稻麥輪作體系下抗除草劑稻麥種質(zhì)資源的挖掘與利用

朱鵬， 許軻， 凌溪鐵， 王金彥， 楊郁文， 張保龍， 裘實(shí)*

（1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江流域稻作技術(shù)創(chuàng)新中心，糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，南京 210014）

水稻和小麥?zhǔn)侨蜃钪匾膬煞N糧食作物，在實(shí)現(xiàn)世界糧食安全方面發(fā)揮著重要作用。中國(guó)是全球稻麥種植和生產(chǎn)的大國(guó)之一，隨著我國(guó)人民生活的改善，優(yōu)質(zhì)商品水稻和小麥的需求量呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)，但可用于稻麥種植的勞動(dòng)力卻在逐年流失，成為我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的一大隱患。在我國(guó)稻麥輪作區(qū)，水稻傳統(tǒng)的種植方式有人工插秧、機(jī)械化移栽和直播3種，通過(guò)移栽來(lái)種植水稻繁瑣、耗時(shí)且成本很高，與移栽相比，直播的優(yōu)點(diǎn)包括更快的生長(zhǎng)速度、可避免移栽對(duì)植株的傷害、易于種植、更少的勞動(dòng)力投入和水分需求以及品種早熟。城市化發(fā)展帶來(lái)的農(nóng)村勞動(dòng)力流失使直播這一種植方式受到越來(lái)越多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的青睞；此外，由于過(guò)去幾十年來(lái)直播技術(shù)的發(fā)展（如機(jī)械化播種機(jī)、機(jī)械除草機(jī)、改良除草劑），稻麥直播變得比移栽更受新型農(nóng)業(yè)經(jīng)營(yíng)主體的青睞[1]。

當(dāng)前，田間的草害問(wèn)題越發(fā)嚴(yán)重，尤其在直播連作田雜草更是高發(fā)、頻發(fā)。鴨舌草、稗草、千金子等是水稻田中的主要雜草種類，看麥娘、日本看麥娘、豬殃殃等是小麥田中常見(jiàn)的雜草種類[2]。田間的雜草與水稻植株?duì)帄Z生長(zhǎng)空間、水分、陽(yáng)光和營(yíng)養(yǎng)，增加病蟲(chóng)害的發(fā)生，釋放有毒物質(zhì)，抑制水稻的生長(zhǎng)，對(duì)水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量都構(gòu)成了極大的威脅。試驗(yàn)證明沒(méi)有進(jìn)行雜草管理的稻田一般減產(chǎn)5%～15%[3]，草害嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)15%～30%[4]。加之近幾年水稻機(jī)械直播技術(shù)快速發(fā)展，秸稈還田工作加速推進(jìn)，一定程度上加劇了草害對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響。雜草侵害是直播稻主要的生物學(xué)限制，對(duì)直播稻生產(chǎn)力的限制可達(dá)75%～80%[5]，直播稻易受雜草侵害歸因于頑固的雜草植株群、干燥的種植條件、頻繁的耕作、交替的干濕期以及苗齡在30～35 d的水稻幼苗競(jìng)爭(zhēng)力弱于同期的雜草植株群[6]。田間雜草管理的方法主要分為物理除草和化學(xué)除草，在發(fā)展中國(guó)家，手工或使用機(jī)械進(jìn)行除草更為普遍，而在發(fā)達(dá)地區(qū)和技術(shù)先進(jìn)的地區(qū)，化學(xué)除草（噴施除草劑）占主導(dǎo)地位[7-8]。我國(guó)城市化的快速發(fā)展伴隨著鄉(xiāng)村勞動(dòng)力的大量流失，導(dǎo)致田間勞動(dòng)生產(chǎn)率下降、勞動(dòng)成本上升，傳統(tǒng)的人工除草方式已經(jīng)無(wú)法適應(yīng)我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展?fàn)顩r，化學(xué)除草是目前最經(jīng)濟(jì)有效的方法。合成除草劑的使用改變了傳統(tǒng)的雜草管理，對(duì)全球作物的產(chǎn)量與質(zhì)量作出了巨大的貢獻(xiàn)，并產(chǎn)生了持續(xù)的創(chuàng)新。

然而抗性雜草的種類在逐年遞增，這對(duì)田間雜草管理是非常嚴(yán)峻的考驗(yàn)。隨著除草劑相關(guān)品種的研發(fā)進(jìn)入瓶頸期，抗除草劑作物種質(zhì)資源的發(fā)展與創(chuàng)制成為炙手可熱的研究對(duì)象。將傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)選擇性除草劑通過(guò)合理復(fù)配，與對(duì)應(yīng)抗除草劑稻麥種質(zhì)資源配合使用，將高效地治理稻麥輪作區(qū)的頑固草害問(wèn)題，特別對(duì)長(zhǎng)期存在的惡性雜草和紅稻具有不可替代的作用?？钩輨┳魑锶绱耸軞g迎，歸因于其可以搭配廣譜的滅活型除草劑使用，使田間雜草管理更加低成本、簡(jiǎn)潔、靈活[9]。此外，抗除草劑作物還可以與免耕系統(tǒng)相結(jié)合，再次降低了田間作物的損傷風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)抗除草劑作物的研究開(kāi)展了廣泛的工作，取得了一定的成果。本文對(duì)幾類主要除草劑以及其相應(yīng)的抗除草劑稻麥種質(zhì)資源的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為稻麥種藥一體化栽培在直播稻中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 除草劑使用現(xiàn)狀

