八桂止痛膏對小鼠鎮(zhèn)痛 抗炎作用效果實驗研究

趙麗娟， 張艷菊， 張誠昊， 廖承成

劉復(fù)興教授是云南省中醫(yī)醫(yī)院的國家級名老中醫(yī)，長期從事中醫(yī)皮膚病臨床工作。八桂止痛膏(原名消炎止痛散；Bagui Analgesic Ointment，BAO)是劉復(fù)興教授治療帶狀皰疹及帶狀皰疹后神經(jīng)痛的自擬方，對帶狀皰疹及帶狀皰疹后神經(jīng)痛有良好的療效[1-2]。該方具有活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效，在臨床應(yīng)用中對多種疼痛性疾病有較好的療效，止痛迅速，療效顯著，不良反應(yīng)較少，安全性較高，已在我院皮膚科應(yīng)用多年[3]。本研究旨在從動物實驗角度探討該藥方鎮(zhèn)痛及抗炎效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 昆明種雌性小鼠共120只，體重18～22 g，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：SCXK(京)2014-0004]。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF級要求。

1.2試劑與儀器 桂皮醛標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110710-201821)；甲醇(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；石油醚(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；75%乙醇(昆明遠(yuǎn)方制品生物有限公司)；生理鹽水(昆明南疆制藥有限公司)。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑[扶他林，規(guī)格：20 g∶0.2 g(以雙氯芬酸鈉計)，批號：國藥準(zhǔn)字H19990291，北京諾華制藥有限公司]；冰醋酸(天津博迪化工股份有限公司)；PL6001-L天平[海特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；YLS-6B智能熱板儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)。

1.3實驗藥物 八桂止痛膏。(1)藥物組成：桂枝、透骨草、三棱、莪術(shù)、八角楓、昆明山海棠、大黃等量。(2)制作方法：①粉碎：按處方稱取桂枝、莪術(shù)、大黃3味藥材，分揀過篩，除去泥沙等雜質(zhì)，粉碎成粗粉，備用。②提?。喊刺幏椒Q取三棱、八角楓、透骨草、昆明山海棠4味中藥，煎煮2次：第1次加10倍量的水，煎煮1 h；第2次加8倍量的水，煎煮40 min，過濾。合并2次濾液，減壓濃縮至1.20 g/ml(80 ℃)，備用。③干燥：將提取的浸膏與上述粗粉攪拌均勻，55 ℃充分干燥，粉碎成細(xì)粉(過100目篩)，備用。④膏劑制備：將適量羊毛脂和凡士林混合，加熱至熔融狀態(tài)，攪拌均勻，趁熱過濾，除去雜質(zhì)，加熱至80 ℃，加入上述中藥細(xì)粉并不斷攪拌，加入適量液體石蠟調(diào)節(jié)軟膏劑的稀稠度，趁熱分裝，放冷即得，制成1 000 g。

1.4給藥劑量[4]在實驗前24 h用電動推剪進(jìn)行小鼠腹部脫毛，脫毛范圍約3 cm2。小鼠與人劑量的換算如下：(1.44×10 000 cm2×0.05 ml/cm2×0.003)÷67 cm2=0.03 ml/cm2。計算公式中，1.44×10 000 cm2為人(50 kg)的體表面積，0.05 ml/cm2為人體常用劑量[5]，0.003為小鼠與人按照體表面積折算的等效劑量換算系數(shù)，67 cm2為小鼠體表面積。故本實驗小鼠用藥劑量為0.03 g/cm2×3 cm2=0.09 g/次。

1.5實驗方法與觀察指標(biāo)

1.5.1 熱板實驗[6]在室溫22 ℃下，調(diào)節(jié)熱板溫度至(55±0.5)℃，將小鼠放在熱板上，以開始出現(xiàn)舔后足行為所需時間(s)作為反應(yīng)時間，將2次反應(yīng)時間均值作為給藥前基礎(chǔ)痛閾值。其中凡舔后足時間<5 s或>30 s者棄之不用。選擇合格小鼠24只，隨機分為空白對照組(不予藥物干預(yù))，扶他林組(予以雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，0.09 g/只)，BAO組(予以BAO，0.09 g/只)，每組8只。按照上述分組，將相應(yīng)劑量的藥膏均勻涂擦于小鼠腹部，2次/d，連續(xù)給藥3 d。在末次給藥后15 min、30 min、45 min放置于熱板上，記錄其反應(yīng)時間作為給藥后痛閾值。給藥后，若反應(yīng)有>60 s者，以60 s計算。

1.5.2 醋酸扭體實驗[7-8]取小鼠24只隨機分為空白對照組(不予藥物干預(yù))，扶他林組(予以雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，0.09 g/只)，BAO組(予以BAO，0.09 g/只)，每組8只。按照上述分組的相應(yīng)劑量將藥膏均勻涂擦于小鼠腹部，2次/d，連續(xù)給藥3 d。在末次給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.1 ml/10 g，記錄15 min內(nèi)小鼠因疼痛產(chǎn)生的扭體次數(shù)，以腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸展、臀部抬高等為扭體反應(yīng)。扭體次數(shù)抑制率(%)=(空白對照組扭體均數(shù)-給藥干預(yù)組扭體均數(shù))/空白對照組扭體均數(shù)×100%。

