腹膜化纖散對腹膜透析相關性腹膜纖維化及TGF-β1/Smad2信號通路的影響*

薛 松 吳國慶 范 偉 李清萍 羅學文 皮持衡

目前全世界有8.5億人因各種原因患有腎臟疾病，據(jù)我國流行病學研究顯示，我國成年人群中慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)的患病率為10.8%[1]。腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是治療尿毒癥的腎臟替代療法之一，具有保護殘余腎功能、合并心血管并發(fā)癥少、花費較低等諸多優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，國際上PD病例數(shù)全球年增長率約為8%，已超過血液透析的年增長率[2]，近年來我國采用PD治療的尿毒癥患者占比迅速增長，占總透析人群的15%～20%，然而PD時間≥5年的比例僅占26.2%[3]。

長期PD治療可導致腹膜的形態(tài)學改變，包括間皮細胞的丟失、細胞外基質的積聚和纖維化的形成[4]，腹膜纖維化(Peritoneal fibrosis，PF)是導致腹膜功能衰竭的一個重要原因。對于如何抑制PD相關性腹膜纖維化的發(fā)生及發(fā)展，是目前臨床上迫切需要解決的問題之一。研究發(fā)現(xiàn)[5]，長期腹膜透析患者腹透液中轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)的含量明顯增高，并且TGF-β1可以刺激人腹膜間皮細胞大量產生細胞外基質，并通過其下游信號蛋白Smads的活化發(fā)揮作用，研究證實TGF-β1/Smads信號蛋白激活在高糖透析液及炎癥所致纖維化過程中起了重要作用[6]。本研究旨在探討腹膜化纖散對PD相關性腹膜纖維化進展的療效并初步探討其機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年1月—2020年12月在江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腎病科門診及就診住院患者共計90例。采用SPSS軟件產生90例受試者的隨機安排，將患者分為對照組和研究組。2組患者基線資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組腹膜透析患者基線資料比較 (例，

1.2 納入與排除標準納入標準：①慢性腎臟病5期行CAPD治療至少3個月者；②年齡18～70歲；③愿意接受本研究計劃并簽署知情同意書者。排除標準：①嚴重心肺功能不全者；②合并急性感染者，如：腹膜炎、皮下隧道炎、肺部感染等；③腹透充分性評估顯示KT/V<1.7或聯(lián)合血透治療者；④合并嚴重外傷及手術患者；⑤合并多臟器功能衰竭者；⑥曾行血液透析或腎移植治療后改行PD治療者；⑦已知對該研究用方中某種藥物組成成分過敏者。中止研究標準：①未按規(guī)定療程及方案治療者；②療程中患者自行加減影響療效的藥物；③療程中發(fā)生腹膜炎者；④治療過程中因病情變化轉為血透或腎移植者；⑤研究過程中病情惡化，出現(xiàn)嚴重的其他臟器并發(fā)癥，或出現(xiàn)嚴重的藥物不良反應和不良事件。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組①透析方案：使用低鈣腹膜透析液(廣州百特醫(yī)療用品有限公司，國藥準字 H44025216)進行CAPD 治療，每次2000 ml，每天4次，每次每袋透析液留腹4～6 h，第4次夜間留腹；②積極控制血壓、糾正貧血(補充鐵劑、葉酸及皮下注射促紅素)。

1.3.2 治療組在上述一般常規(guī)治療方案基礎上加用腹膜化纖散2.5 g口服3次/d。腹膜化纖散方劑組成如下：黃芪300 g，生大黃100 g，太子參300 g，三七100 g，丹參200 g，川芎100 g，淫羊藿300 g，六月雪200 g，白花蛇舌草200 g，陳皮100 g，法半夏100 g。由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房負責按上述比例配制組方，由制劑室負責打粉，由制劑室統(tǒng)一制成膠囊服用，每膠囊約含藥粉0.5 g。

