自噬在排卵障礙性不孕癥中的作用

張磊，梁琳琳，馮科，孟勵(lì)，張翠蓮

國(guó)家統(tǒng)計(jì)局最新數(shù)據(jù)顯示，2021年我國(guó)出生人口數(shù)為1 062萬(wàn)人，凈增人口數(shù)為48萬(wàn)人，為建國(guó)以來(lái)最少；65歲及以上人口為20 056萬(wàn)人，占全國(guó)人口14.2%，人口老齡化程度進(jìn)一步加重。根據(jù)我國(guó)人口發(fā)展變化形勢(shì)，國(guó)家制定了一系列措施，優(yōu)化生育政策，促進(jìn)生殖健康，而不孕不育是目前我國(guó)面臨的生殖健康突出問題之一。我國(guó)育齡夫婦的不孕不育率已經(jīng)攀升至12%～18%，嚴(yán)重影響了家庭生活和社會(huì)發(fā)展。排卵障礙是臨床不孕癥的常見病因之一，發(fā)病的原因是無(wú)排卵或稀發(fā)排卵，這類患者主要包括多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）、卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）和卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫（ovarian endometriosis cyst，OEC）等。自噬（autophagy）參與維持卵巢原始卵泡的儲(chǔ)備，調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育、閉鎖、黃體的形成和退化等過程[1-2]，并在卵巢缺氧、高齡卵巢以及卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育中起重要作用?，F(xiàn)對(duì)自噬在排卵障礙性不孕癥中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步研究和臨床干預(yù)提供參考和借鑒。

1 自噬的研究概述

自噬意為自體吞噬，是指真核細(xì)胞在自噬因子的調(diào)控下通過溶酶體降解自身細(xì)胞質(zhì)蛋白和受損細(xì)胞器的過程，包括生理?xiàng)l件下的基礎(chǔ)型自噬和應(yīng)激條件下的誘導(dǎo)型自噬，被降解后的代謝產(chǎn)物可以被細(xì)胞重新利用，從而維持細(xì)胞和機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)和能量平衡，其機(jī)制高度保守[3]。在高等真核生物中存在3種不同類型的自噬——微自噬、分子伴侶自噬和巨自噬，它們?cè)跈C(jī)制和形態(tài)上都存在差異，一般情況下所說的自噬指的是巨自噬。1966年，Christian de Duve和Robert Wattiaux提出了“微自噬”一詞，用來(lái)描述溶酶體膜內(nèi)陷將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包裹并將其降解的過程。微自噬在酵母中研究最多，既可以選擇性地降解特定的細(xì)胞成分，也可以非選擇性地隨機(jī)靶向某些細(xì)胞質(zhì)成分，而在高等生物中，微自噬的研究較少。分子伴侶自噬具有高度選擇性，熱休克蛋白家族A成員8（heat shock protein family A member 8，HSPA8）識(shí)別帶有五肽基序KFERQ的靶蛋白，并將其傳遞給溶酶體膜上的受體蛋白2A（lysosomalassociated membrane protein 2A，LAMP2A），識(shí)別、結(jié)合目的蛋白后進(jìn)入溶酶體降解[4]。巨自噬是指通過形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，包裹待降解的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，在溶酶體水解酶的作用下轉(zhuǎn)化成氨基酸和其他有機(jī)分子，最終釋放到細(xì)胞質(zhì)中被重新利用進(jìn)行合成代謝的過程[5]。

自噬是一種細(xì)胞生存機(jī)制，對(duì)受損細(xì)胞組分的降解和再利用至關(guān)重要，正常細(xì)胞中普遍存在一定程度的自噬，以維持新陳代謝和細(xì)胞、組織的能量平衡。但自噬是一把雙刃劍，過度自噬反而會(huì)阻礙正常的細(xì)胞凋亡過程，也可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生Ⅱ型程序性死亡，自噬失衡可導(dǎo)致多種疾病，如神經(jīng)退行性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病和代謝紊亂等[6-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，自噬在精子生成障礙、子宮內(nèi)膜病變和排卵障礙等不孕（育）癥中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

2 排卵障礙性不孕癥

不孕癥是指夫妻雙方在沒有采取任何避孕措施的情況下正常性生活1年后仍沒有成功妊娠。世界上約17%的夫婦患有不孕癥[8]，其會(huì)對(duì)不孕夫婦的身心健康產(chǎn)生不良影響。女性不孕因素主要包括排卵障礙、輸卵管因素、子宮內(nèi)膜容受性異常，其中排卵障礙性不孕癥約占25%[9]，發(fā)病原因包括內(nèi)分泌紊亂、卵巢病變等，PCOS、POI、POF和OEC均可能由卵巢病變引起不排卵而導(dǎo)致不孕。