1.5.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗[4，9]取小鼠24只，隨機將其分為空白對照組(不予藥物處理)，扶他林組(予以雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，給藥劑量：0.18 g)，BAO組(予以BAO，給藥劑量為：0.03 ml/cm2×2×3 cm2=0.18 ml)，每組8只。在首次給藥前，用剃毛器給小鼠腹部脫毛，脫毛面積大約為3 cm2。用分析天平、單道移液器分別稱取各分組藥量，將藥物均勻涂抹于小鼠腹部脫毛處皮膚上，用塑料薄膜覆蓋，后用膠布固定紗布，每次藥物接觸至少4 h/次，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d。在末次給藥30 min后，用50 μl 100%二甲苯溶液涂擦小鼠左耳廓(兩面都要涂擦)。4 h后將小鼠斷頸處死，沿耳廓邊限剪下左右耳，用6 mm直徑打孔器分別在左右耳同一位置打下圓耳片，稱重。兩耳片質(zhì)量差=(左耳重量-右耳重量)，記為耳廓腫脹質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1三組不同時間點痛閾值比較 在給藥后15～45 min，扶他林組小鼠痛閾值呈逐漸上升趨勢，而BAO組小鼠痛閾值呈先上升后下降趨勢。在給藥后45 min時間點，BAO組小鼠痛閾值低于扶他林組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組給藥后各時間點的痛閾值均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組不同時間點痛閾值比較

2.2三組扭體次數(shù)及扭體次數(shù)抑制率比較 扶他林組和BAO組扭體次數(shù)低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。扶他林組和BAO組扭體次數(shù)和扭體次數(shù)抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組扭體次數(shù)及扭體次數(shù)抑制率比較

2.3三組小鼠耳廓腫脹質(zhì)量比較 扶他林組耳廓腫脹質(zhì)量小于BAO組和空白對照組，且BAO組耳廓腫脹質(zhì)量亦小于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組小鼠耳廓腫脹質(zhì)量比較

3 討論

3.1BAO具有活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效，常用于治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛，對多種疼痛性疾病，如關(guān)節(jié)型銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也具有較好的臨床療效。BAO由桂枝、透骨草、三棱、莪術(shù)、八角楓、昆明山海棠、大黃等組成。桂枝為本方君藥，辛、甘、溫，歸心、肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解表、溫通經(jīng)絡(luò)、助陽化氣等功效，《長沙藥解》有言“入肝膽而散遏抑，極止痛楚，通經(jīng)絡(luò)而開閉塞，甚去寒濕”，可治療寒凝血滯諸痛證、風(fēng)濕痹證。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桂枝揮發(fā)油具有顯著的抗炎作用，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[10]。透骨草性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，具祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、活血止痛、解毒化疹之功效，加強桂枝溫通經(jīng)絡(luò)的作用。秦洪瓊等[11]研究也證實，透骨草具有抗炎、鎮(zhèn)痛的效果。大黃其性寒，味苦，歸脾、胃、大腸、肝、心經(jīng)，具瀉下攻積、清熱瀉火、止血、解毒、活血祛瘀之功效，與透骨草同為臣藥。研究表明大黃具有抗病毒、抗炎等藥理作用[12]。三棱性平，味苦、辛；莪術(shù)性溫，味辛、苦，同歸肝、脾經(jīng)，具破血行氣、消積止痛之功效。前人王好古有言：“三棱，破血中之氣，肝經(jīng)血分藥也。三棱、莪術(shù)治積塊瘡硬者，乃堅者削也”。莪術(shù)主要含有姜黃素、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮等有效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗血栓形成、消除自由基等作用[13]。八角楓，其性溫，味辛、苦，歸心、肝經(jīng)，具祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、散瘀止痛之功效。八角楓須根煎劑腹腔注射可使小鼠的痛閾升高，用藥部位以須根部位效用最強。萬照宇等[14]驗證了復(fù)方七葉蓮液(含有八角楓須根)對小鼠局部炎癥的影響，結(jié)果顯示，復(fù)方七葉蓮液可以抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，降低組胺所致的小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性增加。也有研究表明，八角楓具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗風(fēng)濕及肌肉松弛作用[15]。昆明山海棠性微溫，味辛、苦，大毒，歸肝、脾、腎經(jīng)，具祛風(fēng)除濕、活血止血、舒筋接骨、解毒殺蟲之功效，且具有抗炎免疫和免疫抑制作用[16]。八角楓祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛；昆明山海棠祛風(fēng)除濕、消腫止痛，二者共為使藥，引藥直達(dá)病所。全方具有破氣行血、通絡(luò)止痛的作用。BAO組方體現(xiàn)了血溫則行，氣行則血行，通則不痛之法則。從現(xiàn)代藥理研究看，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

3.2帶狀皰疹病毒性神經(jīng)痛主要是由于病毒感染導(dǎo)致神經(jīng)局部發(fā)生炎癥、變性壞死從而引起疼痛，炎癥、疼痛是治療的重點，本實驗主要通過疼痛和炎癥緩解程度來判定BAO的臨床療效。本研究熱板實驗結(jié)果顯示，扶他林和BAO均能提高小鼠痛閾值，且在干預(yù)30 min內(nèi)扶他林和BAO的止痛效果相當(dāng)。醋酸扭體法也是觀察動物疼痛的實驗方式之一，小鼠腹腔被注射醋酸后，臟器受到刺激，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生疼痛，小鼠則會表現(xiàn)出扭體的行為，其靈敏度高，廣泛用于動物疼痛實驗[17]。本研究結(jié)果顯示，扶他林和BAO均能抑制小鼠的扭體反應(yīng)，提示兩者鎮(zhèn)痛效果相近。二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗可用于觀察藥物的抗炎效果，本研究結(jié)果顯示，扶他林和BAO均能有效抑制炎癥，但BAO抗炎效果稍弱于扶他林。

綜上所述，BAO具有活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效，具有良好的抗炎、止痛效果。但本研究尚未對BAO的副作用與扶他林軟膏進(jìn)行對比，將在以后的研究中進(jìn)一步完善。