南極磷蝦油對硫酸葡聚糖鈉鹽誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的抗氧化作用機(jī)制

周曉玲，相興偉*，周宇芳，鄭 斌，鄧尚貴，廖妙飛，聞?wù)?/p>

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021；3.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性、易復(fù)發(fā)且非特異性的炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD），病變區(qū)域主要發(fā)生在結(jié)腸至直腸的黏膜及黏膜下層[1]。UC患者主要病癥包括體質(zhì)量減輕、食欲下降、頻繁腹痛腹瀉、便血等狀況[2]。每年全球UC的發(fā)病率和患病率不斷上升，逐漸成為一項(xiàng)公共健康衛(wèi)生問題，嚴(yán)重影響患者的生活[3]。目前，對于UC的發(fā)病機(jī)制尚存在爭議，無法準(zhǔn)確定義。

研究表明降低機(jī)體過度氧化應(yīng)激對UC病理治療具有重要意義[4]。正常狀態(tài)下的機(jī)體可通過氧化/抗氧化系統(tǒng)維持體內(nèi)代謝過程中自由基生產(chǎn)與消除的動態(tài)平衡。腸道在機(jī)體消化吸收過程中可接觸到多種致氧化因子，如鐵離子、銅離子、血紅素、醛等，易造成氧化損傷[5]。隨著腸道炎癥程度加深和抗氧化系統(tǒng)被破壞，過度氧化應(yīng)激刺激有害氧自由基分子和過氧化物的合成釋放，導(dǎo)致腸道功能屏障保護(hù)系統(tǒng)損傷加劇[6]。

南極磷蝦（Euphausia superba）是南極海域的小型浮游生物，其因龐大的生物量和高營養(yǎng)價值而備受關(guān)注[7]。南極磷蝦油（Antarctic krill oil，AKO）是南極磷蝦資源開發(fā)利用的重要產(chǎn)品，由多種生物活性成分組成[8]。AKO可作為攝入n-3系多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的良好來源，其中30%～65%的n-3 PUFAs以與磷脂結(jié)合的形式存在，這有利于穿透腸壁進(jìn)行吸收[9]。此外，AKO還含有高濃度的蝦青素以及VA、VE等天然抗氧化成分，具有抗氧化特性[10]。研究證明AKO對人體無害、耐受性好、易被人體吸收[11]。近些年研究表明AKO還具有減輕心血管疾病[12]，調(diào)節(jié)高脂血癥[13]，預(yù)防和改善神經(jīng)認(rèn)知功能障礙[14]、抑郁[15]等多種功能，并可改善疾病過程中伴隨著的持續(xù)性氧化應(yīng)激狀態(tài)。Grimstad等報道AKO可改善UC大鼠炎癥狀態(tài)和減少血液中氧化標(biāo)記物水平，但對具體的抗氧化機(jī)制未進(jìn)行深入研究[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了AKO對硫酸葡聚糖鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性UC小鼠中的抗氧化機(jī)制，為AKO的開發(fā)和利用提供一些理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

5 周齡清潔級健康雄性BALB/c小鼠（體質(zhì)量（15±1）g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-006）購自浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院。小鼠普通鼠糧及玉米芯墊料購自蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動物飼料科技有限公司。

AKO由浙江省海洋開發(fā)研究院提取制備，4 ℃保存。AKO含約48.4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）磷脂、37.9%甘油三酯、13.9%游離脂肪酸、0.6%的膽固醇和1 002.4 μg/g蝦青素。不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）和PUFA分別占總脂肪酸的65.9%和32%。