PCOS是一種常見且復(fù)雜的育齡期女性內(nèi)分泌代謝性疾病，其臨床表現(xiàn)為排卵障礙、高雄激素血癥、肥胖及胰島素抵抗等，與2型糖尿病、生育力下降及心血管疾病等遠(yuǎn)期并發(fā)癥有關(guān)，占排卵障礙性不孕癥的70%～80%[10]。POI是一種以卵巢功能提前衰退為特征的臨床綜合征，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂（月經(jīng)稀發(fā)或停經(jīng)）并伴隨卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平升高和雌激素水平降低。POI在40歲之前的發(fā)病率為1%～2%，30歲之前的發(fā)病率為0.1%，其發(fā)病原因是高度異質(zhì)性的，包括自身免疫性疾病、代謝紊亂、病毒感染和醫(yī)源性因素等[11]。POF是指在女性40歲之前，由于卵巢功能衰竭而導(dǎo)致閉經(jīng)，其特征是原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)，血液中FSH水平升高，雌激素水平降低[12]。POF的FSH診斷閾值高于POI，診斷時(shí)大多數(shù)患者的卵巢功能已經(jīng)接近完全衰竭，失去了生育的機(jī)會(huì)。OEC是子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）的常見類型，是典型的卵巢型病變，異位的內(nèi)膜使卵巢的正常組織受破壞而纖維化，包膜增厚，發(fā)生巧克力樣囊腫，從而影響卵巢中正常卵泡的發(fā)育和卵子的排出，并且可影響黃體的形成和功能，也可發(fā)生未破裂卵泡黃素化綜合征，最終導(dǎo)致女性不孕[13]。

3 自噬在排卵障礙性不孕癥中的調(diào)節(jié)作用

3.1 自噬與PCOS在卵巢中，從卵母細(xì)胞的起源到卵泡的發(fā)育、退化都離不開適當(dāng)?shù)墓δ苄宰允?，正常情況下自噬是卵泡顆粒細(xì)胞維持卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、卵泡發(fā)育，以及卵泡閉鎖所必需的。由于卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的自噬缺陷，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，可導(dǎo)致女性不孕。有研究表明，PCOS患者的卵巢顆粒細(xì)胞中存在自噬異常[14-15]。

PCOS患者的小卵泡數(shù)目眾多，但往往無(wú)法形成優(yōu)勢(shì)卵泡導(dǎo)致排卵障礙性不孕，是一種常見且復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝性疾病，肥胖型PCOS患者存在更為嚴(yán)重的內(nèi)分泌紊亂和代謝功能異常，包括胰島素抵抗、高胰島素血癥、慢性炎癥反應(yīng)等[16]。趨化素（chemerin）是G蛋白耦聯(lián)受體-趨化因子受體樣1（chemokine receptor-like 1，CMKLR1）的內(nèi)源性配體，是一種與肥胖和代謝綜合征相關(guān)的新型脂肪因子，主要通過激活CMKLR1的生物學(xué)活性發(fā)揮作用。有研究采用高脂飲食且皮下注射丙酸睪酮建立大鼠PCOS模型，發(fā)現(xiàn)趨化素和CMKLR1在卵巢中的表達(dá)量異常升高；在顆粒細(xì)胞中高表達(dá)趨化素后自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）被激活；進(jìn)一步結(jié)合自噬的抑制和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，證明趨化素可通過抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路促進(jìn)PCOS顆粒細(xì)胞自噬[17]。

高雄激素血癥是PCOS的臨床癥狀之一，并可影響其他代謝過程[18]。同型半胱氨酸是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的氨基酸，在PCOS患者的血清中異常高表達(dá)。研究者用雙氫睪酮誘導(dǎo)PCOS小鼠模型，發(fā)現(xiàn)PCOS小鼠卵巢中自噬活性異常升高，血清和卵巢組織中同型半胱氨酸的含量增加；在小鼠顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加同型半胱氨酸可通過mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)自噬活性，而在PCOS小鼠顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中添加雄激素受體抑制劑ARN509后，發(fā)現(xiàn)異常升高的同型半胱氨酸和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量降低[19]。以上研究表明，PCOS中高水平的雄激素通過增加同型半胱氨酸的含量，抑制mTOR信號(hào)通路進(jìn)而增強(qiáng)自噬活性。

