沙門氏菌檢測技術(shù)研究進展

李 丹

（山東醫(yī)藥技師學院，山東 泰安 271000）

沙門菌（Salmonella）最初是由美國細菌學家Salmon和Smith于1885年發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)報道 3 000多種血清型[1]。沙門氏菌對營養(yǎng)和環(huán)境要求不高，可在土壤、糞便、水中及肉、蛋、奶等食品中存活長達 2年之久。沙門氏菌污染后，大多數(shù)食品不會產(chǎn)生明顯變化，使得人和動物常在不經(jīng)意間感染沙門氏菌。調(diào)查顯示，在資源匱乏地區(qū)，因衛(wèi)生條件和飲用水資源差等原因，導致沙門氏菌發(fā)病率很高。攝入人體內(nèi)的細菌數(shù)量超過15~20 CFU即可導致易感人群感染，而高于105CFU則可能造成低敏人群感染。人在感染沙門氏菌初期，常表現(xiàn)為惡心、腹瀉和嘔吐等，如誤診或拖延處理，會增加其危險性，嚴重時死亡率可達10 %。據(jù)統(tǒng)計，我國每年由沙門氏菌污染導致食物中毒占 70 % ~ 80 %，全球每年有約9 000萬人感染沙門氏菌，其中死亡最高達 15.5萬人，且感染和死亡人數(shù)逐年增加。因此，沙門氏菌檢測成為食源性病原菌檢測的重中之重[2]。準確、高效、快速的檢測食品中的沙門氏菌是防控人感染沙門氏菌的有效手段之一?，F(xiàn)階段，沙門氏菌檢測技術(shù)主要分為培養(yǎng)法、免疫學檢驗和分子生物學檢測等傳統(tǒng)的檢驗技術(shù)，此外還有生物芯片、傳感器等新興的檢驗技術(shù)，為沙門氏菌的快速、準確和高通量檢測提供了多種選擇。

1 傳統(tǒng)的檢測技術(shù)

傳統(tǒng)的檢測方法主要包括生化鑒定、前增菌、血清分型、選擇性增菌及隔離和平板劃線法等，標準方法常以 ISO 6579-1—2017[3]和 GB 4789.4—2016[4]為參考。其優(yōu)點是技術(shù)成熟、結(jié)果準確性高，缺點是耗時較長，最少要 5 d才出結(jié)果。血清學鑒定作為檢驗沙門氏菌的基本方法之一，也可以使用尿液等體液代替。然而血清分型鑒定有一個突出缺點，即相同的沙門氏菌血清型，其抗原性可能有所不同，這是由于細菌細胞表面抗原會丟失或發(fā)生修飾，使得血清學檢測存在局限性。

2 免疫分析檢測技術(shù)

現(xiàn)有的沙門氏菌免疫學檢測方法主要有免疫熒光法、免疫磁珠分離方法、酶聯(lián)免疫吸附工藝（ELISA）、以同位素標記抗體（放射免疫試驗）為核心的方法，此外，還包括免疫擴散、免疫傳感器、免疫色譜技術(shù)和免疫印跡等以抗體為核心的檢測手段[5]。其中，ELISA方法主要包括雙抗體夾心ELISA、直接ELISA和間接ELISA檢測等，是目前最普遍用于檢測沙門菌的免疫學方法。Bang等人最初創(chuàng)建了鼠傷寒沙門氏菌的間接競爭 ELISA法[6]，朱春紅等曾使用間接 ELISA技術(shù)檢測腸炎沙門氏菌[7]，伍新燕等以單克隆抗體作為檢測抗體，用抗沙門氏菌多克隆抗體為捕獲抗體，從而形成了檢測沙門氏菌的雙抗體夾心ELISA方法，可同時檢測A、B、C、D、E五種沙門氏菌[8]。盡管 ELISA檢測效率有所提高，但不能避免檢測前的長時間增菌過程，同時可能出現(xiàn)由洗板不徹底等因素引起的假陽性現(xiàn)象。免疫熒光測定是將免疫學檢驗方法和熒光標記技術(shù)結(jié)合起來，具有靈敏度高、特異性強、檢測快速優(yōu)勢，但同時具有對結(jié)果判定主觀性強以及非特異性染色等特點。如 Pandey等以多粘菌素 B為黏結(jié)劑、以抗Vi抗體為捕集劑，以AP標記抗體為第二抗體，通過使用對硝基苯酚磷酸鹽作為顯示底物，對傷寒沙門氏菌進行特異性檢測，限量達到10 CFU/ml[9]。