化學(xué)除草劑的使用已成為稻麥輪作區(qū)防除雜草最主要的手段，2010年就全球銷(xiāo)售額而言，水稻田除草劑占水稻田農(nóng)藥的43.2%，為16.47億美元[10]。在我國(guó)，水稻田中化學(xué)除草劑的用量約占農(nóng)藥產(chǎn)品總用量的15%，這一比例在發(fā)達(dá)國(guó)家中所占份額更高，而且我國(guó)對(duì)化學(xué)除草劑的需求量仍在逐年遞增[11]。根據(jù)功能分類，除草劑可以分為滅生型和選擇型兩大類，滅生型除草劑指對(duì)田間所有綠色植物都具有生物活性的除草劑，在一定用量下對(duì)田間的作物和雜草都會(huì)造成傷害，如草甘膦、草銨膦等；選擇型除草劑指具有較強(qiáng)針對(duì)性的除草劑，在一定用量下僅對(duì)田間某種或某類雜草造成傷害而不會(huì)傷害作物，如麥草畏、吡氟禾草靈等。隨著全球除草劑的廣泛使用，一系列與除草劑相關(guān)的問(wèn)題也接踵而至，如環(huán)境污染、抗性雜草等問(wèn)題對(duì)全球生態(tài)環(huán)境的建設(shè)產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響?？剐噪s草是全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的絆腳石，農(nóng)戶在田間盲目地使用單一除草劑導(dǎo)致田間雜草產(chǎn)生了耐藥性，目前已有報(bào)道多種惡性雜草對(duì)不同種類的除草劑具有抗性，如黑麥草屬、莧屬和稗屬雜草等[12]。據(jù)我國(guó)有關(guān)部門(mén)報(bào)道，已經(jīng)有37種雜草的59個(gè)生物型被檢測(cè)出對(duì)化學(xué)除草劑產(chǎn)生了一定的抗藥性，其所對(duì)應(yīng)的化學(xué)除草劑共計(jì)10類31種[13]。

傳統(tǒng)創(chuàng)制抗除草劑作物的方法主要有3種，一是在種質(zhì)資源庫(kù)中篩選并加以利用；二是通過(guò)誘變技術(shù)獲得突變?nèi)后w，在一定的選擇壓下篩選天然突變體，以獲得抗性植株；三是通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法創(chuàng)制對(duì)除草劑有抗性的新品種，將可以對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性的抗性基因?qū)胧荏w有2種最常用的方法，分別是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法[14]。過(guò)去的20年對(duì)作物進(jìn)行基因改造的趨勢(shì)在不斷增加，作物中引入的主要轉(zhuǎn)基因性狀為抗除草劑、抗蟲(chóng)、抗病毒和抗逆境，其中，抗除草劑作物占轉(zhuǎn)基因作物的近83%[15]?？钩輨┳魑铮绕涫寝D(zhuǎn)基因抗除草劑作物在國(guó)際上被快速的采用，相關(guān)的農(nóng)場(chǎng)管理實(shí)踐表明，它們已經(jīng)成為管理雜草的重要工具。抗除草劑作物在一定程度上改變了雜草的管理方法，對(duì)全球農(nóng)業(yè)的發(fā)展作出了卓越的貢獻(xiàn)。

2 除草劑主要類型及作用機(jī)制

2.1 草甘膦與草銨膦

草甘膦和草銨膦同屬于氨基酸類非選擇性除草劑，這2種除草劑皆為芽后除草劑。

2.1.1 草甘膦 草甘膦[glyphosate,化學(xué)名N-(膦?；谆?甘氨酸，化學(xué)式：C3H8NO5P]是廣譜有機(jī)磷除草劑之一,它是一種在農(nóng)業(yè)中廣泛使用的除草劑，可防治多年生和1年生雜草。草甘膦是非選擇性和芽后除草劑的重要成分，用于保護(hù)作物免受禾本科植物、1年生闊葉雜草、木本植物等的侵害[16]。1974年，草甘膦除草劑的母體化合物由孟山都公司以商品名“Roundup”進(jìn)行出售[17]。草甘膦屬于C-P鍵膦酸鹽類的有機(jī)磷除草劑，是磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate, PEP）的類似物，可抑制5-烯醇丙酮基莽草酸3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS），這是合成芳香族氨基酸的關(guān)鍵酶[18]（圖1）。因?yàn)檫@種機(jī)制只在植物、細(xì)菌、真菌和頂端復(fù)合體寄生蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，所以草甘膦對(duì)各種雜草具有高度活性，但是對(duì)哺乳類動(dòng)物的影響不大[20]。草甘膦是廣譜、高效、低毒、廉價(jià)的內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，其被植株的莖葉吸收后傳導(dǎo)到植株的地下部，對(duì)深根雜草的地下組織破壞力強(qiáng)，一般農(nóng)業(yè)機(jī)械也很難達(dá)到其可達(dá)到的破壞深度。因?yàn)槠湓谕寥乐袝?huì)迅速降解，故被認(rèn)為是污染最小、安全性最強(qiáng)的商品化除草劑之一。雖然草甘膦除草劑的優(yōu)點(diǎn)明顯，但其對(duì)于水稻的生理毒性致使其很少直接應(yīng)用于水稻生產(chǎn)中，因此耐草甘膦水稻的發(fā)展將大大降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)水稻種植業(yè)的發(fā)展。

