響應(yīng)面法優(yōu)化蒲桃葉總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性

孫曉波，張曉純，郭松，徐麗珍，張鵬

（廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西 來賓 546199）

蒲桃（Syzygium jambos）為桃金娘科蒲桃屬常綠喬木，又名香果、響鼓，原產(chǎn)于馬來西亞、中印半島，在我國福建、廣東、廣西、貴州、云南、海南等地區(qū)有少量栽培[1]。蒲桃作為一種可食用的熱帶果樹，藥用歷史悠久，其中蒲桃葉具有清熱解毒、消瘡之功效，主治口舌生瘡、瘡瘍、痘瘡等病癥[2-4]。目前，對蒲桃的研究應(yīng)用以海南蒲桃、水蒲桃、滇南蒲桃等少數(shù)蒲桃屬植物的果實、莖的化學(xué)成分為主，對蒲桃葉化學(xué)成分的研究較少[5-11]。蒲桃葉中含有的黃酮類成分具有一定的抗氧化作用[12-14]。

目前，黃酮類化合物較為常見的提取方法有乙醇回流提取法、酶提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等。乙醇加熱回流法所需溫度太高導(dǎo)致有效成分的結(jié)構(gòu)容易遭到破壞，酶提取法中酶的價格較高導(dǎo)致提取成本偏高，超聲波輔助提取法雖耗時短，但產(chǎn)熱效應(yīng)不強(qiáng)，很難達(dá)到所需的提取溫度，而微波輔助提取技術(shù)具有耗時短、加熱效率高、溶劑消耗量少、不產(chǎn)生噪音、適合于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的提取等優(yōu)點[15-16]。

本研究以蒲桃葉為原料，通過單因素試驗研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率、微波時間對微波輔助法提取蒲桃葉總黃酮工藝的影響，在此基礎(chǔ)上，以蒲桃葉中總黃酮提取率為評價指標(biāo)，利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，并驗證其抗氧化活性，為今后蒲桃葉的綜合利用以及蒲桃葉提取物作為天然食品抗氧化劑的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲桃葉：2020年10月采摘于廣西來賓市城區(qū)綠化樹木，干燥粉碎后過80目篩；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、30%過氧化氫、水楊酸、七水合硫酸亞鐵（均為分析純）：四川西隴科學(xué)股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：山東西亞化學(xué)服務(wù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：凱瑪生化有限公司；L-抗壞血酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-GF101-3BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LFP-800T型多功能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；FA2004型電子分析天平：上海舜宇橫平科學(xué)儀器有限公司；UV-9600型紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；XH-MC-1型微波合成儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；H-1850型臺式高速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SHZ-D（Ш）型循環(huán)水多用真空泵：鞏義市科瑞儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg/mL）分別置于10 mL具塞比色管中，加入70%乙醇溶液使溶液總體積為3.0 mL。搖勻后依次加入5% NaNO2溶液0.7mL，10% Al（NO3）3溶液0.7mL，10% NaOH溶液5.0 mL，最后以70%乙醇定容至刻度并搖勻靜置15 min。以空白試劑為參比溶液，測定510 nm波長處的吸光度。以蘆丁濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=11.414C+0.000 7，R2=0.999 8。表明在 0.01 mg/mL～0.06 mg/mL濃度范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

1.3.2 蒲桃葉總黃酮的測定

準(zhǔn)確稱取經(jīng)60℃恒溫干燥、粉碎、過80目篩處理過的蒲桃葉粉末1.00 g，經(jīng)微波處理后，抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶用無水乙醇定容后作為待測液備用。準(zhǔn)確移取一定體積待測液至10 mL比色管中，按方法1.3.1步驟顯色后測定其吸光度，平行測定3次，并按下列公式計算總黃酮提取率。

式中：C為測試液總黃酮濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；M為蒲桃葉粉末質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素試驗

分別對乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比[20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]、微波功率（300、400、500、600、700 W）、微波時間（2、4、6、8、10 min）進(jìn)行單因素試驗，研究各因素對蒲桃葉總黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，按照Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 蒲桃葉總黃酮體外抗氧化活性研究

以VC為陽性對照，用最優(yōu)提取條件下得到的總黃酮提取液來測定羥基自由基、DPPH自由基的清除率，清除率越大表明其抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.5.1 羥基自由基清除率的測定