DSS 美國MP Biomedicals公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 武漢博士德生物公司；內(nèi)毒素（lipopolysaccharides，LPS）ELISA檢測試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）檢測試劑盒 森貝伽生物科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix ExTaqTM熒光定量試劑盒 日本TaKaRa公司；核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體 美國Abcam公司；Keap1抗體 美國Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin抗體 美國Cell Signaling Technology公司；其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IXS 1型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Multiskan FC全自動酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī) 上海如湘儀器有限公司；MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；ABI ViiATM實(shí)時熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）儀（含F(xiàn)TC-3000實(shí)時檢測系統(tǒng)） 美國Applied Biosystems公司；ChemiScope series化學(xué)發(fā)光成像儀 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計

小鼠抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后在飼養(yǎng)環(huán)境（12 h/12 h光暗循環(huán)、溫度（22±2）℃、相對濕度（60±5）%）適應(yīng)5 d。實(shí)驗(yàn)期間提供基礎(chǔ)飼料和自由飲水。動物實(shí)驗(yàn)方案的制定與執(zhí)行均依照浙江海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理倫理委員會的批準(zhǔn)和指導(dǎo)開展（編號：2019003）。

將小鼠隨機(jī)分為4 組（n＝6）：對照組、DSS組、低劑量AKO組（L-AKO，0.25 g/（kgmb·d））和高劑量AKO組（H-AKO，0.5 g/（kgmb·d））。第1～21天，L-AKO組和H-AKO組小鼠每天分別給予0.25、0.50 g/kg AKO灌胃，對照組和DSS組小鼠給予等體積純水灌胃處理；第14～21天，除對照組外的其他實(shí)驗(yàn)小鼠每天給予含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5% DSS的飲用水以誘導(dǎo)產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性UC。實(shí)驗(yàn)期間記錄小鼠行動飲食狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對小鼠實(shí)行人道處死，收集小鼠盲腸至直腸區(qū)域腸道（即結(jié)腸組織），保存在-80 ℃用于后續(xù)分析。

1.3.2 H&E染色

用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定新鮮結(jié)腸組織，進(jìn)行一系列標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液梯度脫水，石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色、制片。使用帶有計算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)的顯微鏡下放大觀察，記錄結(jié)腸組織切片。

1.3.3 生化指標(biāo)檢測

準(zhǔn)確稱取部分結(jié)腸組織，按1∶9（m/V）的比例加入磷酸鹽緩沖液，在組織勻漿器中進(jìn)行均質(zhì)。使用高速冷凍離心機(jī)在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集離心后的上層液體保存，即結(jié)腸組織勻漿液樣品。使用ELISA檢測試劑盒分別測定TNF-α、IL-6、LPS的水平，GSH-Px、SOD活力和DAO水平使用對應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測SOD活力結(jié)果以蛋白質(zhì)量計，GSH-Px活力以其濃度計。

1.3.4 抗氧化相關(guān)基因相對表達(dá)量的測定

結(jié)腸組織在液氮中粉碎后與TRIzol試劑充分混合均勻，靜置分離以提取總RNA，并使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證質(zhì)量。將提取到的總RNA作為模板使用反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒合成cDNA。隨后，各組cDNA樣品利用TB GreenTMPremix ExTaqTM熒光定量試劑盒進(jìn)行處理后，再上樣進(jìn)行qPCR，利用實(shí)時檢測系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所需引物序列參考表1合成。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.5 蛋白相對表達(dá)量測定

取部分結(jié)腸組織使用液氮進(jìn)行粉碎，加RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞提取總蛋白。調(diào)整各提取樣品的蛋白總量為20 μg用于Western blot分析。所有樣品蛋白上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，隨后截取目標(biāo)蛋白區(qū)域置于已被甲醇活化的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）上印跡。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶稀釋液封閉PVDF膜后，依次在一抗和二抗稀釋液中進(jìn)行孵育。所用一抗分別為：Keap1、Nrf2、β-actin，均按1∶1 000比例稀釋。在化學(xué)發(fā)光成像儀下觀察記錄蛋白條帶，并使用ImageJ軟件計算目標(biāo)蛋白灰度。以β-actin為內(nèi)參蛋白，對目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)進(jìn)行歸一化計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Prism version 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的差異性分析，P＜0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AKO對UC小鼠一般行為情況的影響