圖1 草甘膦與EPSPS底物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合、抑制其活性［19］Fig. 1 Glyphosate binding to EPSPS substrate binding sites and inhibiting its activity［19］

2.1.2 草銨膦 由于草甘膦抗性雜草數(shù)量和種類的增加，需要不同作用模式的除草劑來(lái)保護(hù)作物的產(chǎn)量。草銨膦（glufosinate）是一種從綠色產(chǎn)色鏈霉菌中分離出的非選擇性氨同化抑制劑，它可以對(duì)谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）產(chǎn)生抑制作用[21]。GS是用于將氨結(jié)合到谷氨酰胺中的必需酶，谷氨酸在GS的作用下添加氨而形成谷氨酰胺，因此草銨膦的抑制作用會(huì)導(dǎo)致氨的過(guò)量積累。光合作用的第二種抑制是氨基酸的消耗，這是GS抑制的下游效應(yīng)，這種作用可能是草銨膦除草活性的主要原因；由于GS抑制導(dǎo)致的氨基酸消耗，導(dǎo)致光呼吸途徑中乙醇酸途徑（乙醇酸途徑介導(dǎo)乙醇酸的氧化以產(chǎn)生乙醛酸，最終產(chǎn)生氨基酸甘氨酸）的氨基（NH2）供體消耗，從而阻止了乙醛酸向甘氨酸的轉(zhuǎn)化。研究表明，乙醛酸通過(guò)阻止RuBP的激活來(lái)抑制光合作用，RuBP是參與光和二氧化碳固定的關(guān)鍵酶[22-23]。抑制光合作用會(huì)導(dǎo)致膜損傷、葉綠素漂白，最終導(dǎo)致組織壞死。

2.2 乙酰乳酸合成酶抑制類除草劑

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）是合成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸的關(guān)鍵酶[24]，通過(guò)對(duì)ALS的酶活性進(jìn)行抑制能夠?qū)χф湴被岬暮铣僧a(chǎn)生阻礙作用，蛋白質(zhì)的合成也會(huì)因此受到影響，從而抑制植物的生長(zhǎng)[25]，因此，ALS是重要的除草劑靶點(diǎn)。ALS抑制類的除草劑根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可分為5個(gè)家族，包括磺酰脲類除草劑（sulfonylureas，SU）、咪唑啉酮類除草劑（imidazolinones，IMI）、嘧啶水楊酸類除草劑（pyrimidyl-benzoates, PB）、磺酰氨羧基三唑啉酮類除草劑（sulfonlyaminocarbonyl-triazolinones，SCT）和三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑（triazolopyrimidine，TP）[26]。ALS抑制劑類除草劑是對(duì)底物進(jìn)行阻斷作用，阻斷其進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)，從而影響二者之間的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)支鏈氨基酸的生物合成產(chǎn)生抑制作用，對(duì)生物體內(nèi)的蛋白代謝活動(dòng)產(chǎn)生破壞，最終達(dá)到滅殺雜草的目的[27]。乙酰乳酸合成酶主要存在于高等植物及真菌和細(xì)菌中，目前還未在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)ALS的存在，因此使用ALS抑制類除草劑可以在保證對(duì)植物有高度傷害的前提下降低對(duì)動(dòng)物的毒性，減輕了對(duì)動(dòng)物的傷害[28]。由于ALS抑制類除草劑的高強(qiáng)活性、殺草譜廣、選擇性強(qiáng)、使用方便等特點(diǎn)，使得ALS抑制類除草劑自問(wèn)世來(lái)，銷(xiāo)量就穩(wěn)居前列，成為僅次于草甘膦的除草劑系列，也是最受歡迎的選擇型除草劑系列，近幾年ALS抑制類除草劑的銷(xiāo)量依舊呈持續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。

2.3 原卟啉原氧化酶抑制類除草劑

原卟啉原IX氧化酶（protoporphyrinogen oxidase, PPO）是有效的除草劑靶點(diǎn)之一，PPO催化原卟啉原IX氧化為原卟啉IX，原卟啉IX是四吡咯合成系統(tǒng)的最后一種常見(jiàn)中間體，普遍存在于所有血紅素和葉綠素合成生物中[29]。在用PPO除草劑處理后，易感植物由于PPO的抑制而積累原卟啉原IX。原卟啉原IX被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，與非特異性質(zhì)膜結(jié)合的過(guò)氧化物酶反應(yīng)自發(fā)形成原卟啉IX。原卟啉IX在細(xì)胞質(zhì)中積累，并在有光的情況下產(chǎn)生單線態(tài)氧，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，即它會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜降解和細(xì)胞裂解，最終造成植株死亡[30]?，F(xiàn)有的幾種PPO類抑制劑除草劑包括二苯醚、噻二唑、惡二唑、三唑啉酮等，均可抑制原卟啉原IX氧化酶。在1980—1990年間，PPO抑制類除草劑被廣泛使用。然而，在20世紀(jì)90年代中期引入抗草甘膦作物后，PPO抑制類除草劑的銷(xiāo)量開(kāi)始下降；這種狀況一直持續(xù)到2006年，國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了越來(lái)越多對(duì)草甘膦具有抗性作用的雜草；雜草對(duì)ALS類抑制劑、草甘膦的廣泛抗性使得國(guó)內(nèi)外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者恢復(fù)了PPO類抑制劑除草劑的大量使用[31-32]。