參考李雪玲等[17]的方法，并在此基礎(chǔ)上稍作改動。準(zhǔn)確移取不同質(zhì)量濃度的蒲桃葉總黃酮溶液各1 mL于10 mL具塞比色管中，依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、10mmol/L水楊酸-乙醇溶液、6mmol/L過氧化氫溶液各1mL，將其置于37℃水浴反應(yīng)30min，于510nm波長處測定其吸光值A(chǔ)1；按上述方法，將過氧化氫溶液替換成等體積蒸餾水，測定其吸光值A(chǔ)2，作為提取液的本底吸光度；另取一支比色管，以不加蒲桃葉總黃酮溶液作為空白試驗對照，測定其吸光值A(chǔ)0。配制一系列相同濃度梯度的VC溶液作為對照，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。羥基自由基清除率計算公式如下。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率的測定

參考秦晶晶等[18]的方法并加以修改。準(zhǔn)確移取不同質(zhì)量濃度的蒲桃葉總黃酮溶液各2 mL于10 mL具塞比色管中，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，定容搖勻，測定其吸光值A(chǔ)1；按上述方法，不加DPPH溶液，測定提取液的本底吸光值A(chǔ)2；另取一支比色管加入0.2 mmol/L DPPH、無水乙醇溶液各2 mL，定容搖勻后測定其吸光值A(chǔ)0，作為空白試驗對照。配制一系列相同濃度梯度的VC溶液作為對照試驗，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次；采用Excel2010、Origin2018、Design-Expert 8.0.6進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對蒲桃葉總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對蒲桃葉總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蒲桃葉總黃酮提取率的影響Fig.1 The effects of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%時，蒲桃葉中總黃酮的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，總黃酮的提取率達(dá)到最大值，為4.76%。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步升高，總黃酮提取率出現(xiàn)下降趨勢。原因主要是在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時蒲桃葉中總黃酮未能完全溶解，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大，總黃酮的溶出更加完全，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時，由于溶劑極性的下降導(dǎo)致蒲桃葉中其他醇溶性非極性物質(zhì)溶出量增加，降低了總黃酮的溶解效果[19]。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

2.1.2 不同液料比對蒲桃葉總黃酮提取率的影響

液料比對蒲桃葉總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對蒲桃葉總黃酮提取率的影響Fig.2 The effects of liquid-material ratio on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves

由圖 2 可知，液料比為 20∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）時，蒲桃葉中總黃酮的提取率隨著液料比的增大而逐步增大，當(dāng)液料比達(dá)到50∶1（mL/g）時，總黃酮的提取率達(dá)到最大值，提取率為4.83%，繼續(xù)增大液料比，提取率稍有下降。這主要是由于當(dāng)液料比較低時，蒲桃葉與溶劑接觸不充分從而影響總黃酮的溶出，隨著液料比增加總黃酮溶出增大導(dǎo)致提取率升高。之后隨著液料比的繼續(xù)增大，樣品中的一些其它醇溶性物質(zhì)的溶解性也隨之增大，從而抑制了總黃酮的溶出[20]。故選擇液料比為 40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

2.1.3 微波功率對總黃酮提取率的影響

微波功率對蒲桃葉總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 微波功率對蒲桃葉總黃酮提取率的影響Fig.3 The effects of microwave power on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves

由圖3可知，微波功率在300W～400 W時，蒲桃葉中總黃酮提取率隨微波功率增大呈快速遞增趨勢；在400W～700W總黃酮提取率隨微波功率增大呈緩慢遞減趨勢。這可能是因為隨著微波功率的逐步增大，溶液溫度升高導(dǎo)致蒲桃葉細(xì)胞中總黃酮的溶出加快、提取率升高。但溫度過高會使總黃酮的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致總黃酮的提取率下降[21]。因此，選擇微波功率為300 W～500 W進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

2.1.4 微波時間對總黃酮提取率的影響

微波時間對蒲桃葉總黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4可知，微波時間在2 min～4 min時總黃酮提取率隨微波時間延長呈快速遞增趨勢；在4 min～10 min時總黃酮提取率隨微波時間延長呈遞減趨勢，變化幅度趨緩。可能是由于在一定時間范圍內(nèi)，蒲桃葉細(xì)胞所吸收微波能增多，細(xì)胞溫度隨之增高，總黃酮提取率也增高，但微波時間過長，可能會破壞蒲桃葉總黃酮的分子結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞中其他醇溶性物質(zhì)溶出增大，導(dǎo)致總黃酮的提取率下降[22]。因此，選擇微波時間為2、4、6 min進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

圖4 微波時間對蒲桃葉總黃酮提取率的影響Fig.4 The effects of microwave time on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

