干血點技術(shù)在抗菌藥物治療藥物監(jiān)測中的研究

陳 焰， 張 菁,*， 王 雨， 黃曉嵐， 劉笑芬

干血點（dried blood spot）技術(shù)是指通過微量采集末端毛細血管血（10～100 μL），經(jīng)特制卡片吸收形成干燥血點進行分析的技術(shù)，是生物分析領(lǐng)域中一種有效可行的采血技術(shù)。1963年Guthrie和Susi首次報道了在干紙片上收集微量血樣用于新生兒苯丙酮尿癥的篩查[1]，之后干血點技術(shù)便迅速發(fā)展，在治療藥物監(jiān)測（TDM）、臨床前研究、輔助疾病診斷等諸多領(lǐng)域廣泛應用。與傳統(tǒng)的靜脈采血方式相比，干血點技術(shù)憑借其采血量少、侵入性低、可操作性強、運輸便捷等顯著優(yōu)勢[2]，倍受關(guān)注和研究。隨著高效液相色譜、質(zhì)譜等精密分析技術(shù)，以及容量吸收微采樣裝置（VAMS）、干血點樣本全自動在線提取設(shè)備、干血點全點分析技術(shù)等新裝置和技術(shù)的開發(fā)[3]，干血點技術(shù)與生物分析的結(jié)合越來越顯示了其臨床推廣應用的前景。

TDM是實現(xiàn)個體化用藥、精準醫(yī)療的重要手段。目前，我國開展TDM的藥物種類繁多，包括精神類藥物、抗菌藥物、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑、心血管系統(tǒng)藥物等，約占臨床常用藥物的10%[4]。對一些治療指數(shù)低、治療窗窄、毒性大、個體差異大的藥物需進行TDM，如萬古霉素、多黏菌素、阿米卡星等[5]，其重要性和必要性被廣大醫(yī)師和藥學研究者所認識[6]。

干血點技術(shù)作為一種便捷可行的技術(shù)，在檢測條件有限、患者依從性差、儲存運輸不便情況下能夠有效代替靜脈采血進行TDM。然而，干血點技術(shù)在我國抗菌藥物乃至整個TDM領(lǐng)域的研究和應用較少。本文對干血點技術(shù)實施中所涉及的問題以及在抗菌藥物TDM中的應用進行綜述，以促進該項技術(shù)在TDM中應用。

1 干血點技術(shù)

1.1 樣本的采集

微量采血作為干血點技術(shù)優(yōu)勢之一，規(guī)范的血樣尤為重要，嚴格意義上的干血點是指全血斑點，并不包括干血漿斑點（dried plasma spot）及干血清斑點（dried serum spot），但鑒于均來源于全血，對此一并討論。干血點樣本的采集、運輸和儲存等過程，是結(jié)果差異的主要來源，是保證分析結(jié)果的準確性和成功轉(zhuǎn)化臨床的基礎(chǔ)[7]。

首先，選擇合適的紙片收集微量血樣是保證最終分析準確的前提，紙片的材質(zhì)、孔隙大小和厚度等性質(zhì)會影響微量血樣在紙片上的吸收特性和均勻性，對最終結(jié)果產(chǎn)生影響[2]。Whatman 903、Ahlstrom 226紙是FDA批準的兩類醫(yī)療耗材[8]，由100%純棉絨制造，無任何濕強劑添加，應用于眾多領(lǐng)域。Whatman FTA Elute卡片與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）聯(lián)用，廣泛應用于臨床研究中藥物小分子及其代謝物的定量分析[2]。對在抗菌藥物TDM中應用的干血點紙片進行篩選驗證和質(zhì)量控制，將是促進其更廣泛應用的有效手段。

傳統(tǒng)的干血點采用針刺足后跟、手指或腳趾收集血樣，其中血容量不足、紅細胞壓積效應、全血點中蛋白結(jié)合和基質(zhì)效應等問題對藥物濃度測定有影響。紅細胞壓積會影響全血在紙片的擴散均一性，是最受關(guān)注的影響因素[9]。避免或減少紅細胞壓積影響的技術(shù)和方法包括全點分析法、VAMS、容積式吸收紙盤（VAPD）、限定體積毛細管吸收的Capitainer-B設(shè)備、可折疊微流控HemaXis DB裝置、采用干血漿斑點替代全血、紅細胞壓積校正方法等[10]。

近年來，一些更高效便捷、新穎的設(shè)備用于干血點樣本采集，如新型的自動化和可穿戴的Fluispotter設(shè)備，可實現(xiàn)高精度的連續(xù)自動采樣[11]；熱誘導相分離（TIPS）和非溶劑誘導相分離（NIPS）相結(jié)合的平板型PAN膜，可有效分離100%血細胞制得干血漿點[12]，這些新采樣技術(shù)均能有效改善干血點應用所面臨的問題，從而推動其廣泛應用，但在實際應用時還需要進行充分的驗證以及考慮成本效益等因素。