1.3.3 治療時間2組均觀察60 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 臨床證候觀察根據(jù)2002 年《中藥新藥臨床研究指導原則》[7]提出的慢性腎衰竭辨證分型及計分標準。中醫(yī)辨證為脾腎氣(陽)虛、濕濁血瘀證。主癥:①倦怠乏力；②氣短懶言；③腰膝酸軟；④面色晦暗；⑤惡心嘔吐；⑥畏寒肢冷；⑦食少納呆；⑧腰痛。次癥:①腰部冷痛；②脘腹脹滿；③大便不實；④夜尿清長；⑤肌膚甲錯；⑥舌苔厚膩；⑦舌質紫暗或有瘀點瘀斑。按照中醫(yī)癥狀分級量化及評分標準評分，上述癥狀若無則計0分，舌脈具體描述不計分，所有相加計入總分。上述中醫(yī)辨證及證候評分需由2名主治級別或以上醫(yī)師同時確認。

1.4.2 中醫(yī)證候療效判定標準臨床痊愈：中醫(yī)臨床癥狀、體征消失或基本消失，證候積分減少大于95%；顯效：中醫(yī)臨床癥狀、體征明顯改善，證候積分減少大于70%；有效：中醫(yī)臨床癥狀、體征均有好轉，證候積分減少大于30%；無效：中醫(yī)臨床癥狀、體征均無明顯改善，甚或加重，證候積分減少不足30%。

1.4.3 腹膜功能檢測參照《腹膜透析標準操作規(guī)程》[8]完善相關腹膜功能檢測。腹膜平衡試驗(Peritoneal Equilibration Test，PET)，所有患者行改良PET(Modified PET)檢測方法。腹透凈超濾量(nUF)=4 h腹透液的引流量(ml)-腹透液灌入量(ml)。腹透充分性評估，留取24 h尿液、24 h透析液測定透析液尿素、肌酐及尿液尿素、肌酐，并計算殘腎GFR、尿素清除指數(shù)(KT/V)及總肌酐清除率(總Ccr)。用終點法測定腹透液尿素濃度(Durea)、血漿尿素濃度(Purea)、初始腹透液葡萄糖濃度(D0)、4h葡萄糖濃度(D4)，計算Durea/Pureah和D4/D0。

1.4.4 腹透液纖維化相關指標檢測患者透析液中TGF-β1、Smad2、VEGF、α-SMA相關指標。①標本采集：抽取受檢者夜間留腹腹透液10 ml，以1500 r/min離心5 min，取上清液1.5 ml保存于-20℃冰箱待測。②檢測方法：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測腹透液中TGF-β1、VEGF、α-SMA的含量，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，ELISA試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。以上所有臨床證候及觀察指標均在入組當天檢查，并于服藥后第60天復查。

2 結果

2.1 中醫(yī)證候評分2組治療后中醫(yī)證候積分均較治療前顯著降低(P均<0.05)，且治療組顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者中醫(yī)證候積分比較 (例，

2.2 中醫(yī)證候療效治療后，治療組中醫(yī)證候療效總有效率為75.56%，對照組中醫(yī)證候療效總有效率為46.67%，經統(tǒng)計學分析，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明治療組在改善腹膜透析患者中醫(yī)證候療效方面明顯優(yōu)于對照組。見表3。

表3 2組患者中醫(yī)證候療效比較 (例，%)

2.3 腹膜功能治療后，治療組患者超濾量明顯高于對照組(P<0.01)，Durea/Purea 明顯低于對照組(P<0.01)，D4/D0明顯高于對照組(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義，說明治療組患者腹膜功能改善明顯。見表4。

表4 2組患者腹膜功能比較 (例，

2.4 腹膜透析充分性治療后，治療組患者殘腎GFR高于對照組(P<0.01)，總Ccr明顯高于對照組(P<0.01)，KT/V明顯高于對照組(P<0.01)，說明治療組患者腹膜透析充分性指標改善明顯。見表5。

表5 2組患者腹膜功能比較 (例，

2.5 腹膜透析液中纖維化相關指標水平治療前2組TGF-β1、Smad2、VEGF、α-SMA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；治療后，治療組TGF-β1、Smad2、VEGF、α-SMA水平與對照組相比均明顯降低(P<0.01)，說明治療組患者腹膜纖維化較對照組有明顯改善。見表6。