2.4 對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶抑制除草劑

對(duì)羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD）除草劑是一種相對(duì)較新的除草劑，因其廣泛的雜草防治譜、低施用率、作物選擇性和低毒性而在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[33]。HPPD是生育酚和質(zhì)體醌（plastoquinone, PQ）生物合成的關(guān)鍵酶，HPPD在植物體內(nèi)催化對(duì)羥苯基丙酮酸（4-hroxyphenylpyruvate, HPP）產(chǎn)生尿黑酸，尿黑酸是PQ與生育酚生物合成中的關(guān)鍵前體物質(zhì)，HPPD抑制類除草劑的抑制機(jī)制是與HPP基質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)性作用，即使酶與抑制劑緊密結(jié)合，從而影響尿黑酸的產(chǎn)生；生育酚是一種抗氧化劑保護(hù)膜[34]，PQ不僅是光合作用中的電子轉(zhuǎn)運(yùn)體，還是類胡蘿卜素生物合成中的輔助因子[35]。當(dāng)HPPD被抑制時(shí)，生育酚和PQ水平下降，導(dǎo)致類胡蘿卜素耗盡，致使葉片漂白和植物死亡，HPPD抑制劑對(duì)植物的損傷程度取決于類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)換量，因此較老組織的損傷速度比幼嫩組織慢。生育酚與類胡蘿卜素可以作為活性氧的清除劑在健康的植株中發(fā)揮作用，植物組織因此受到保護(hù)從而免受傷害[36]。許多HPPD抑制類的除草劑在全球范圍內(nèi)被引入，不同種類的HPPD抑制劑類除草劑結(jié)構(gòu)差異較大，但是對(duì)HPPD的活性都有專一的抑制性，三酮類（硝磺草酮，mesotrione；環(huán)磺酮，tembotrione）、異噁唑類（異噁唑草酮，isoxaflutole）和吡唑類（苯吡唑草酮，topramezone）等是目前市場(chǎng)上主要的對(duì)HPPD具有抑制作用的除草劑化合物[37]。

2.5 乙酰輔酶A羧化酶抑制除草劑

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制除草劑于1978年隨著雙氯氟草胺的出現(xiàn)首次引入市場(chǎng)[38]。這類除草劑可選擇性地控制雙子葉作物雜草，也可以在一定限度內(nèi)對(duì)單子葉作物產(chǎn)生活性影響，估計(jì)每年處理面積為1.2億hm2[39]，在對(duì)抗草甘膦雜草的管控中起到了至關(guān)重要的作用。ACCase是一種催化丙二酰輔酶A形成的重要酶，反應(yīng)產(chǎn)物丙二酰輔酶A參與質(zhì)體中脂肪酸的生物合成以及長(zhǎng)鏈脂肪酸和次級(jí)代謝產(chǎn)物的延伸，這些代謝產(chǎn)物對(duì)能量?jī)?chǔ)存、細(xì)胞或細(xì)胞器的生物膜結(jié)構(gòu)組成和激素調(diào)節(jié)至關(guān)重要[40]。針對(duì)ACCase的除草劑可以抑制禾草植物的葉綠體ACCase活性，導(dǎo)致脂肪酸產(chǎn)量下降，這類除草劑通常在出苗后用于控制稻麥田中的雜草[41]。ACCase由生物素-羧基載體蛋白（biotin carboxyl-carrier, BCC）、生物素羧化 酶（biotin carboxylase, BC）和 羧 基 轉(zhuǎn) 移 酶（carboxyltrans-ferase, CT，具有亞基α和β）3個(gè)功能域組成，BC和CT結(jié)構(gòu)域承擔(dān)依賴于ATP、Mg2+和HCO3-的催化活性，這導(dǎo)致乙酰輔酶A羧化和丙二酰輔酶A的形成。下面是由BC和CT亞基催化的2個(gè)反應(yīng)[42-43]。

已在植物中鑒定出2種不同類型的ACCase，即胞液型和質(zhì)體型。質(zhì)體型對(duì)ACC類抑制劑敏感，在草類中酶活性高達(dá)80%[44]。抑制ACC活性的除草劑是近年來(lái)除草劑品種發(fā)展過(guò)程中較為重要的除草劑，其種類主要包括芳氧苯氧丙酸類（aryloxyphenoxypropionate，AOPP）與環(huán)己烯酮類（cyclohexanedione， CHD）化合物，主要產(chǎn)品有禾草 靈 (diclofop)、精 惡 唑 禾 草 靈 (fenoxaprop-P-ethyl)、喹 禾 靈 (quizafop-ethyl)、噻 唑 禾 草 靈(fenthiaprop)、稀 禾 定 (sethoxydim)、烯 草 酮(clethodim)等，它們通過(guò)抑制質(zhì)體型乙酰輔酶A羧化酶的活性使得脂類生物的合成受到阻礙，最終造成植物死亡。