3 分子生物學檢測方法

常用的沙門氏菌分子生物學檢測方法有聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、熒光定量 PCR、環(huán)介導等溫擴增、重組酶聚合酶擴增（RPA）和基因芯片及以測序技術(shù)等[10]。與傳統(tǒng)技術(shù)比較，分子生物學檢測具備高靈敏性、高度特異性、時間短、自動化水平高等特征，因此可以應用于沙門氏菌的快速測定。Malorny等人率先將PCR檢測技術(shù)運用于沙門氏菌中[11]，而Delibato等人建立一套Real-time PCR分析方法用來測定豬肉中的沙門氏菌，限量達到10 CFU/25 g，僅耗時 23 h[12]。LAMP技術(shù)是一項新的核酸擴增技術(shù)，簡便、快捷、特異性極強，Zendrini等利用短富集結(jié)合比色環(huán)介導等溫擴增和實時熒光定量PCR檢測禽肉中沙門氏菌和彎曲桿菌，富集時間比ISO規(guī)定的參考時間更短[13]。Alves等人首次采用了水解探針與計算機內(nèi)部放大控制技術(shù)相結(jié)合的多種實時熒光定性PCR檢驗技術(shù)，可同時檢測彎曲桿菌和沙門氏菌[14]。祝儒剛教授等對比多重 PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)基因芯片技術(shù)檢測是多重PCR檢測敏感度的十倍[15]。DNA微陣列和全基因組測序有助于展示沙門氏菌種類的詳細信息，LI等人構(gòu)建了一個可視化 DNA微陣列，并結(jié)合多重 PCR方法，檢測食物中沙門氏菌、志賀氏菌等[16]，檢測限為102 CFU/ml。而質(zhì)譜學方法、光譜學方法、光學表型分析方法等則是利用了沙門氏菌的表型特征，如多肽指紋、吸光度和成像特征。

4 新型檢測技術(shù)

生物傳感器（biosensor）具備了接受信號并變換和放大信號的能力，可以把對生物物質(zhì)敏感的程度通過生物傳感器變換為電信號，通過特定設(shè)備轉(zhuǎn)換后實現(xiàn)對生物物質(zhì)的檢測[17]。生命感應器包含酶傳感器（Enzyme sensor）、微生物傳感器（Microbial sensor）、免疫傳感器（Immunol sensor）、組織傳感器（Tissue sensor）和細胞器傳感器（Organelle sensor）等。目前，電化學生物傳感器以檢測快速、高特異性和敏感性以及可進行現(xiàn)場檢測等優(yōu)點受到極大關(guān)注。Oh等人結(jié)合了免疫傳感器技術(shù)和光學顯微成像系統(tǒng)（LMIS），以此快速檢測雞肉中的沙門氏菌，檢測限達到 103CFU/25 g[18]。Sheikhzadeh等人構(gòu)建了一個 3-吡咯羧基多聚物適配體的非標記阻抗傳感器，并應用于鼠傷寒沙門氏菌檢測[19]。LOPEZ-TELLEZ等基于 Hechtia argentea凝集素的阻抗生物傳感器檢測沙門氏菌，檢測底限達到5 CFU/ml[20]。Quintela等使用寡核苷酸-金納米顆粒通過光學生物傳感檢測食品與環(huán)境樣品，光學AuNP生物傳感平臺可以同時篩選19種沙門氏菌菌株，特異性為100 %[21]。

5 展望

隨著人們對食品安全的高度重視，對沙門氏菌關(guān)注度及其檢測技術(shù)要求也越來越高。傳統(tǒng)生化檢測、免疫學技術(shù)、分子生物學檢驗和新型檢查方法日益成熟，以生化培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)檢測技術(shù)依然是美國食品和藥品管理局和國際標準化組織等高度認可的檢測金標準，傳統(tǒng)技術(shù)成本和硬件條件要求低。各種新型檢測方式都是由兩種或兩種以上的方式組合在一起應用，以取長補短、優(yōu)勢互補。目前，因生產(chǎn)成本和技術(shù)要求較高或推廣力度不夠，許多新型技術(shù)還停留在實驗室和少數(shù)大型企業(yè)應用階段。相信隨著工藝與材料科學的飛速發(fā)展，會出現(xiàn)越來越多靈敏度高、特異性強并且生產(chǎn)成本更低廉、易于普及推廣的沙門氏菌的檢測技術(shù)，在不久的將來應用于養(yǎng)殖業(yè)和肉食品檢測中，更好地預防與控制沙門氏菌病。