1.2 干血點樣本保存、運輸

對于干血點樣品的干燥，一般情況下，建議紙片在室溫（20～25℃）下放置2～3 h，或可采用氮氣流吹干，具體時間需要隨紙片性質(zhì)和采血量而調(diào)整[2]。在應用中，有必要對干燥時間進行考察，以確定最佳干燥時間，保證樣品的均一性。干燥的紙片樣本，無論在室溫、低溫還是復雜的運輸條件下，其穩(wěn)定性優(yōu)于血液樣本，但穩(wěn)定性的時間還要考察及驗證。干血點技術(shù)為TDM樣本的保存運輸提供了保障，尤其對在液體基質(zhì)中不穩(wěn)定的藥物如黏菌素甲磺酸鹽具有重要優(yōu)勢[13]。此外，干燥處理后的樣本可有效降低其生物危害性，只需簡單的自封袋包裝便能便捷運輸。

1.3 樣本前處理和分析測定

干血點樣本的打孔和提取是前處理過程的重要部分，從紙片上截取合適大小的樣本和將待測物從紙片中充分提取出來可有效提高分析的準確性。一般認為小的點樣體積和大的打孔面積會帶來較好的精密度[14]，穿孔樣本的提取需要根據(jù)分析物的極性、穩(wěn)定性來選擇合適的提取溶劑（甲醇、乙腈或水混合物），選擇適當?shù)恼饟u或超聲可提高提取率[2]。也有研究在預處理前添加適宜的溶劑進行預浸漬，以提高提取效率[15]。LC-MS/MS是生物樣品中藥物定量測定的首選方法，其高靈敏度為干血點中微量樣本的分析提供了可靠的技術(shù)支持[16]。雖然高效液相色譜、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、免疫分析法等也有應用，但由于靈敏度、特異度或耗時問題，應用有限[2]。

近年來，在線提取和預處理方法已被開發(fā)應用到干血點樣本的前處理過程，免除了繁瑣的打孔和預處理步驟，如DBS-MS 500自動進樣器（CAMAG，瑞士）連接CTC PAL （Zwingen，瑞士）系統(tǒng)，可實現(xiàn)自動提取和預處理，與LC-MS/MS聯(lián)用可實現(xiàn)全自動檢測[17]；Gerstel （Mülheim an der Ruhr，德國）自動干血點樣本制備系統(tǒng)，是集提取、進樣、多位置蒸發(fā)站、高壓分配泵等模塊于一體的高效在線樣本處理系統(tǒng)[18]。

2 干血點在抗菌藥物TDM中的應用

2.1 β內(nèi)酰胺類

β內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素類、頭孢菌素類以及其他β內(nèi)酰胺類，其抗菌譜廣、毒性低、治療窗寬，在臨床廣泛應用，然而藥物不良反應也不容忽視，尤其在老年人、兒童以及重癥患者中應給予足夠重視，TDM是優(yōu)化治療、減少不良反應發(fā)生的重要措施[6]。干血點技術(shù)可有效改善分析物的穩(wěn)定性，例如進行常規(guī)TDM時，一般美羅培南從采血到分析超過4 h就需要干冰存儲，而干血點樣本中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示美羅培南在－20℃和6℃下至少7 d穩(wěn)定、23℃時48 h穩(wěn)定，顯示出了優(yōu)勢[19]。干血點樣本中厄他培南在不同溫度下運輸時至少1個月穩(wěn)定[20]。此外，在已報道采用LC-MS/MS測定干血點中β內(nèi)酰胺類抗生素還有頭孢曲松[21]、哌拉西林-他唑巴坦[22]等，同樣顯示比常規(guī)TDM樣本具有更好的穩(wěn)定性。

2.2 氨基糖苷類和多肽類

氨基糖苷類和多肽類藥物TDM在實際應用中相對最為廣泛，尤其在腎功能不全患者中已被列為常規(guī)檢測[5]，在治療過程中對氨基糖苷類藥物、萬古霉素和多黏菌素等多肽類抗菌藥物進行TDM在國內(nèi)外許多指南中均有提及[23]。Da等[24]采用Whatman-903紙片收集25 μL血漿樣本，采用超高效液相色譜（UPLC） -MS/MS同時測定干血漿斑點中的阿米卡星和肌酐濃度，實現(xiàn)了血藥濃度和腎功能的同時監(jiān)測，該方法用于藥動學模擬，并提出劑量建議，為有限資源下獲得阿米卡星個體化劑量提供了極大的幫助。Scribel等[16]對干血點中萬古霉素和肌酐同時進行測定，同樣采用Whatman-903紙片，但選用全血樣本，結(jié)果顯示患者血漿與干血點中萬古霉素濃度存在差異，即使經(jīng)過紅細胞壓積校正，濃度差異仍然很大，不能用于監(jiān)測萬古霉素的血藥濃度，而對肌酐則能獲得滿意的結(jié)果，因此基于干血點技術(shù)的萬古霉素血藥濃度檢測方法還有待研究。

