報(bào)道1例RHD陽(yáng)性患者在多次輸血后產(chǎn)生抗-D抗體，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其RHDmRNA剪接體存在缺失和突變，這些突變有可能引起了RHD抗原表位的缺失。

易品[10]等曾統(tǒng)計(jì)了國(guó)內(nèi)關(guān)于RhCE表型的研究，指出RHD陽(yáng)性和RHD陰性個(gè)體分別以CCee和ccee表型最多，占比均超過(guò)50%，但并未提及D變異型的RhCE表型分布特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)RHD*15的常見(jiàn)分型為ccEe，RHD*06.03.01的常見(jiàn)分型為Ccee，占比均超過(guò)70%。YE[11]等對(duì)DⅥ型的RhCE分型中，以Ccee居多（23/36）；SANDLER[12]等指出RHD*DEL1與C抗原同時(shí)出現(xiàn)的概率在91.5%～100%，而E抗原為0%～38.4%。ARNONI[13]等通過(guò)分析不同RhCE表型的紅細(xì)胞D抗原密度發(fā)現(xiàn)，C抗原反向抑制D抗原的現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在正常D陽(yáng)性，還出現(xiàn)在D變異型紅細(xì)胞中，且對(duì)不同D變異型的抑制程度不一致（Partial D DAR1.2 42% vs.Partial D DAR3.1 16%）。M GANN[14]等指出CCee抗原可使D抗原表達(dá)減弱，而ccEE抗原可使D抗原表達(dá)增強(qiáng)。推測(cè)其原因?yàn)镽HCE的表達(dá)直接抑制RHD的轉(zhuǎn)錄，或影響RHDmRNA的翻譯和翻譯后修飾，還可能通過(guò)空間位阻使D抗原的表達(dá)降低。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了3例單核苷酸突變的弱D標(biāo)本，其中RHD*779G為已報(bào)道突變（GenBank：AHY24798.1），為弱D149型。該突變導(dǎo)致D蛋白第260位組氨酸被替換為精氨酸，由于位于第8次跨膜區(qū)，可能影響了D蛋白整合至細(xì)胞膜[15]。509T＞G為新發(fā)現(xiàn)突變，已提交GenBank（MZ423199）。該突變導(dǎo)致第170位蛋氨酸被替換為精氨酸，多種單克隆抗體結(jié)果顯示，該新突變標(biāo)本與部分D表型接近。第170位氨基酸位于RhD前庭，即跨膜蛋白通道的細(xì)胞外入口，在DOL-1、DOL-2中突變?yōu)樘K氨酸，DMI中突變?yōu)楫惲涟彼?，DFR中突變?yōu)榫彼幔鲜鐾蛔兙鶠椴糠諨，且大部分可被免疫產(chǎn)生抗-D[16]。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)本地區(qū)D變異型標(biāo)本進(jìn)行基因分型和RhCE抗原分型調(diào)查，初步了解了其分布規(guī)律。由于D變異型在檢測(cè)和規(guī)避免疫刺激方面較RhD陰性或陽(yáng)性更為復(fù)雜，不同的D變異型在孕婦、受血者和獻(xiàn)血者中需要區(qū)別對(duì)待，因此有必要積累更多資料以便進(jìn)行孕期監(jiān)測(cè)和輸血管理。

致謝：衷心感謝浙江省血液中心輸血研究所陳舒老師的指導(dǎo)與幫助！

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突