桑葚多糖對鎘源性肝損傷小鼠的保護作用

李變麗，陳華國，趙 超，龔小見，周 欣,*

（1.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550002；2.貴州師范大學喀斯特山地生態(tài)環(huán)境保護與資源利用協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽 550001；3.貴州師范大學 貴州省藥物質量控制及評價技術工程實驗室，貴州 貴陽 550001）

鎘是當今社會常見的環(huán)境和工業(yè)污染物，主要通過呼吸道、消化道或者皮膚被機體吸收，是一種毒性大、蓄積性強的重金屬毒物[1-2]。鎘對人體多種組織器官均有潛在的致癌性，1993年國際腫瘤研究機構將其列為I類致癌物[3]。當攝取量達到一定的程度后，可引起肝臟、腎臟等器官及心血管等系統(tǒng)的損傷。其中，鎘中毒導致的肝損傷主要表現(xiàn)為肝硬化、肝纖維化等，若不及時治療，進而可發(fā)展為肝癌[4]?！昂湘k大米事件”“河南鎘小麥事件”等重大公共衛(wèi)生事件的發(fā)生表明鎘污染帶來的食品安全問題會嚴重威脅人體健康[5]。研究發(fā)現(xiàn)，藥食兩用中藥安全性較高、依從性較強[6]，可以避免保肝藥產(chǎn)生的二次藥物性肝損傷。如小葉丁香（藥食同源類中藥）提取物丁香苷、紫丁香苷等可以有效降低小鼠肝臟內的鎘含量，對鎘源性肝損傷具有保護作用[7]。

桑葚又稱桑椹子、桑果等，是桑（Morus albaL.）的成熟果穗，富含多種維生素、葡萄糖、蛋白質、花青素、白藜蘆醇及礦物質和微量元素硒等多種成分，被稱為“民間圣果”“21世紀最佳保健果品”，屬于藥食兩用食品[8-10]?！侗静輦湟分杏涊d“桑葚甘涼，利五臟關節(jié)，安魂鎮(zhèn)神，聰耳明目，生津止渴，利水消腫”。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，桑葚具有補肝益腎、抗衰老、潤腸通便等作用[11]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖（Mori Fructuspolysaccharide，MFP）可通過發(fā)揮抗氧化作用，對酒精性肝損傷起到保護作用[9]。本研究以鎘源性肝損傷小鼠為模型，探討MFP對其肝損傷的保護作用，以期為開發(fā)保肝、護肝型保健食品和藥食同源類提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明小鼠80 只（體質重18～22 g），4 周齡，購于長沙市天勤生物技術有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0011，使用許可證號：SYXK（湘）2014-0011），按照國際實驗動物使用標準，在溫度（22.0±0.5）℃、相對濕度（55±5）%，適應性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

桑葚干品（批號140504）購自中國貴州省貴陽市同濟堂中藥飲片有限公司，由貴州省貴州師范大學藥物質量控制及評價技術工程實驗室陳華國教授鑒定為桑葚成熟果穗，根據(jù)前期課題組制備MFP的方法[9]，提取得到MFP（純度約為92%）。

谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（asparate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力檢測試劑盒 上海古朵生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XS105DU型十萬分之一分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Max Plus 384光吸收酶標儀 上海美谷分子儀器有限公司；MI-12光學顯微鏡 廣州明美生物有限公司；Animal-6008 GRT型血液分析儀 濟南格利特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥處理

急性肝損傷模型（1～7 d）：將小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分成空白組、模型組、陽性組、MFP組，每組10 只，除空白組腹腔注射等體積的生理鹽水外，其余3 組小鼠腹腔注射0.1 mL/（10 gmb·d）CdCl2溶液（CdCl2劑量為2 mg/（kgmb·d）），2 h后，均采用灌胃的方式進行干預，空白組與模型組給予等體積的生理鹽水，陽性組給予0.1 mL/（10 gmb·d）聯(lián)苯雙酯溶液（劑量為220 mg/（kgmb·d）），MFP組給予0.1 mL/（10 gmb·d）MFP溶液（劑量為50 mg/（kgmb·d）），連續(xù)給藥7 d后，禁食不禁水，12 h后，摘眼球取血，脫臼處死小鼠，迅速取小鼠肝臟并稱量質量。將肝臟分為兩部分，一部分浸泡于10%中性甲醛溶液中，低溫固定，用于肝臟病理切片觀察，另一部分放置于-80 ℃冰箱中，用于肝勻漿生化指標檢測[12-15]。

