不同品種蝴蝶蘭耐冷性評價

馮小璐，孔艷娥，孫 音，姜楠南，房義福，李月苓，牛曉華

（1中國農業(yè)大學煙臺研究院，山東煙臺 264670；2商河縣國家農業(yè)科技園區(qū)服務中心，濟南 251600；3山東省林業(yè)科學研究院，濟南 250014；4濟南市林果技術推廣和產(chǎn)業(yè)服務中心，濟南 250099；5濟南文旅花木開發(fā)有限公司，濟南 250103）

0 引言

蘭科蝴蝶蘭屬植物蝴蝶蘭(Phalaenopsis amabilis)原產(chǎn)于熱帶亞洲至澳大利亞，已發(fā)現(xiàn)70多個原生種[1-2]，中國有12種。蝴蝶蘭為多年生附生草本，花型似蝶、花色豐富、花期長，有‘蘭花皇后’之稱[3]。但其最適生長溫度為18～28℃，在低于10℃的環(huán)境中易受冷害[4]。本研究采用逐步降溫的方式，通過測定16個蝴蝶蘭品種在不同低溫脅迫下相關各項生理指標的變化特征，研究不同品種蝴蝶蘭在低溫逆境下的生理差異，結合葉片形態(tài)特征，對不同品種蝴蝶蘭的耐冷性進行綜合評價，以期為蝴蝶蘭抗冷栽培抗冷品種選育及抗冷生理機理研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從濟南麒麟花卉有限公司購進16個蝴蝶蘭品種，分別為‘婚宴’、‘大辣椒’、‘花樣年華’、‘阿里山’、‘紅蝴蝶’、‘黑閃電’、‘滿天紅’、‘紅冠天’、‘一見鐘情’、‘蠟紅花’、‘冰山美人’、‘1372’、‘富樂之星’、‘黃金甲’、‘5064’、‘wk1753’，每個品種25株，植株生長期約400天，生長勢基本一致，健壯無病蟲害。

1.2 試驗方法

采用逐步降溫法進行抗冷試驗。置于晝夜溫度為25℃/22℃、相對濕度(RH)60%～70%、光照時間晝夜為12 h/12 h、白晝光強為12000 lx的人工氣候箱中培養(yǎng)1天，然后將晝夜溫度均調為18℃/15℃預處理3天。脅迫溫度逐級遞減，分別為10℃/3天、8℃/3天、6℃/3天，之后將培養(yǎng)箱溫度調為晝夜溫度18℃/15℃預恢復3天，最后轉入晝夜溫度為25℃/22℃的培養(yǎng)箱中恢復4天。試驗過程中，除處理溫度改變，其他條件均一致。在25℃/22℃培養(yǎng)1天時、10℃處理3天時、8℃處理3天時、6℃處理3天時、恢復7天時，各品種分別選取5株進行試驗，每株均選擇從上到下第一片成熟葉片進行葉綠素熒光參數(shù)及各項生理指標的測定，分別記為1、7、10、13、20天。

1.3 葉綠素熒光參數(shù)的測定

葉綠素熒光參數(shù)采用英國Hansatech公司的FM-2便攜式脈沖調制式熒光儀進行測定，每個品種測定5株，葉夾夾在葉片中部暗適應30 min后測定。

1.4 生理指標測定方法

相對電導率(REC)采用電導法[5]，采集5個葉片混樣測定，重復3次。

葉綠素含量測定采用95%乙醇提取法[5]，采集5個葉片混樣測定，重復3次。

稱取5個葉片的混樣0.5 g放入提前低溫預冷的研缽中，加入1 mL磷酸緩沖液(pH 7.8，0.05 mol/L)，冰浴研磨后再加入4 mL磷酸緩沖液，低溫(0～4℃)、12000 r/min離心20 min，取上清液冷藏保存(4℃)，用于測定過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)的含量。SOD活性測定采用NBT法[6]，CAT活性測定采用過氧化氫氧化法[6]，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[6]。3次重復。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 21軟件對原始數(shù)據(jù)進行標準化與聚類分析。用模糊隸屬函數(shù)法對恢復生長后各項指標的變化率進行耐冷性綜合評價[7]。采用灰色關聯(lián)法分析隸屬函數(shù)平均值與各指標變化率的關聯(lián)程度。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片形態(tài)的影響