2.6 激素類除草劑

在大量、多種除草劑的使用中，激素類除草劑的作用不容忽視。激素類除草劑的結(jié)構(gòu)與生長(zhǎng)素吲哚乙酸（indolyl-3-acetic acid，IAA）相似，對(duì)植株體內(nèi)的激素平衡具有一定的影響，根據(jù)生長(zhǎng)素的雙重性，二者皆在低水平使用時(shí)對(duì)植株具有生長(zhǎng)促進(jìn)作用，高水平時(shí)殺死植株[45]。第二次世界大戰(zhàn)后，生長(zhǎng)素除草劑2,4-D和MCPA進(jìn)入全球市場(chǎng)，開(kāi)啟了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雜草控制的新時(shí)代，目前，這類除草劑常見(jiàn)的種類包括苯氧羧酸、苯甲酸、吡啶羧酸、芳香羧甲基衍生物和喹啉羧酸[46]。激素類除草劑問(wèn)世后，對(duì)田間一年生與多年生闊葉類雜草的防治作出了很大貢獻(xiàn)。

3 轉(zhuǎn)基因抗除草劑稻麥種質(zhì)資源創(chuàng)制

轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物是利用基因工程技術(shù)從某種生物體中提取所需的抗除草劑基因，將其轉(zhuǎn)入目標(biāo)農(nóng)作物中，使其與目標(biāo)農(nóng)作物的基因進(jìn)行重組，從而培育出對(duì)特定除草劑產(chǎn)生優(yōu)良抗性的新種質(zhì)。從1995—2014年，轉(zhuǎn)基因作物的種植使化學(xué)農(nóng)藥的施用量降低了37%，作物產(chǎn)量提高了22%，使農(nóng)民的利潤(rùn)提高了68%[47]。轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物在1996年首次實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，自此以后，抗除草劑性狀便一直是轉(zhuǎn)基因作物研究的主要性狀，2019年轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的全球種植面積約8 000萬(wàn)hm2，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的88%左右[48]。中國(guó)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)方面投入了大量資源，取得了一定進(jìn)展，我國(guó)已獲得具有營(yíng)養(yǎng)改善、抗旱、抗藥、耐鹽堿、營(yíng)養(yǎng)高效利用等重要性狀的基因300多個(gè)，并且已篩選出46個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和重要育種價(jià)值的功能基因[47]。在抗除草劑基因方面，我國(guó)共有48項(xiàng)專利，發(fā)掘的抗除草劑基因可以使作物分別對(duì)草甘膦、草銨膦、咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑產(chǎn)生不同程度的抗性，其中抗草甘膦的基因就達(dá)到40項(xiàng)[49]。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展，其優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯，主要體現(xiàn)在提高除草效果、降低除草成本；利于采用保護(hù)性耕作；有助于采用窄行間距種植。

3.1 抗草甘膦與草銨膦稻麥種質(zhì)資源

草甘膦在植物體內(nèi)會(huì)與EPSPS和三磷酸莾草酸（S3P）結(jié)合形成復(fù)合體，這將導(dǎo)致EPSPS的活性受到抑制，生物體正常的氨基酸代謝也因此受到阻礙，從而使植物死亡[50]。EPSPS是廣泛存在于植物、微生物中參與莽草酸代謝途徑的重要酶，是草甘膦的作用靶點(diǎn)，天然狀態(tài)下對(duì)草甘膦比較敏感，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)草甘膦的解除機(jī)制是通過(guò)過(guò)量表達(dá)EPSP酶，EPSP酶與草甘膦競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而達(dá)到增強(qiáng)植株抗性的目的。農(nóng)桿菌（Agrobacteriumsp.）中有一種CP4酶，是細(xì)菌中的EPSPS，其對(duì)草甘膦不敏感。CP4對(duì)PEP具有很高的親和力，轉(zhuǎn)基因作物通過(guò)異源表達(dá)CP4基因，使得莽草酸途徑可以在不經(jīng)過(guò)作物自身的EPSPS體系的情況下正常進(jìn)行。Chhapekar等[51]在這一理論基礎(chǔ)下，通過(guò)將密碼子優(yōu)化的CP4 EPSPS轉(zhuǎn)入到水稻品種IR64中，得到了可以對(duì)10倍商業(yè)推薦使用劑量的草甘膦具有耐受作用的轉(zhuǎn)化植株。soil EPSPS是王云鵬等[52]在2014年成功克隆的1個(gè)新的抗草甘膦的EPSPS基因，利用農(nóng)桿菌浸染的方法，使soil EPSPS在水稻中異源表達(dá)，獲得了1種全新的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦植株，經(jīng)過(guò)測(cè)試，這種抗性植株能夠?qū)Ω哌_(dá)500 mmol·L-1的草甘膦產(chǎn)生耐受作用。2015年，浙江大學(xué)研究人員利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將密碼子優(yōu)化的殺蟲(chóng)基因HJC-1和細(xì)菌克隆而來(lái)的抗草甘膦EPSPS基因G6導(dǎo)入栽培水稻品種‘秀水110’中，成功培育出具有抗蟲(chóng)、耐草甘膦雙重功效的轉(zhuǎn)基因水稻“G6H1”[53]。2018年，董玉鳳等[54]成功將表達(dá)G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻G2-6、G2-7，與非轉(zhuǎn)基因品種‘中花11’相比，其草甘膦抗性分別提高了104和123倍，并且該品種很大程度上降低了轉(zhuǎn)基因漂流的概率。