二甲雙胍是治療PCOS的常用藥，具有降低高雄激素血癥和誘導(dǎo)排卵的作用，然而二甲雙胍改善PCOS的機(jī)制尚不清楚。Xu等[20]用二甲雙胍治療來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍降低了PCOS大鼠顆粒細(xì)胞中的自噬水平；用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞高自噬水平的細(xì)胞模型，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加二甲雙胍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激和自噬水平均降低，并影響PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)。該研究表明二甲雙胍能通過PI3K/AKT/mTOR通路降低PCOS顆粒細(xì)胞中的過度自噬。

3.2 自噬與POI/POF卵泡發(fā)育決定了生物體的生殖周期，由于排卵和卵泡閉鎖原因，隨著年齡的增長(zhǎng)始基卵泡總數(shù)減少。卵泡閉鎖主要通過細(xì)胞凋亡發(fā)生，但現(xiàn)階段的研究表明自噬在卵泡閉鎖中也起著重要作用，自噬異?？赡芘cPOI/POF的發(fā)病有關(guān)。

Atg7是自噬小體形成過程中關(guān)鍵的自噬相關(guān)基因之一，其表達(dá)水平在卵母細(xì)胞發(fā)生過程中相對(duì)穩(wěn)定，生殖細(xì)胞特異性敲除Atg7后引起雌性小鼠卵泡缺失，導(dǎo)致POF[21]。Delcour等[22]提取了69例POI患者的DNA進(jìn)行全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Atg7和Atg9a在POI患者中存在突變，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)Atg7和Atg9a的突變減少自噬小體形成，降低自噬活性，導(dǎo)致卵巢功能受損。

近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞因免疫原性低、增殖能力強(qiáng)和易于分離等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是治療POI的理想細(xì)胞系[23-24]。自噬可以被氧化應(yīng)激激活，而活性氧能夠直接引起氧化應(yīng)激，是自噬的早期誘導(dǎo)因子[25]，也是導(dǎo)致卵巢功能障礙的重要因素。Lu等[26]用順鉑建立大鼠POI模型，連續(xù)7 d對(duì)造模成功的小鼠尾靜脈注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSC），結(jié)果發(fā)現(xiàn)hUCMSC可通過減少氧化應(yīng)激和調(diào)控AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/mTOR信號(hào)通路降低自噬水平，恢復(fù)POI大鼠的卵巢功能。Yin等[27]用環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠POF模型，分別注射正常hUCMSC、高表達(dá)或干擾血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）的hUCMSC，結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明hUCMSC能通過HO-1激活c-Jun氨基端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase，JNK）/Bcl-2信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬，恢復(fù)POF小鼠的卵巢功能。因此，自噬和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)是間充質(zhì)干細(xì)胞治療POI/POF的重要機(jī)制。

褪黑素參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)和體質(zhì)量，抑制腫瘤生長(zhǎng)，在女性生殖特別是POI中發(fā)揮重要作用[28]。褪黑素的主要合成場(chǎng)所是線粒體，而線粒體功能異常與卵巢儲(chǔ)備功能低下密切相關(guān)。為了明確褪黑素是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬改善線粒體功能從而保護(hù)POI患者的卵巢功能，Xie等[29]首先建立了穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3（熒光自噬指示體系）的卵巢細(xì)胞損傷模型，然后在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加褪黑素，發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)過度自噬引起的線粒體含量、線粒體膜電位和核編碼蛋白表達(dá)水平下降具有保護(hù)作用，且能夠降低異常激活的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和P38的表達(dá)。該研究提示褪黑素通過下調(diào)ERK信號(hào)通路能挽救自噬引起的線粒體和卵巢儲(chǔ)備功能受損。

3.3 自噬與OEC近年來(lái)的研究表明，自噬在子宮內(nèi)膜相關(guān)的生理和病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用，包括正常月經(jīng)周期、蛻膜化和血管重構(gòu)，EMs、子宮內(nèi)膜癌等子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病[30]。OEC是常見的EMs類型，研究自噬在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的作用有助于進(jìn)一步了解EMs的發(fā)病機(jī)制。