6℃處理結束且恢復生長后‘，阿里山’的嫩葉出現(xiàn)黃化癥狀‘，花樣年華’僅有極少數(shù)嫩葉出現(xiàn)腐爛凍斑，‘婚宴’的部分嫩葉出現(xiàn)褪綠條紋‘，一見鐘情’整株葉片顏色變淺但無黃化、凍斑出現(xiàn)‘。黃金甲’整株葉片褪綠，接近一半的葉片褐化萎蔫‘；紅蝴蝶’大部分葉片出現(xiàn)大范圍褪綠、黃化，部分葉片出現(xiàn)面積較大凍斑‘；紅冠天’整株出現(xiàn)大面積腐爛凍斑，甚至死亡‘，wk1753’與‘冰山美人’整株萎蔫死亡（圖1D、H）。其余品種在6℃處理結束且恢復生長后，嫩葉黃化或褐化萎蔫，部分老葉出現(xiàn)凍斑。

圖1 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片形態(tài)的影響

2.2 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

PSⅡ反應中心存在可逆失活、不可逆轉的破壞或類囊體膜損傷都可導致Fo（初始熒光）數(shù)值上升[8]。從圖2可知，總體而言，隨著溫度的降低與處理時間的延長，不同蝴蝶蘭品種的Fo均升高。6℃處理結束后（13天）‘，黃金甲’、‘5064’的Fo升幅達到300.00%以上，而‘花樣年華’Fo升幅僅為8.22%，其余品種Fo升幅在10.00%～300.00%之間。說明在低溫脅迫下，不同蝴蝶蘭品種類囊體受損傷程度差異很大‘，黃金甲’的類囊體損傷最嚴重，而‘花樣年華’的類囊體損傷最輕。

圖2 低溫脅迫對16種蝴蝶蘭葉片F(xiàn)o的影響

Fm（最大熒光）數(shù)值與PSII反應中心的關閉程度有關，當植物受到環(huán)境脅迫時Fm數(shù)值下降，PSII反應中心的關閉[9]。如圖3所示，6℃處理結束時，各蝴蝶蘭品種的Fm值都顯著低于低溫處理前水平，‘富樂之星’、‘wk1753’Fm的降幅處于50.00%以下，其余品種Fm的降幅處于50.00%以上?；謴蜕L后，除‘一見鐘情’外，其余品種的Fm值均降低，說明這些品種的PSII反應中心都存在一定程度的關閉，降幅最小的為‘5064’，降幅為3.15%，降幅最大的為‘黑閃電’，降幅達到86.07%。

圖3 低溫脅迫對16種蝴蝶蘭葉片F(xiàn)m的影響

Fv/Fm（暗適應下PSII的最大光化學效率）數(shù)值越小，表明植物的光合機構受損傷程度越嚴重[10]。如圖4所示，恢復處理后，‘婚宴’、‘花樣年華’、‘阿里山’與低溫處理前的Fv/Fm數(shù)值差異不顯著，而其余品種皆與低溫處理前的數(shù)值差異顯著。

圖4 低溫脅迫對16種蝴蝶蘭葉片F(xiàn)v/Fm的影響

2.3 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片葉綠素含量的影響

在逆境脅迫下，植物葉片的葉綠素含量與抗逆性呈正比，植物的抗逆性越強，葉片葉綠素含量下降幅度越小[11]。由圖5可知，隨著處理溫度的降低與處理時間的延長，不同蝴蝶蘭品種總葉綠素含量的變化趨勢不同。低溫處理結束時，‘阿里山’、‘婚宴’、‘紅蝴蝶’、‘花樣年華’、‘蠟紅花’的葉綠素總含量與低溫處理前相比有所增加，其余品種的葉綠素總含量均有所下降?；謴蜕L后，除‘花樣年華’與‘婚宴’的葉綠素總含量與低溫處理前相比有所增加，其余品種皆降低，降幅最小的為‘一見鐘情’，降幅為10.74%，降幅最大的是‘wk1753’，達72.60%。