抗草銨膦作物的抗性源自2種使草銨膦失活的乙酰轉(zhuǎn)移酶同源酶基因中的1種，分別是綠色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes）的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（phosphinothricin acetyltransferase gene，PAT）、吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的雙丙氨磷抗性基因（bialaphos resistance gene,BAR)[55],它通過(guò)催化草銨膦氨基的乙?；梢允共蒌@膦失活，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)該類基因，是獲得耐除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的一種方法。目前，已成功將Bar基因?qū)氲揭幌盗凶魑镏?，如油菜、玉米、甜菜、大豆、亞麻、豌豆、水稻、小麥、煙草、番茄、黑麥、馬鈴薯、大麥及胡蘿卜等[56]。研究人員通過(guò)將Bar基因轉(zhuǎn)入‘秀水 04’‘D68’‘明恢 63’‘E32’‘R187’‘R893’等兩系或者三系恢復(fù)系水稻品種以及‘旱稻297’和‘旱稻502’中[57]，培育出多個(gè)具有應(yīng)用價(jià)值的抗草銨膦轉(zhuǎn)基因水稻新材料。Wang等[58]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bar基因轉(zhuǎn)入到北方粳型恢復(fù)系‘津稻162’和‘津稻18’中，并利用0.25%的草銨膦除草劑Basta對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株分別進(jìn)行涂布試驗(yàn)，檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因的‘津稻162’的抗性植株率為92%，‘津稻18’的抗性植株率為78%。Zhu等[44]利用基因槍法將Bar基因?qū)氲剿酒贩N‘京引119’中，并開(kāi)展了利用Bar基因提高和快速鑒定雜交稻純度的嘗試[59]，同時(shí)還成功將抗草甘膦基因cp4轉(zhuǎn)入水稻，配制出抗草甘膦和草銨膦的轉(zhuǎn)基因直播稻品系（組合）嘉禾98及雜交稻組合遼優(yōu)1046等，為直播稻的化學(xué)除草技術(shù)做出了杰出貢獻(xiàn)[50]。秦冠男等[60]發(fā)現(xiàn)來(lái)自細(xì)菌Nocardiasp. AB2253 的蛋氨酸砜 N-乙?；D(zhuǎn)移酶基 因（methionine sulfone nacetyltransferase gene,Mat）編碼產(chǎn)物具有N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性，能解除草銨膦的毒性，但這種基因在植物中表達(dá)效率較低，于是用水稻偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的Mat#基因轉(zhuǎn)化秈稻品系9K，除草劑抗性檢測(cè)結(jié)果顯示，該轉(zhuǎn)化體的芽期草銨膦耐受劑量至少為 600 mg·L-1、秧苗期草銨膦耐受劑量至少為 1 000 mg·L-1，對(duì)草銨膦的抗性水平不低于轉(zhuǎn)Bar的水稻‘9KA2’。

3.2 抗ALS類除草劑稻麥種質(zhì)資源

Li等[61]從擬南芥抗磺酰脲類除草劑突變系GH50中分離出1種突變的乙酰乳酸合成酶基因csrl-1，這種突變體的乙酰乳酸合成酶基因與磺酰脲類除草劑親和力很低，已將其導(dǎo)入水稻中，此基因在在轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞中受啟動(dòng)基因CaMV35S控制，使轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)氯磺隆的抗性提高了200倍。Kawai等[62]研究證明水稻來(lái)源的ALS中W548L/S627I位點(diǎn)突變的基因可以作為篩選標(biāo)記基因，得到抗除草劑雙草醚（bispyribac-sodium，BS）的轉(zhuǎn)基因水稻。

3.3 抗PPO類除草劑稻麥種質(zhì)資源

研究發(fā)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因的方法在水稻中過(guò)量表達(dá) 人 類（Homo sapiens）、枯 草 桿 菌（Bacillus subtilis）、粘球菌（Myxococcus xanhus）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的protox基因，能夠獲得水稻新品系，這些新品系對(duì)PPO類抑制型除草劑能產(chǎn)生一定的耐藥性[40]。Lee等[63]發(fā)現(xiàn)，來(lái)自枯草桿菌的原卟啉原氧化酶對(duì)二苯醚除草劑具有耐性，于是將其導(dǎo)入水稻中，它在水稻植株細(xì)胞質(zhì)或質(zhì)體中的表達(dá)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)乙氧氟草醚（oxyfluorfen）的高度抗性。Jung等[64]研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入了在葉綠體與線粒體表達(dá)粘球菌的原卟啉原氧化酶的轉(zhuǎn)基因水稻品種M44對(duì)乙氧氟草醚的抗性提高200倍以上。

3.4 抗HPPD類除草劑稻麥種質(zhì)資源

據(jù)報(bào)道，目前已經(jīng)有多個(gè)能夠?qū)PPD抑制類除草劑產(chǎn)生抗性的HPPD基因被克隆表達(dá)，例如從Coptis japonica克隆了CjHPPD基因，在植株中過(guò)量表達(dá)CjHPPD基因可以使植株對(duì)吡唑特和雙環(huán)磺草酮產(chǎn)生耐受性[65]；從土壤宏基因組克隆表達(dá)了能夠使植株抗磺草酮的mHPPD基因[66]；黃彥等[67]克隆了菌株P(guān)seudomonassp. AM-H4的HPPD基因，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)將此基因在植株體內(nèi)過(guò)量表達(dá)可以使植株對(duì)HPPD抑制類除草劑產(chǎn)生抗性。目前，對(duì)于抗HPPD抑制類除草劑作物的研究仍在繼續(xù)，但還沒(méi)有相關(guān)轉(zhuǎn)基因稻麥種質(zhì)資源商業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。