EMs的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡減弱和對(duì)凋亡信號(hào)不敏感可能參與了EMs的發(fā)生、發(fā)展。mTOR是自噬的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，且mTOR活性在異位子宮內(nèi)膜病灶中異常增高，故研究者提出mTOR可能通過自噬影響EMs患者的細(xì)胞凋亡。收集人正常子宮內(nèi)膜組織和OEC患者的異位子宮內(nèi)膜組織并分離其間質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在異位子宮內(nèi)膜組織及其分離的間質(zhì)細(xì)胞中LC3-Ⅱ和胱天蛋白酶3（caspase-3） 的表達(dá)量明顯降低；使用雷帕霉素（mTOR抑制劑）和3-MA（自噬抑制劑）處理異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但添加3-MA后雷帕霉素的促凋亡作用減弱[31]。該研究表明，OEC中mTOR活性異常升高，通過抑制自噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡能力減弱促進(jìn)該病的發(fā)生。

炎癥因子能夠促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、黏附和種植，與OEC的發(fā)生有著密切的關(guān)系。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）是一種誘導(dǎo)炎癥的蛋白因子，參與EMs的發(fā)生和發(fā)展，而自噬能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活。研究者分別收集正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（normal endometrial stromal cell，NESC）和子宮內(nèi)膜異位囊腫間質(zhì)細(xì)胞（endometriotic cyst stromal cell，ECSC），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NESC相比ECSC中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ的表達(dá)量明顯降低，而NLRP3和白細(xì)胞介素1b的表達(dá)量明顯升高；而若在術(shù)前使用地諾孕素治療，可以改善ECSC中自噬活性的降低以及NLRP3炎癥小體活性增加的現(xiàn)象[32]。該研究表明，孕激素可能通過誘導(dǎo)自噬降低OEC患者的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制OEC發(fā)展。

4 mTOR信號(hào)通路與自噬和排卵障礙性不孕癥

依據(jù)生理和病理?xiàng)l件的不同，PI3K/AKT/mTOR、絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK1/2、AMPK、肌醇需求酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）等多種經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵泡中自噬活性，而自噬參與卵泡發(fā)育、卵泡閉鎖和排卵等重要過程。在眾多的信號(hào)機(jī)制中，PI3K/AKT/mTOR是調(diào)節(jié)自噬最重要的機(jī)制[1]。mTOR是一個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是自噬的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，mTOR復(fù)合物通過磷酸化UNC-51樣激酶1（unc-51-like kinase 1，ULK1）干擾ULK1與AMPK的相互作用，從而抑制ULK1激活和自噬的起始[33]。

PCOS、POI/POF和OEC等疾病引起的內(nèi)分泌和代謝異常影響mTOR活性，從而改變卵巢中正常的自噬水平，自噬異?？蓪?dǎo)致排卵障礙性不孕癥的發(fā)生和發(fā)展。PCOS中趨化素和同型半胱氨酸異常升高，可通過抑制mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)自噬[17,19]。二甲雙胍通過影響PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路降低PCOS顆粒細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和自噬水平[20]。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)POF小鼠模型時(shí)，通過抑制mTOR改善卵巢儲(chǔ)備和生育能力[34]。hUCMSC通過調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路降低自噬水平，恢復(fù)順鉑誘導(dǎo)的POI大鼠的卵巢功能[26]。OEC中mTOR活性異常增高，通過抑制自噬減少細(xì)胞凋亡[31]。因此，mTOR信號(hào)通路通過自噬調(diào)節(jié)排卵障礙性不孕癥的發(fā)病機(jī)制可作為今后的重要研究方向。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

自噬參與原始卵泡數(shù)量的維持、卵泡發(fā)育和黃體功能等，適宜的自噬水平對(duì)于正常生殖過程至關(guān)重要。上述排卵障礙性不孕癥中，PCOS存在自噬活性異常升高現(xiàn)象，不同類型的POI/POF中自噬水平異常增加或減少，OEC中自噬活性處于抑制狀態(tài)，二甲雙胍、間充質(zhì)干細(xì)胞、褪黑素、孕激素等均參與調(diào)節(jié)自噬。自噬過程需要Beclin1、LC3、Atg7等多種因子的協(xié)同參與，它們的缺失或突變影響卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致卵母細(xì)胞數(shù)量減少、質(zhì)量變差；過度自噬引起的細(xì)胞凋亡和死亡異常同樣影響卵泡的發(fā)育和成熟。PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK1/2、AMPK、ERK等多種經(jīng)典信號(hào)通路參與顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的自噬調(diào)控，mTOR信號(hào)通路尤為重要。自噬關(guān)鍵基因及其抑制劑和誘導(dǎo)劑、疾病相關(guān)因子（趨化素、同型半胱氨酸、活性氧自由基、炎癥因子等）的研究可能為排卵障礙性不孕癥以及卵巢疾病的診療提供分子靶點(diǎn)和治療策略。