在實(shí)驗(yàn)期間，僅喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食的對照組小鼠表現(xiàn)活躍、行動迅捷、毛發(fā)光潔。DSS藥物干預(yù)3 d后，小鼠出現(xiàn)進(jìn)食和飲水減少、行動遲緩、活力下降等現(xiàn)象，后期可觀察到腹瀉便血，體質(zhì)量迅速下降。攝入AKO后的小鼠在行動、毛發(fā)、飲食飲水、糞便方面均得到了改善，并在一定程度上緩減DSS造成的體質(zhì)量降低。

2.2 AKO對UC小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，對照組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞和隱窩結(jié)構(gòu)完整，無潰瘍和炎癥細(xì)胞浸潤。而DSS干預(yù)后腸道結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，部分腸壁增厚，隱窩結(jié)構(gòu)和杯狀細(xì)胞扭曲，腺體結(jié)構(gòu)異常，黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤。這些癥狀表明DSS誘導(dǎo)的小鼠UC造模成功。L-AKO和H-AKO處理均可顯著改善DSS造成的腸道損傷、組織潰爛，恢復(fù)基本結(jié)構(gòu)。H-AKO在維持結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整且不引起大量炎癥方面有更好的效果，提示AKO可以有助于UC小鼠的腸道恢復(fù)。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織H&E染色結(jié)果（100×）Fig.1 H&E staining results of colonic tissues of mice in each group (100 ×)

2.3 AKO對UC小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的影響

炎癥因子是體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要信號分子，它們的表達(dá)水平與UC的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[17]。通過ELISA檢測試劑盒測定炎癥因子IL-6和TNF-α在結(jié)腸組織的表達(dá)水平，用以評價機(jī)體的炎癥反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。與對照組相比，DSS組小鼠結(jié)腸中IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與DSS組相比，不同劑量AKO處理后均可以降低炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。其中，H-AKO處理組的IL-6、TNF-α表達(dá)水平更接近對照組（P＞0.05）。提示攝入AKO有利于降低體內(nèi)炎癥因子水平從而緩解UC小鼠炎癥反應(yīng)。

圖2 AKO對UC小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子IL-6（A）和TNF-α（B）水平的影響Fig.2 Effect of AKO on the levels of inflammatory factors IL-6 (A)and TNF-α (B) in colon tissues of UC mice

2.4 AKO對UC小鼠結(jié)腸通透性的影響

腸道組織是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，LPS和DAO的含量可以間接反映腸道屏障的損傷程度[18]。從圖3可看出，與對照組相比，DSS誘導(dǎo)后的小鼠結(jié)腸內(nèi)DAO和LPS水平顯著升高（P＜0.05），AKO處理能明顯降低DSS誘導(dǎo)后小鼠結(jié)腸內(nèi)的DAO和LPS的水平，其中H-AKO具有顯著性的效果（P＜0.05）。結(jié)果提示AKO可顯著改變小鼠的腸道通透性，維持腸道屏障完整和功能，抵御有害物質(zhì)侵襲機(jī)體。

圖3 AKO對UC小鼠結(jié)腸組織中DAO（A）和LPS（B）水平的影響Fig.3 Effect of AKO on the contents of intestinal permeability indicators DAO (A) and LPS (B) in colon tissues of UC mice

2.5 AKO對UC小鼠結(jié)腸中抗氧化酶活力的影響

GSH-Px和SOD的活力可以反映機(jī)體的抗氧化能力。如圖4所示，與對照組相比，DSS干預(yù)后可以顯著降低抗氧化酶GSH-Px、SOD在小鼠結(jié)腸內(nèi)的活力（P＜0.05），提示小鼠體內(nèi)抗氧化能力下降。與DSS組相比，不同劑量AKO處理后結(jié)腸組織內(nèi)GSH-Px和SOD活力出現(xiàn)了不同程度的提高。其中H-AKO處理與L-AKO處理結(jié)果相比更接近對照組GSH-Px和SOD活力水平。結(jié)果顯示攝入H-AKO有助于增強(qiáng)炎癥狀態(tài)下的結(jié)腸組織中相關(guān)抗氧化酶活力，改善UC小鼠體內(nèi)的抗氧化能力。