圖5 低溫脅迫對16種蝴蝶蘭葉片葉綠素含量的影響

2.4 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片相對電導率的影響

由圖6可知，恢復生長后，除‘婚宴’外，其余品種的相對電導率均顯著大于低溫處理前，增幅最大的為‘紅冠天’與‘大辣椒’，分別為85.96%、83.65%，表明其細胞膜系統(tǒng)經(jīng)過低溫處理后受到的損傷嚴重；增幅最小的為‘婚宴’、‘阿里山’、‘花樣年華’、‘1372’，分別為2.24%、4.61%、10.43%、14.73%，說明這些品種的細胞膜系統(tǒng)未收到嚴重損傷；‘一見鐘情’的增幅為16.23%，而6℃處理結束時增幅達96.96%，說明該品種雖然持續(xù)耐低溫能力不強，但恢復能力強。

圖6 低溫脅迫16種蝴蝶蘭葉片相對電導率的影響

2.5 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片丙二醛含量的影響

由表1可看出，恢復生長后，‘紅蝴蝶’、‘花樣年華’、‘滿天紅’、‘富樂之星’、‘婚宴’葉片中的MDA含量與低溫處理前相比均增大，且前3個品種增幅達80%以上，說明質膜損傷嚴重且無法恢復，耐冷性最差；其余品種均減小，其中降幅最小的為‘紅冠天’、‘黑閃電’，分別為1.84%、2.00%，降幅最大的為‘wk1753’，降幅為98.48%，其次是‘5064’，降幅為70.63%。MDA含量在一定范圍內隨抗寒能力減弱而升高，但當凍害表現(xiàn)嚴重時，含量會有所下降，說明‘wk1753’與‘5064’所受冷害已經(jīng)超過其承受范圍，而‘紅冠天’與‘黑閃電’的MDA含量變化不大，且抗氧化能力較強，細胞膜受傷害程度較輕。

表1 低溫脅迫對16種蝴蝶蘭葉片MDA含量的影響 μmol/g

2.6 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片SOD、CAT活性的影響

多數(shù)研究認為SOD、CAT等抗氧化酶可清除體內自由基，緩解低溫傷害，且耐冷性與抗氧化酶活性的提高呈正相關[12]。由圖7可知，恢復生長后，‘冰山美人’、‘一見鐘情’、‘wk1753’、‘1372’、‘黃金甲’、‘5064’、‘紅冠天’的SOD活性與低溫處理前相比降低，說明這些品種低溫傷害程度重，低溫傷害無法恢復；其余品種SOD活性增加，增幅最大的為‘大辣椒’，增幅為191.34%，其次是‘黑閃電’，為190.16%，說明‘大辣椒’、‘黑閃電’耐冷性強。如圖8所示，恢復生長后，除‘大辣椒’、‘花樣年華’、‘黑閃電’、‘紅冠天’外，其余品種的CAT活性與低溫處理前相比沒有顯著差異?！檠纭ⅰ灰婄娗椤?、‘黃金甲’、‘5064’、‘wk1753’葉片中CAT活性比低溫處理前小，其余品種均增大，增幅排名前5位的為‘大辣椒’、‘花樣年華’、‘黑閃電’、‘紅冠天’、‘富樂之星’，分別為659.46%、280.30%、223.73%、220.29%、127.27%。

圖6 16個蝴蝶蘭品種耐冷性的聚類結果

圖7 低溫脅迫對16種蝴蝶蘭葉片SOD活性的影響

圖8 低溫脅迫對16種蝴蝶蘭葉片CAT活性的影響

2.7 不同蝴蝶蘭品種的耐冷性綜合評價

采用隸屬函數(shù)值法對16個蝴蝶蘭品種各項生理指標在恢復生長后的變化率的隸屬函數(shù)值進行計算并求平均值，以平均隸屬函數(shù)值對各品種的耐低溫能力進行綜合評價，數(shù)值越大耐冷性越強[13]。16個蝴蝶蘭品種的耐低溫能力由強到弱為‘阿里山’＞‘花樣年華’＞‘婚宴’＞‘一見鐘情’＞‘富樂之星’＞‘1372’＞‘大辣椒’＞‘蠟紅花’＞‘黑閃電’＞‘滿天紅’＞‘5064’＞‘黃金甲’＞‘紅蝴蝶’＞‘紅冠天’＞‘wk1753’＞‘冰山美人’（表2）。