3.5 抗ACC類除草劑稻麥種質(zhì)資源

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)的高愛(ài)保等[68]通過(guò)對(duì)小麥的近緣品種谷子對(duì)ACC類抑制劑除草劑的抗性研究發(fā)現(xiàn)，小麥ACC酶1779I-1779Leu會(huì)導(dǎo)致其對(duì)APP類和CHD類除草劑產(chǎn)生抗性，加速了對(duì)抗ACC類除草劑稻麥種質(zhì)資源商品化研究的進(jìn)展。

3.6 抗激素類除草劑稻麥種質(zhì)資源

麥草畏是目前市場(chǎng)上激素類除草劑中較受歡迎的一種，屬苯甲酸類，前人從土壤細(xì)菌Pseudonanas maltophilia(菌系DI-6)中分離出能降解麥草畏的酶DMO，DMO在雙子葉植物中的表達(dá)可以使植株抵抗致死量麥草畏所帶來(lái)的影響，目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將該基因在大豆、煙草、番茄中進(jìn)行了過(guò)量表達(dá)，突變株皆對(duì)麥草畏產(chǎn)生了一定的耐受性，但是有關(guān)其在稻麥種質(zhì)資源中的作用還在研究中[69]。

4 非轉(zhuǎn)基因抗除草劑稻麥種質(zhì)資源創(chuàng)制

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，非轉(zhuǎn)基因這一定義也開(kāi)始被提出，非轉(zhuǎn)基因技術(shù)指含有少于0.9%的轉(zhuǎn)基因原理的育種技術(shù)，其在抗除草劑稻麥種質(zhì)資源的創(chuàng)制過(guò)程中起到了先導(dǎo)作用。隨著生物技術(shù)與基因工程的發(fā)展，非轉(zhuǎn)基因技術(shù)也不只是單純的傳統(tǒng)育種，傳統(tǒng)育種與生物技術(shù)的結(jié)合使得抗除草劑作物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)迅速發(fā)展[70]。目前選育抗除草劑作物的非轉(zhuǎn)基因方法多種多樣，主要有傳統(tǒng)雜交育種、種子誘變、花粉選擇、細(xì)胞（原生質(zhì)體）融合和細(xì)胞組織培養(yǎng)，利用這些方法選育出了眾多抗除草劑作物并得到推廣應(yīng)用，其中也不乏優(yōu)質(zhì)的稻麥種質(zhì)資源?，F(xiàn)如今，基因編輯技術(shù)CRISP/Cas9也是一大熱門(mén)非轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，其不僅易操作、效率高，還可以定向改造抗除草劑基因，為農(nóng)作物的種質(zhì)資源創(chuàng)制提供了一條全新的道路。

4.1 抗草甘膦稻麥種質(zhì)資源

草甘膦作為國(guó)內(nèi)銷(xiāo)量最高的除草劑，對(duì)其具有抗性的種質(zhì)資源是一大研究熱門(mén)。魏松紅等[71]應(yīng)用紫外線和疊氯化鈉對(duì)小麥種子進(jìn)行誘變，成功獲得抗草甘膦的小麥植株。童漢華等[50]對(duì)‘中花11’‘京引119’等粳稻品種種子進(jìn)行γ射線輻射誘變處理，通過(guò)對(duì)誘變體在秧苗期分別施以不同水平草甘膦，逐步聚合對(duì)草甘膦的抗性，從‘中花11’的輻射后代中成功選育出1份耐草甘膦突變體材料，該突變體材料能耐20 mL·L-1的草甘膦。Li等[72]使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）通路對(duì)水稻EPSPS基因的Thr102Ile和Pro106Ser堿基進(jìn)行定點(diǎn)置換，并用含有Thr102Ile和Pro106Ser的相同DNA片段對(duì)水稻EPSPS基因片段進(jìn)行定點(diǎn)置換突變，成功獲得了抗草甘膦的水稻材料，并且替換位點(diǎn)和插入突變位點(diǎn)穩(wěn)定地遺傳給下一代。