圖4 AKO對UC小鼠結(jié)腸組織中抗氧化酶GSH-Px（A）和SOD（B）活力的影響Fig.4 Effect of AKO on the activity of antioxidant enzymes GSH-Px (A)and SOD (B) in colon tissues of UC mice

2.6 AKO對UC小鼠結(jié)腸抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

為了進(jìn)一步探討AKO對UC小鼠體內(nèi)的抗氧化影響，利用qPCR對Nrf2/Keap1信號通路中控制的下游抗氧化酶基因表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖5所示，與對照組相比，DSS誘導(dǎo)后能顯著降低結(jié)腸組織中SOD、GSH-Px及Nrf2/Keap1通路中II期下游HO-1基因的表達(dá)水平（P＜0.05），顯著提高Nrf2基因的表達(dá)水平（P＜0.05）。H-AKO處理可以顯著增加DSS干預(yù)后的小鼠結(jié)腸中SOD、GSHPx、Nrf2、HO-1基因表達(dá)水平，并且接近正常水平（P＞0.05）。提示H-AKO處理可以提高UC小鼠體內(nèi)的相關(guān)抗氧化基因表達(dá)，以抵抗腸道氧化應(yīng)激損傷。

圖5 AKO對UC小鼠結(jié)腸組織抗氧化相關(guān)基因SOD（A）、GSH-Px（B）、Nrf2（C）、HO-1（D）表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of AKO on the expression levels of antioxidant genes SOD (A), GSH-Px (B), Nrf2 (C), and HO-1 (D) in colon tissues of UC mice

2.7 AKO對Nrf2/Keap1信號通路的影響

使用Western blot法檢測Nrf2/Keap1通路中的關(guān)鍵蛋白水平，用于進(jìn)一步評價AKO對UC小鼠體內(nèi)抗氧化機(jī)制的影響。在正常情況下，Keap1與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，當(dāng)機(jī)體受到某種刺激后，Keap1-Nrf2的結(jié)合不穩(wěn)定，Nrf2被釋放出來并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，這對于各種靶基因的反式激活必不可少[19]。如圖6所示，AKO處理組與DSS組、對照組相比結(jié)腸內(nèi)Nrf2表達(dá)水平增加，Keap1表達(dá)水平降低，并具有劑量依賴性（P＜0.05）。這些結(jié)果證明AKO可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1信號通路從而改善UC小鼠的氧化損傷。

圖6 AKO對UC小鼠結(jié)腸組織中Nrf2/Keap1信號通路的影響Fig.6 Effect of AKO on Nrf2/Keap1 signal pathway in colonic tissues of mice

3 討 論

UC是一種引起患者腹部疼痛的慢性腸道疾病，由于藥物治療通常會伴隨著嚴(yán)重的副作用且難以完全治愈，因此預(yù)防和尋找安全高效的治療方法成為人們關(guān)注的重點(diǎn)[20]。飲食是維持人體健康與生長的關(guān)鍵因素，通過飲食干預(yù)進(jìn)行預(yù)防和調(diào)節(jié)UC發(fā)展是行之可效的[21]。AKO富含多種活性物質(zhì)，是一種新型且受歡迎的食品補(bǔ)充劑。本實(shí)驗(yàn)通過AKO干預(yù)動物實(shí)驗(yàn)，研究其對DSS誘導(dǎo)造成UC小鼠氧化損傷的保護(hù)作用。