Tsai等[13]使用LC-MS/MS測定干血點中黏菌素的主要成分（黏菌素A和黏菌素B），使用乙腈和0.15%甲酸水溶液（1∶1）作為提取液，線性分別為0.13～10.4 mg/L、 0.27～21.6 mg/L，通過對易水解的前藥黏菌素甲磺酸鹽（CMS）在干血點中的穩(wěn)定性考察，顯示室溫放置48 h后CMS水解少于4%，可有效降低因水解所產(chǎn)生的偏差，成為黏菌素定量的重要替代方法。Cangemi等[25]采用干血漿斑點樣本以及干燥樣點設(shè)備（DSSD）來定量黏菌素，避免了紅細胞壓積影響，為臨床應用提供了有效的支持。

2.4 抗結(jié)核類藥物

結(jié)核病是全球主要的公共衛(wèi)生問題之一，抗結(jié)核藥物的TDM對結(jié)核病的治療非常重要，然而有限的PK/PD數(shù)據(jù)及不發(fā)達地區(qū)的監(jiān)測條件不足，使得抗結(jié)核藥在治療中受到限制，尤其是兒童患者[28]。Martial等[28]對兒童患者的一線抗結(jié)核藥物（利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇）的干血點和常規(guī)靜脈采樣的測定結(jié)果進行分析和對比，利福平和吡嗪酰胺在兩種方法中具有良好的一致性，而乙胺丁醇顯示有較大差異。Lee等[29]采用LC-MS/MS對比分析靜脈和毛細血管干血點以及血漿中的異煙肼濃度，顯示三者之間存在偏差，但成比例，相關(guān)性良好，鑒于缺乏對紅細胞壓積影響的考察和足夠的樣本數(shù)量驗證，這項研究依然存在著局限性。

2.5 多種抗菌藥物同時檢測

開發(fā)多種抗菌藥物同時檢測的方法，在TDM中具有非常大的應用價值， Barco等[30]開發(fā)了采用VAMS設(shè)備聯(lián)用LC-MS/MS同時測定哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、利奈唑胺和頭孢他啶4種藥物的方法，并將這種新的采樣設(shè)備與傳統(tǒng)的干血點技術(shù)所檢測的結(jié)果進行對比，VAMS-LC-MS/MS方法對4種藥物均有良好的選擇性、精密度和重現(xiàn)性，可以在不受紅細胞壓積影響的情況下進行準確的定量，現(xiàn)已被應用于兒科患者的TDM。Ferrone等[31]建立了HPLC-PDA（二極管陣列檢測器）測定毛細血管干血點樣本和靜脈干血點樣本中利奈唑胺和環(huán)丙沙星濃度的方法，選用非纖維素Bond Elut DMS（干基質(zhì)點）樣品制備卡，可有效減少紅細胞壓積帶來的分析誤差，結(jié)果顯示兩者相關(guān)性良好，準確度、精密度等驗證結(jié)果良好，可作為常規(guī)監(jiān)測的重要工具。

2.6 其他抗菌藥物

達托霉素對革蘭陽性菌有快速殺菌作用，具有濃度依賴性，對其進行TDM有助于提高療效、改善預后， Baietto等[32]采用UPLC-PDA檢測方法定量血漿和干血漿斑點中達托霉素，分別用乙腈和乙酸乙酯∶乙酸∶丙酮∶水（50∶20∶20∶10）提取，兩種方法在0.781～200 mg/L校正范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，藥物濃度也具有顯著的相關(guān)性（P＜0.001，r2=0.919），方法驗證提示可適用于TDM。

磷霉素可有效治療由多藥耐藥細菌引起的嚴重感染，然而在危重癥患者中PK研究和TDM的缺乏給治療帶來了困難， Parker等[33]利用LCMS/MS對干血點中磷霉素進行定量，并且采用了VAMS設(shè)備進行樣本的收集，結(jié)果顯示準確度和精密度均在±15%偏差內(nèi)，線性為5～2 000 mg/L，但穩(wěn)定性和回收率的考察結(jié)果顯示其應用存在不足。

另外氟喹諾酮類藥物莫西沙星，在口服治療耐多藥結(jié)核病中具有良好前景應用。Vu 等[34]開發(fā)一種LC-MS/MS測定干血點中莫西沙星的方法，觀察紅細胞壓積和血容量的影響，并對靜脈和指尖干血點中的藥物濃度進行了對比，經(jīng)過充分驗證和對紅細胞壓積校正，可適用于TDM。

3 總結(jié)與展望

通過對近年來關(guān)于干血點及其在抗菌藥物TDM中的應用相關(guān)文獻的回顧發(fā)現(xiàn)，干血點技術(shù)的開展，以及新技術(shù)、儀器、方法相繼出現(xiàn)，使該項技術(shù)也成功用于多種抗菌藥物的TDM。其微量采血、優(yōu)良的適應性、便捷高效的樣本儲存運輸?shù)冉^對優(yōu)勢，使得干血點技術(shù)在有限的資源環(huán)境下表現(xiàn)出了巨大的應用潛力。盡管我國抗菌藥物TDM中干血點技術(shù)的應用有限，但不斷深入開展和研究，將會為個體化用藥拓展新的發(fā)展方向。