慢性肝損傷模型（1～28 d）：除造模給藥時間為28 d外，其余處理均與急性肝損傷模型相同。

1.3.2 動物行為及體征變化

每天觀察小鼠的活動、精神狀態(tài)、進食量、毛發(fā)及死亡量等情況，稱量并記錄小鼠體質量。

1.3.3 肝臟指數(shù)測定

將小鼠處死后，取完整的肝臟，稱質量，按下式計算肝臟指數(shù)[16]。

式中：mA為小鼠肝臟質量/g；mB為小鼠體質量/g。

1.3.4 血常規(guī)檢測

小鼠眼球取血，將約1 mL全血放置于2 mL乙二胺四乙酸抗凝管中，輕輕搖晃，混勻，靜置2 min，使用GRT型血液分析儀，測定血小板（platelet，PLT）、血小板壓積（plateletocrit，PCT）、平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）、紅細胞（red blood cell，RBC）、紅細胞壓積（hematocrit，HCT）、平均紅細胞體積（mean corpusular volume，MCV）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、紅細胞平均血紅蛋白（mean corpusular hemoglobin，MCH）、紅細胞平均血紅蛋白質量濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、白細胞（white blood cell，WBC）、淋巴細胞（lymphocyte，LYM）、單核細胞（monocyte，MON）水平。

1.3.5 肝勻漿生化指標檢測

取部分肝臟，按照1∶9（m/V）加入質量分數(shù)0.9%的生理鹽水，配成肝勻漿組織液[17]，勻漿后4 ℃下離心（3 000 r/min、10 min），取上清液，分別參考相應試劑盒說明書測定小鼠肝勻漿上清液中AST、ALT、ALP活力。

1.3.6 肝臟組織病理學觀察

參考文獻[18-19]進行肝臟組織病理學觀察。采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，封片，在光學顯微鏡下觀察肝臟病理學形態(tài)變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 26.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，以單因素方差分析進行多組間差異比較，采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）t檢驗，P＜0.05表示組間差異顯著；P＜0.01表示組間差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葚多糖對鎘致肝損傷小鼠行為活動及體征變化的影響

在適應性喂養(yǎng)期間，小鼠精神狀態(tài)好、行動自如、進食量正常、毛發(fā)有光澤、無死亡現(xiàn)象，腹腔注射CdCl2溶液后，在小鼠急性肝損傷模型中（1～7 d），模型組小鼠出現(xiàn)精神不佳、進食量減少等不良現(xiàn)象，陽性組與MFP組小鼠癥狀有明顯改善，小鼠體質量變化如圖1所示，空白組小鼠體質量整體呈上升趨勢，其余3 組小鼠的體質量總體呈下降趨勢，且與模型組相比，MFP組小鼠體質量下降的情況有所改善。在小鼠慢性肝損傷模型中（1～28 d），模型組小鼠出現(xiàn)精神萎靡不振、毛發(fā)粗糙、進食量減少、體質量下降、小鼠死亡等不良現(xiàn)象，陽性組和MFP組小鼠癥狀有明顯改善，小鼠體質量變化如圖2所示，空白組小鼠的體質量逐漸增加，其余3 組小鼠的體質量增加較緩慢且趨勢較為一致。

圖1 MFP對鎘致急性肝損傷小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of MFP on body mass in mice with acute liver injury induced by cadmium

圖2 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠體質量的影響Fig.2 Effect of MFP on body mass in mice with chronic liver injury caused by cadmium

2.2 桑葚多糖對鎘致肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

如圖3所示，在小鼠急性肝損傷模型中（1～7 d），與空白組相比，其余3 組小鼠的肝臟指數(shù)都不同程度的增加，其中MFP組小鼠肝臟指數(shù)趨近于空白組，各組之間沒有顯著性差異。如圖4所示，在小鼠慢性肝損傷模型中（1～28 d），與空白組比較，模型組小鼠的肝臟指數(shù)明顯增大了78.64%，具有極顯著性差異（P＜0.01），觀察到腹腔注射CdCl2溶液后，小鼠肝臟組織存在腫脹、硬化等現(xiàn)象，表明造模成功；同時，與模型組相比，MFP組的肝臟指數(shù)極顯著降低了21.20%（P＜0.01），表明MFP可減輕肝硬化等癥狀，對鎘源性肝損傷具有治療作用。

圖3 MFP對鎘致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.3 Effect of MFP on liver index of mice with acute liver injury induced by cadmium

圖4 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.4 Effect of MFP on liver index of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3 桑葚多糖對鎘致慢性肝損傷小鼠血常規(guī)的影響

2.3.1 血紅蛋白

如圖5所示，與空白組相比，模型組小鼠的HGB水平為（133.93±6.76）g/L，顯著降低了9.93%（P＜0.05），MCH為（14.78±0.48）pg/個，極顯著降低了12.28%（P＜0.01），MCHC為（329.67±10.60）g/L，降低了2.51%，說明小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，小鼠體內存在貧血現(xiàn)象。其中，與模型組相比，MFP組MCHC為（345.17±11.87）g/L，顯著升高了4.7%（P＜0.05），說明MFP對鎘源性肝損傷造成的貧血，具有一定的治療作用。