4.2 抗ALS類除草劑稻麥種質(zhì)資源

到目前為止，使用非轉(zhuǎn)基因方法培育出的抗除草劑種質(zhì)資源最成功的即為抗ALS類除草劑作物種質(zhì)資源。2007年Endo等[73]發(fā)現(xiàn)，利用基因靶向編輯技術(shù)將ALS基因序列中的第548位氨基酸處的色氨酸（TGG）轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔═TG），以及將第627位氨基酸處的絲氨酸（AGT）轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼幔ˋTT），可以有效提高植株對(duì)雙草醚的抗性。2012年，深圳市興旺生物種業(yè)有限公司使用EMS誘變技術(shù)對(duì)‘黃華占’和‘黃絲占’2個(gè)品種進(jìn)行誘變，利用0.345%的咪唑啉酮類除草劑滅草煙對(duì)其3～4葉期的幼苗進(jìn)行噴施，隨后進(jìn)行篩選，最終存活的植株即為具有抗性的植株，對(duì)具有抗性的‘黃華占’和‘黃絲占’品種進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果表明，‘黃絲占’的突變植株是由于ALS基因發(fā)生了Ala96Val或Trp548Cys或Ser627Asn突變，‘黃華占’的突變株是由于ALS基因發(fā)生了Ala96Thr或Trp548Met突變，導(dǎo)致原本對(duì)咪唑啉酮類除草劑不具抗性的植株產(chǎn)生了抗性[74]。夏蘭琴等[75]在2015年對(duì)‘日本晴’品種使用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)修飾了ALS第548、627位的氨基酸（TGG-TTG、AGT-ATT），實(shí)現(xiàn)了利用基因工程方法對(duì)水稻ALS基因的定點(diǎn)突變，成功獲得了抗嘧啶羧酸類除草劑雙草醚的水稻植株。張保龍等[76]在2021年利用EMS技術(shù)對(duì)‘秈稻93-11’品種種子進(jìn)行了誘變，隨后使用咪唑啉酮類除草劑甲基咪草煙（又名百壟通）對(duì)3～4葉期的M2植株進(jìn)行噴施，最終篩選出對(duì)百壟通具有抗性的水稻突變植株；對(duì)抗性突變株進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，突變抗體的ALS基因序列中第627位絲氨酸不僅突變?yōu)樘於彼幔€會(huì)突變?yōu)榱涟彼幔?種突變都會(huì)使‘秈稻93-11’產(chǎn)生對(duì)除草據(jù)百壟通的抗性。2018年，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所歷經(jīng)多年，在7 403份水稻品種資源材料里篩選出具有抗咪草煙特性的‘金梗 818’[77]。

4.3 抗ACC類除草劑稻麥種質(zhì)資源

隨著對(duì)ACC抑制類除草劑研究的不斷深入，已經(jīng)培育出多種抗ACC抑制類除草劑作物種質(zhì)資源，通過(guò)非轉(zhuǎn)基因技術(shù)組織培養(yǎng)篩選獲得具稀禾定（sethoxydim）抗性的墨西哥甜玉米B50S品系，還有通過(guò)傳統(tǒng)育種培育出抗ACC類除草劑的高粱，二者皆已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[78]。Liu等[79]基于ACCase CT結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計(jì)sgRNA，構(gòu)建了3個(gè)突變文庫(kù)eABE、eBE3和eCDA，在eABE和eBE3文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了對(duì)高效蓋草能具有抗性的Ile1879Val、Trp2125Ser和Cys2186Arg突變體。Li等[80]結(jié)合胞嘧啶編輯器A3A-PBE和腺嘌呤堿基編輯器PABE-7構(gòu)建了1個(gè)STEMEs系統(tǒng)（飽和靶向內(nèi)源性誘變編輯器），使用STEMEs編輯水稻ACCase基因，獲得了具有Ser1866Phe、Ala1884Pro、Pro1927 Phe和Trp2125Cys替換的突變體，其中，Pro1927 Phe和Trp2125Cys突變體對(duì)除草劑蓋草能的抗性足夠高，可用于田間雜草防治。維多利亞農(nóng)業(yè)服務(wù)有限公司使用疊氮化鈉和甲基亞硝基脲對(duì)水稻種子進(jìn)行誘變，獲得了對(duì)精喹禾靈具有抗性的突變體，該突變體在ACCase的羧基轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)有1個(gè)G到A的突變，導(dǎo)致Gly2096Ser突變和對(duì)ACC類抑制劑除草劑的抗性[81]。第1個(gè)獲批的水稻PVL01來(lái)自BASF 1-5，BASF 1-5是抗ACC類抑制劑除草劑的水稻品系，在ACCase蛋白中發(fā)生了Ile1781Leu突變[82]。這對(duì)田間除草系統(tǒng)是一項(xiàng)非常好的補(bǔ)充，種植者可以交替使用ALS類抑制劑除草劑和ACC類抑制劑除草劑來(lái)控制田間雜草。

5 結(jié)語(yǔ)

水稻和小麥?zhǔn)俏覈?guó)最重要的糧食作物，稻麥輪作是我國(guó)南方傳統(tǒng)耕作方式，探索在推動(dòng)直播連作背景下加快稻麥抗除草劑種質(zhì)資源的挖掘與利用，構(gòu)建稻麥抗除草劑材料種藥一體化生產(chǎn)模式具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。無(wú)論是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)還是非轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的抗性作物，都是抗除草劑作物種質(zhì)資源研究和應(yīng)用領(lǐng)域的重大突破，在擴(kuò)大除草劑的使用范圍、延長(zhǎng)使用時(shí)間、降低除草成本、減少耕作、降低能耗等方面發(fā)揮了重要作用。隨著抗除草劑作物的廣泛種植，在很大程度上改變了雜草防治的方式，但是隨著除草劑的反復(fù)使用，雜草對(duì)除草劑的抗性也在逐漸增強(qiáng)，這就需要盡快開(kāi)發(fā)新作用機(jī)制除草劑及其抗性作物技術(shù)，為加快建設(shè)綠色有機(jī)稻麥產(chǎn)業(yè)提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。