基于單因素試驗結(jié)果，建立四因素三水平響應(yīng)面試驗進(jìn)一步優(yōu)化總黃酮的提取工藝。試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

2.2.2 方差分析和二次多項回歸方程擬合

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析，得到響應(yīng)值與各因素的回歸方程Y=5.10-0.072A+0.037B+0.18C-0.070D-0.040AB-0.090AC+0.015AD+0.20BC+0.12BD-0.018CD-0.42A2-0.15B2-0.46C2-0.36D2，對二次多元回歸方程進(jìn)行方差分析，如表3所示。

由表3可知，模型的F值為87.99、P值＜0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P值為0.452 3，影響不顯著，說明非試驗因素對試驗結(jié)果影響不大；A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對蒲桃葉總黃酮提取率有極顯著影響，B（液料比）對蒲桃葉總黃酮提取率有顯著影響，C（微波功率）對蒲桃葉總黃酮提取率有極顯著影響，D（微波時間）對蒲桃葉總黃酮提取率有極顯著影響。二次項A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯著水平（P＜0.001）。各因素的影響順序依次為微波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波時間＞液料比。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 交互作用分析

各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of interactions factors on extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，各響應(yīng)面均開口向下，且曲面平滑，各響應(yīng)面上均存在最大響應(yīng)值。隨著各因素水平在一定范圍的增大，蒲桃葉總黃酮提取率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。綜合響應(yīng)面和等高線圖可知，微波功率方向等高線密度較其他方向密集，可見在設(shè)定的各因素水平范圍內(nèi)，微波功率的變化較其它因素對蒲桃葉總黃酮提取率影響更大。在交互作用的影響下，液料比和微波功率、液料比和微波時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率交互作用影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波時間、微波功率和微波時間交互影響不顯著，這與表3中交互項P值分析結(jié)果一致。

2.2.4 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面模型和結(jié)果分析，得到蒲桃葉總黃酮的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58.89%、液料比53.11∶1（mL/g）、微波功率 428.14 W、微波時間 3.89 min，此條件下蒲桃葉總黃酮提取率為5.14%。根據(jù)實際可操作性，將試驗條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、液料比 53∶1（mL/g）、微波功率 400 W、微波時間 3.9 min，在此條件下進(jìn)行3次驗證試驗，蒲桃葉中總黃酮的提取率均值為5.13%，該結(jié)果接近預(yù)測值，說明該模型可以用于擬合分析。

2.3 蒲桃葉總黃酮體外抗氧化能力

蒲桃葉總黃酮、VC對羥基自由基、DPPH自由基的清除率如圖6、圖7所示。

圖6 不同濃度梯度蒲桃葉總黃酮和VC對羥基自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radicals by total flavonoids from Syzygium jambos leaves and VCat different concentration gradients

圖7 不同濃度梯度蒲桃葉總黃酮和VC對DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of DPPH free radicals by total flavonoids from Syzygium jambos leaves and VCat different concentration gradients

由圖 6 可知，溶液濃度在 20 μg/mL～260 μg/mL 之間，蒲桃葉總黃酮、VC的抗氧化能力隨濃度增大呈現(xiàn)遞增趨勢，并在該區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，由此計算出蒲桃葉總黃酮對羥基自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50值）為120 μg/mL，VC對羥基自由基的 IC50值為190 μg/mL，蒲桃葉總黃酮對羥基自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

由圖7可知，在2 μg/mL～16 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蒲桃葉總黃酮、VC的抗氧化能力也逐漸增強(qiáng)，并在該區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，由此計算出蒲桃葉總黃酮對 DPPH 自由基的 IC50值為 9.19 μg/mL，VC對DPPH自由基的IC50值為8.35 μg/mL，蒲桃葉總黃酮對DPPH自由基的清除能力稍弱于VC。

3 結(jié)論

本文采用微波輔助工藝提取蒲桃葉總黃酮，基于單因素試驗，設(shè)計響應(yīng)面試驗，優(yōu)化得到最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù) 59%、液料比 53∶1（mL/g）、微波功率400 W、微波時間3.9 min。此條件下蒲桃葉總黃酮實際提取率為5.13%。提取的蒲桃葉總黃酮對羥基自由基、DPPH 自由基的 IC50值分別為 120、9.19 μg/mL，蒲桃葉總黃酮呈現(xiàn)良好的體外抗氧化性能，本研究為其今后作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品等領(lǐng)域提供數(shù)據(jù)支撐。