圖5 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠HGB（A）、MCH（B）、MCHC（C）水平的影響Fig.5 Effect of MFP on hemoglobin (A), mean corpusular hemoglobin(B) and mean corpusular hemoglobin concentration (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3.2 紅細胞

如圖6所示，與空白組相比，其他組小鼠的RBC沒有顯著變化，模型組小鼠的HCT為（40.35±3.40）%，顯著降低了8.09%（P＜0.05），MCV為（45.00±0.90）fL，極顯著降低了9.78%（P＜0.01），說明小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，造血功能異常，出現(xiàn)貧血現(xiàn)象。

圖6 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠RBC（A）、HCT（B）、MCV（C）水平的影響Fig.6 Effect of MFP on red blood cell (A), hematocrit (B) and mean corpusular volume (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3.3 血小板

如圖7所示，與空白組相比，其他組小鼠的PLT沒有顯著變化，模型組小鼠的MPV為（15.58±3.45）fL，極顯著升高了55.8%（P＜0.01），PCT為（0.90±0.26）%，極顯著升高了83.67%（P＜0.01），說明小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，凝血功能出現(xiàn)異常。

圖7 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠PLT（A）、MPV（B）、PCT（C）水平的影響Fig.7 Effect of MFP on platelet (A), mean platelet volume (B) and plateletocrit (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3.4 白細胞

如圖8所示，與空白組相比，其他組小鼠的LYM沒有顯著變化，模型組小鼠WBC為（6.88±2.08）×109個/L，極顯著升高了152.94%（P＜0.01），MON為（1.59±0.77）×109個/L，極顯著升高了169.49%（P＜0.01），提示小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，體內存在一定的炎癥反應。

圖8 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠WBC（A）、LYM（B）、MON（C）水平的影響Fig.8 Effect of MFP on white blood cell (A), lymphocyte (B) and monocyte (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.4 桑葚多糖對鎘致肝損傷小鼠肝勻漿生化指標的影響

如圖9所示，在小鼠急性肝損傷模型中（1～7 d），與空白組相比，模型組小鼠肝臟中AST、ALT、ALP活力均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），提示造模成功。與模型組小鼠AST活力（（25.90±7.66）U/L）比較，MFP組AST活力極顯著下降了33.32%（P＜0.01）；與模型組小鼠ALT活力（（35.95±2.30）U/L）比較，MFP組ALT活力極顯著下降了33.38%（P＜0.01）；與模型組小鼠ALP活力（（5.16±1.16）IU/L）比較，MFP組ALP活力極顯著下降了34.11%（P＜0.01），說明MFP可用于治療急性鎘源性肝損傷。如圖10所示，在小鼠慢性肝損傷模型中（1～28 d），與空白組相比，模型組小鼠肝臟中AST、ALT、ALP活力均極顯著升高（P＜0.01），提示造模成功。與模型組小鼠AST活力（（50.39±5.05）U/L）比較，MFP組AST活力極顯著下降了27.01%（P＜0.01）；與模型組小鼠ALT活力（（66.04±9.70）U/L）比較，MFP組ALT活力極顯著下降了33.46%（P＜0.01）；與模型組小鼠ALP活力（（5.76±0.49）IU/L）比較，MFP組ALP活力（（4.05±0.52））IU/L極顯著下降了29.69%（P＜0.01），說明MFP可用于治療鎘源性肝損傷。

圖9 MFP對鎘致急性肝損傷小鼠肝組織中AST（A）、ALT（B）、ALP（C）活力的影響Fig.9 Effect of MFP on activities of AST (A), ALT (B) and ALP (C) in liver tissue of mice with acute liver injury induced by cadmium

圖10 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠肝組織中AST（A）、ALT（B）、ALP（C）活力的影響Fig.10 Effect of MFP on activities of AST (A), ALT (B) and ALP (C)in liver tissue of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.5 桑葚多糖對鎘致肝損傷小鼠肝組織病理學形態(tài)的影響

如圖11所示，在小鼠急性肝損傷模型中（1～7 d），空白組小鼠肝細胞結構完整，排列整齊，細胞核大小正常、清晰可見；模型組小鼠肝細胞破裂、排列紊亂，細胞核有空泡現(xiàn)象；與模型組相比，陽性組和MFP組小鼠肝細胞損傷程度明顯減弱，肝細胞無明顯的破裂、腫脹現(xiàn)象。如圖12所示，在小鼠慢性肝損傷模型中（1～28 d），空白組小鼠肝細胞結構完整，細胞質無組織學異常，排列整齊；模型組小鼠肝細胞排列紊亂，有大量的炎性細胞浸潤，細胞核空泡現(xiàn)象嚴重，有出血現(xiàn)象，肝細胞損傷現(xiàn)象明顯；陽性組與MFP組小鼠肝細胞壞死、炎性細胞浸潤現(xiàn)象明顯減弱，說明MFP對于鎘源性肝損傷具有治療作用。