研究表明UC的發(fā)病機(jī)制與腸道炎癥、異常氧化應(yīng)激和腸道屏障損傷等因素密切相關(guān)[22]。在活動性腸道炎癥的發(fā)生過程中，先天反應(yīng)表現(xiàn)為炎癥黏膜中白細(xì)胞浸潤水平的升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷[23]。TNF-α和IL-6是體內(nèi)重要的炎癥調(diào)節(jié)因子。TNF-α可促進(jìn)其他炎癥因子產(chǎn)生，引起黏膜炎癥和腸道屏障損傷。IL-6與機(jī)體的炎癥、免疫應(yīng)答密切相關(guān)，過度表達(dá)導(dǎo)致免疫紊亂并加劇炎癥[24]。徐寶琪等對不同狀態(tài)下的UC患者進(jìn)行血清檢測，結(jié)果表明，與正常人相比，其體內(nèi)TNF-α和IL-6水平顯著性升高[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H-AKO處理可顯著降低DSS干預(yù)后結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α的表達(dá)水平（P＜0.05）。Kim等研究表明AKO脂質(zhì)體可以極大地抑制脂多糖誘導(dǎo)的RW254.6巨噬細(xì)胞促炎因子的產(chǎn)生[26]。n-3 PUFAs可通過多種方式降低炎癥反應(yīng)，包括減少促炎轉(zhuǎn)錄因子的分泌、影響膜脂肪酸組成從而維護(hù)細(xì)胞形態(tài)、激活過氧化物酶體增殖受體來提高抗氧化能力等[27]。這提示H-AKO處理可以有助于減少炎癥因子的分泌，改善UC小鼠結(jié)腸炎癥。

此外，炎癥因子通過NF-κB通路進(jìn)一步參與到DSS干預(yù)造成的腸道屏障損傷[28]。完整的結(jié)腸上皮屏障是維持正常腸道功能的基礎(chǔ)條件[29]。黃循銣等實(shí)驗(yàn)表明2.5% DSS定量灌胃誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠出現(xiàn)了結(jié)腸上皮組織潰爛、出血、腸道通透性增加等現(xiàn)象[30]。腸道屏障受損時，腸上皮細(xì)胞剝離溶解使DAO被釋放到管腔內(nèi)，LPS從死亡革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中釋放到腸道中進(jìn)入機(jī)體循環(huán)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇[31]。因此，腸道內(nèi)LPS和DAO水平可間接反映腸道屏障的損傷程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在DSS的炎性刺激環(huán)境下，腸道中的DAO和LPS水平升高，小鼠腸道屏障的完整性被破壞。與DSS組相比，H-AKO處理可改善結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)受損和組織潰爛，并降低LPS和DAO水平（P＜0.05）。AKO脂質(zhì)體在腸道屏障模型中表現(xiàn)出可以完全恢復(fù)炎癥受損的膜道屏障[26]。這提示H-AKO處理有助于維護(hù)UC小鼠正常的腸道屏障結(jié)構(gòu)與功能。