表2 不同蝴蝶蘭品種的耐冷性隸屬函數(shù)分析

續(xù)表2

以平均隸屬度為變量，用最長距離法進行層次聚類分析。由圖6可知，在歐式距離為5時，將16個蝴蝶蘭品種耐低溫能力分為3類，‘阿里山’、‘花樣年華’、‘婚宴’、‘一見鐘情’、‘富樂之星’、‘1372’為強耐低溫品種，‘大辣椒’、‘蠟紅花’、‘黑閃電’、‘滿天紅’、‘5064’為中耐低溫品種，‘黃金甲’、‘紅蝴蝶’、‘紅冠天’、‘wk1753’、‘冰山美人’為弱耐低溫品種。

采用灰色關聯(lián)法分析隸屬函數(shù)平均值與各指標變化率的關聯(lián)程度，關聯(lián)度越大，指標與耐冷性的關系越密切[14]。從表3可以看出，各指標變化率與耐冷性的關聯(lián)度值介于0～1之間，關聯(lián)度從大到小依次為葉綠素、Fm、REC、Fv/Fm、CAT、Fo、SOD、MDA。說明所有指標與蝴蝶蘭耐冷性都有密切關系。

表3 16個蝴蝶蘭品種耐冷性與各指標變化率的關聯(lián)度和關聯(lián)序

3 結論與討論

冷害脅迫下，植物葉綠體受到損傷，具體表現(xiàn)為葉綠素合成功能與葉綠體功能紊亂。劉學慶[15]、郝平安[9]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下蝴蝶蘭的葉綠素含量呈下降趨勢。也有研究表明，在低溫脅迫下葉綠素含量下降幅度與耐低溫能力呈負相關[11,16]。本試驗中，低溫處理結束，強耐低溫品種‘一見鐘情’與中耐低溫品種‘富樂之星’的葉綠素總含量降幅大于很多弱耐低溫品種，而恢復生長后降幅明顯減少，弱耐低溫品種‘蠟紅花’在低溫處理結束時葉綠素含量有所增加，但恢復生長后降幅達60.36%，所以用低溫脅迫過程中葉綠素含量指標對耐冷性進行評價有很多不確定性，選擇恢復后葉綠素含量降幅評價蝴蝶蘭耐冷性更符合表觀特征。

葉綠素熒光參數(shù)能夠反映植物的光合能力，在植物抗逆性研究中可間接反映光合系統(tǒng)的受損傷程度[8]。逆境脅迫時，F(xiàn)o數(shù)值上升，增加量與類囊體受損傷程度呈正相關；Fm數(shù)值下降，與PSII反應中心的關閉程度有關；Fv/Fm數(shù)值下降，下降幅度與光合機構受損傷程度呈正相關[8-10,17]。本試驗中，F(xiàn)o數(shù)值未隨脅迫溫度降低而增加，恢復處理后，除強耐低溫品種‘花樣年華’與中耐低溫品種‘大辣椒’外，其余品種的Fo數(shù)值均有不同幅度的增加；Fm未隨脅迫溫度降低而降低，但總體呈降低趨勢，恢復處理后，除強耐低溫品種‘一見鐘情’外，其余品種的Fm數(shù)值均有不同程度降低。Fv/Fm隨脅迫溫度降低而降低，恢復處理后，強耐低溫品種、中耐低溫品種與弱耐低溫品種‘黃金甲’的Fv/Fm值較6℃處理結束都有不同幅度的回升，蝴蝶蘭品種越耐冷，恢復處理后Fv/Fm數(shù)值的降幅越小，即耐冷品種的光合機構更容易恢復，與表觀特征具有高度一致性。所以葉綠素熒光參數(shù)可快速鑒定蝴蝶蘭耐冷性。