圖11 MFP對鎘致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響（×400）Fig.11 Effect of MFP on pathological changes of liver tissue in mice with acute liver injury induced by cadmium (× 400)

圖12 MFP對鎘致慢性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響（×400）Fig.12 Effect of MFP on pathological changes of liver tissue in mice with chronic liver injury induced by cadmium (× 400)

3 討 論

鎘是人體非必需元素，可在生物體內富集，通過食物鏈進入人體引起急、慢性中毒，導致肝、腎等器官損傷。AST、ALT、ALP是動物體內重要的轉氨酶，當肝臟發(fā)生損傷時，肝細胞結構受到一定破壞，AST、ALT、ALP活力升高，是診斷肝細胞受損的重要指標[20]，對于肝損傷的早期確診、預防、治療具有重要意義[21]。舒廣文等[22]研究發(fā)現(xiàn)，MFP可通過降低肝組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6含量，減弱核因子-κB p65蛋白的表達，從而抑制肝臟炎癥反應的發(fā)生，對急性肝損傷起到保護作用。Zhou Xin等[23]研究發(fā)現(xiàn)MFP可通過激活乙醇脫氫酶、清除自由基和抑制脂質過氧化等途徑發(fā)揮保肝作用。本實驗通過建立鎘源性肝損傷模型，探究MFP對鎘源性肝損傷的保護作用，研究結果表明，模型組小鼠的AST、ALT、ALP活力顯著升高，表明鎘對肝臟造成了一定程度的損傷，相比模型組，MFP組的這些指標均顯著性降低，表明MFP可以有效減輕鎘造成的肝損傷。

此外，從肝臟的組織病理學來看，與空白組相比，模型組小鼠的肝臟均出現(xiàn)肝細胞排列松散、胞漿內充滿小空泡、炎性細胞浸潤及肝細胞出血等現(xiàn)象，而MFP組的肝細胞病理現(xiàn)象得到明顯改善，再次表明MFP對于鎘源性肝損傷具有一定的治療作用。

血液循環(huán)系統(tǒng)是重金屬最為敏感的靶系統(tǒng)之一，重金屬可顯著抑制人類與動物的初次與二次免疫，是造成多種病變發(fā)生的原因之一[24-25]。血液系統(tǒng)中最能體現(xiàn)功能性的細胞是紅細胞、白細胞等。已有研究表明，隨著鉛、鎘等重金屬在機體內的蓄積，白細胞、血紅蛋白等細胞含量發(fā)生異常，最終導致機體能量代謝、物質合成等生理活動被抑制[26]。楊大千[27]的研究表明，氯化汞溶液可導致小鼠產(chǎn)生再生障礙性貧血。本實驗研究了MFP對鎘源性肝損傷小鼠血常規(guī)的影響，結果表明，與空白組相比，鎘顯著降低了模型組小鼠的HGB水平，造成機體貧血，采用傳統(tǒng)MCV、MCH、MCHC 3 項分類法，結合臨床表現(xiàn)，對小鼠貧血類型進行鑒別，判斷鎘源性肝損傷小鼠可能為單純小細胞性貧血[28]。相比模型組，MFP組的MCH、MCHC、HGB水平升高，可有效緩解并減輕貧血現(xiàn)象，其次，與空白組相比，模型組小鼠MPV、WBC水平極顯著增加，表明機體存在凝血功能異常、病毒感染等病理現(xiàn)象，而MFP組中這些指標逐漸下降。由此可見，MFP對進入血液中的鎘具有拮抗作用，在一定程度上可以緩解鎘對血液循環(huán)系統(tǒng)的損壞。結合前期的研究結果，推測MFP改善血液循環(huán)系統(tǒng)的機制是：1）MFP為生物抗氧化劑，可清除氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用[23]；2）MFP可增強機體的免疫功能，明顯緩解鎘引起的代償性反應，使白細胞數(shù)量逐漸降低[29-31]；3）MFP可有效螯合鎘等重金屬，形成穩(wěn)定的絡合物，促進鎘的排泄，使血液MCHC、PLT等逐漸恢復正常水平[32]。

綜上，重金屬鎘對肝臟具有強毒性，可以造成機體肝損傷及血液系統(tǒng)紊亂，MFP可以減少鎘在肝臟中的蓄積量及損害程度，對小鼠肝臟具有保護作用。