氧化應(yīng)激異常通常被認(rèn)為是UC進(jìn)展的關(guān)鍵。在UC患者中可觀察到中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過多活性氧，進(jìn)而攻擊破壞關(guān)鍵大分子，擾亂細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致組織出現(xiàn)氧化損傷，從而加速和延長炎癥反應(yīng)[32]。同時，氧化應(yīng)激對腸道屏障的功能和結(jié)構(gòu)完整性產(chǎn)生破壞作用，引發(fā)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)[33]。SOD是參與保護(hù)組織免受氧化損傷的重要抗氧化酶之一，可調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝產(chǎn)生超氧陰離子自由基，并聯(lián)合下游相關(guān)過氧化物酶對其進(jìn)行徹底清除。GSH-Px作為一種過氧化物分解酶，被認(rèn)為是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，可保護(hù)細(xì)胞免受活性氧造成的損傷[34]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，DSS組小鼠的SOD和GSH-Px活力均呈現(xiàn)明顯下降，提示DSS誘導(dǎo)造成了小鼠抗氧化防御系統(tǒng)功能失常；而通過AKO處理后可以逆轉(zhuǎn)該下降趨勢，這可能與KO的組分具有抗氧化作用相關(guān)。n-3 PUFAs因其結(jié)構(gòu)中的不飽合鍵具有一定抗氧化性[35]，蝦青素作為天然的強(qiáng)抗氧劑能高效清除體內(nèi)自由基[36]，謝丹在AKO抗氧化功能評價的研究中發(fā)現(xiàn)磷脂的存在亦可發(fā)揮次級抗氧化作用[37]。研究證實(shí)通過使用外源性抗氧化物和增加機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)基因的表達(dá)可以預(yù)防UC發(fā)生[4]。Grimstad等研究表明攝入富含高濃度的蝦青素和n-3 PUFAs的AKO可達(dá)到減輕自身炎癥的氧化應(yīng)激[16]。提示AKO可能通過發(fā)揮自身抗氧化能力和增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性的協(xié)同作用達(dá)到減少UC小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Nrf2是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡反應(yīng)的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，參與多種應(yīng)激反應(yīng)、誘導(dǎo)相關(guān)保護(hù)酶及相關(guān)蛋白如SOD、GSH-Px和HO-1[38]的轉(zhuǎn)錄。在Nrf2/Keap1信號通路中，Keap1通過泛素化、偶聯(lián)和降解等作用對Nrf2表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而影響Nrf2結(jié)合抗氧化元件來控制下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，起到抗氧化作用[19]。HO-1是主要抗氧化應(yīng)答者之一，是Nrf2/Keap1信號通路的關(guān)鍵靶基因[39]。Nrf2可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)，抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，起到抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，保護(hù)細(xì)胞[40]。Hye-Won等研究表明攝取n-3 PUFAs可以有效抵抗三硝基苯磺酸介導(dǎo)的野生型UC小鼠中炎癥和脂肪氧化，并抑制NF-κB通路和激活Nrf2通路中相關(guān)目標(biāo)基因的表達(dá)[41]。王蕾研究表明攝入不同比例的PUFAs可以通過調(diào)節(jié)Nrf2抗氧化通路來改善DSS誘導(dǎo)的UC小鼠體內(nèi)抗氧化能力[35]。Helal等研究表明AKO可在鐵超載大鼠體內(nèi)上調(diào)Nrf2的表達(dá)來降低氧化應(yīng)激[42]。Wen Chengfei等研究表明AKO通過Nrf2/Keap1信號通路減弱冠心病患者的氧化應(yīng)激[43]。這些研究表明攝入AKO可影響Nrf2信號通路，緩減機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究結(jié)果表明小鼠在受到DSS刺激后啟動了Nrf2抗氧化通路，但沒有改善氧化應(yīng)激狀態(tài)。給予AKO處理后可增加小鼠結(jié)腸內(nèi)的Nrf2及相關(guān)抗氧化酶的基因表達(dá)，增強(qiáng)了結(jié)腸組織抗氧化能力。Western blot分析結(jié)果表明AKO處理與對照組和DSS組相比，可以增加Nrf2蛋白表達(dá)，并抑制Keap1蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明攝入AKO可以通過激活Nrf2/Keap1信號通路影響UC小鼠體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)。

綜上所述，AKO在UC小鼠腸道中表現(xiàn)出顯著的抗氧化功能。AKO激活Nrf2/Keap1信號通路中蛋白和基因表達(dá)，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活力，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激，并降低炎癥反應(yīng)和維持腸道屏障功能。這些結(jié)果揭示了AKO在UC小鼠中的保護(hù)作用及可能抗氧化機(jī)制，可為AKO作為功能性食品或其他輔助材料提供參考，也為海洋資源的開發(fā)和利用提供啟發(fā)。