低溫脅迫首先表現(xiàn)在對生物膜系統(tǒng)的傷害。低溫脅迫后，一方面，葉片中生成自由基與活性氧，引起膜脂過氧化，產(chǎn)生對細胞具有毒害作用的MDA；另一方面，增大細胞膜透性和選擇性，細胞內電解質泄漏，導致REC上升[18]。本試驗中，各蝴蝶蘭品種MDA含量變化在低溫處理過程并不一致，與劉學慶[15]的研究結果相同，且只利用這一指標對耐冷性評價時，不是所有蝴蝶蘭品種的耐冷性都符合表觀性狀。在持續(xù)低溫處理過程中，不同蝴蝶蘭品種的相對電導率變化趨勢也不同，但用恢復生長后的變化率評價耐冷性與實際結果相近。

SOD、POD、CAT等抗氧化物酶能夠清除植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的活性氧與自由基。多數(shù)研究認為，蝴蝶蘭的過氧化酶活性會隨低溫脅迫呈現(xiàn)先上升后下降趨勢[15,19-20]，但本研究中不同蝴蝶蘭品種的SOD與CAT活性在低溫脅迫過程中變化趨勢并非先上升后下降，可能是不同品種對低溫脅迫的保護性應激反應不同，但總體而言，耐冷性強的品種過氧化酶活性的變化率要高于不耐冷品種，與楊芮[21]對紅掌進行低溫脅迫的試驗結果相同。本試驗中未測出蝴蝶蘭的POD活性，與高冬冬[20]、田丹青[14]在蝴蝶蘭耐冷性試驗中結果相同，但馬曉華[22]測出了POD活性，具體原因有待進一步研究。

本試驗中，除葉綠素含量、葉綠素熒光參數(shù)及相對電導率外，其他單一生理指標分析蝴蝶蘭耐冷性都與表型差別較大，且各指標變化趨勢不統(tǒng)一，可能是蝴蝶蘭品種多為雜交種，種源復雜，對低溫脅迫表現(xiàn)出的生理特性不同，也可能是本研究脅迫時間較長，MDA、SOD、CAT的合成受到不可逆?zhèn)λ?。所以，使用單一生理指標進行耐冷性評價具有不穩(wěn)定性，這種現(xiàn)象在紅掌[23]、石榴[24]、核桃[25]耐寒性試驗中也有報道。

本試驗對各指標變化率進行隸屬函數(shù)值分析，根據(jù)隸屬度平均值對耐冷性綜合評價，用聚類分析將16個蝴蝶蘭品種分級，結果表明，‘阿里山’、‘花樣年華’、‘婚宴’、‘一見鐘情’、‘富樂之星’、‘1372’為強耐低溫品種，‘大辣椒’、‘蠟紅花’、‘黑閃電’、‘滿天紅’、‘5064’為中耐低溫品種，‘黃金甲’、‘紅蝴蝶’、‘紅冠天’、‘wk1753’、‘冰山美人’為弱耐低溫品種。對蝴蝶蘭品種進行耐冷性分級，有利于根據(jù)耐冷性不同進行分區(qū)域、分類管理，在發(fā)揮品種優(yōu)勢的同時，能極大地降低能耗，削減生產(chǎn)栽培成本。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，革質蝴蝶蘭葉片生長速度慢，且一些品種在低溫脅迫過程中葉片未出現(xiàn)明顯的低溫傷害癥狀，恢復試驗后才完全顯現(xiàn)，表明低溫脅迫對葉片造成傷害顯現(xiàn)要滯后于生理生化指標的變化，所以明確鑒定蝴蝶蘭耐冷性的生理生化指標對快速鑒定蝴蝶蘭新品種的耐冷性具有重要意義。本試驗通過灰色關聯(lián)分析得出，葉綠素含量、Fm、REC、Fv/Fm、CAT、Fo、SOD、MDA都與蝴蝶蘭耐冷性關系密切，都可鑒定蝴蝶蘭耐冷性，而葉綠素含量及葉綠素熒光參數(shù)是最能簡便快速鑒定蝴蝶蘭耐冷性的指標，但這一結果是在對本試驗中8項生理指標進行測定分析出的，存在局限性，應運用更多的生理指標對蝴蝶蘭耐冷性進行研究。