表6 2組患者透析液中纖維化相關指標水平比較 (例，

3 討論

PD是目前臨床上終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)的重要治療方法之一，且PD患者人數(shù)正呈逐漸上升趨勢。然而PD治療過程中，由于腹膜長期與含糖非生理性的腹膜透析液持續(xù)接觸、以及腹膜炎的反復發(fā)生均可介導PF的發(fā)生，使患者出現(xiàn)腹膜超濾衰竭(Ultrafiltration failure，UFF)，嚴重影響PD治療效果，是退出PD的主要原因之一，也是制約PD發(fā)展的主要障礙，目前尚無有效的解決辦法[9]，給患者帶來痛苦，并增加了我國的醫(yī)療負擔。因此，找到一條可靠、有效的治療方案或藥物并應用于臨床，使得我們能夠更好地保護腹膜功能、延緩腹膜纖維化的進展成為當今醫(yī)學界研究的熱點之一。

研究發(fā)現(xiàn)，腹膜纖維化大鼠模型發(fā)現(xiàn)腹膜組織中TGF-β1/Smads表達的上調，表明TGF-β1/Smads是腹膜纖維化的關鍵因子[10]。TGF-β1是重要的介導細胞對組織損傷的強效致纖維化因子[11]。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的過度激活可導致炎癥細胞聚集及腹膜新血管生成等一系列促纖維化反應[12]。轉分化的間皮細胞表達是進行性下降的，轉分化而來的纖維樣細胞高表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，在一定的病理條件下，α-SMA可異化為肌成纖維細胞(MF)，MF具有比成纖維細胞更強大的增殖、分泌能力[13]，其分裂增生及分泌大量基質在腹膜纖維化過程中起重要作用，通過測定腹透液中的VEGF、α-SMA因子水平，能反映腹膜纖維化的程度[14]。

PD治療通過腹膜透析液在腹腔內的不斷交換而清除體內多余的水分和尿毒癥毒素，但是患者本虛標實的基本病機并沒有發(fā)生改變。腎為先天之本，脾為后天之本，生理狀態(tài)下先后天相互滋養(yǎng)，相互促進，共同對氣血化生起重要作用，氣血不足，則正氣虧虛，導致腎中精氣耗傷，不能溫煦、滋養(yǎng)機體。腹腔是PD治療中透析液的存放場所，腹膜是PD治療中溶質交換的重要媒介?！饵S帝內經》指出“脾主大腹”，提示脾臟在腹腔組織功能中起著重要作用。在PD治療過程中，患者腹腔每天都需要灌入大量的腹膜透析液，并且需要按照透析模式的要求長時間留腹，這樣就人為地造成水濕困脾的病理局面。長此以往，水濕困脾則不能運化水谷致水液內停，飲食物得不到很好地吸收；另一方面，脾氣虧虛則無以固攝，以致體內蛋白、氨基酸等精微物質大量流失。此外，脾主升清，脾為濕困導致升清降濁能力下降，體內尿毒癥毒素清除能力下降，遷延日久，又致體內氣血陰陽俱衰。這將導致PD患者透析效能減低、超濾減少，臨床癥狀及營養(yǎng)狀況改善不佳，最終出現(xiàn)UFF，導致患者退出PD。

在治療腹膜纖維化方面中藥有可能具有更多的潛在防治優(yōu)勢，近些年來，在防治纖維化及其相關疾病中多種中藥已被應用，許多中藥在抗纖維化治療中從多層面、多環(huán)節(jié)、多部位發(fā)揮作用，顯示出明顯的多靶點效應，臨床應用表現(xiàn)出良好的效果和作用[15，16]，但具體作用途徑及機制尚不完全明確。通過既往的經驗及研究我們創(chuàng)立了健脾益腎泄?jié)峤舛眷铕龅闹委煷蠓ǎ谂R床中運用腹膜化纖散來防治腹膜纖維化并取得了一定的療效。方中以黃芪、淫羊藿為君藥共奏益氣溫陽之功效；三七、丹參、太子參為臣藥，助君藥以益氣活血通絡之功；六月雪、白花蛇舌草、生大黃合用以清熱燥濕解毒，陳皮、法半夏健脾燥濕化痰，川芎走而不守加強行氣活血通絡之功效共為佐藥。

俞曼殊等[17]研究證實，黃芪能夠對抗高糖腹膜透析液誘導的大鼠PF，并可作用于TGF-β1/Smads信號通路，抑制β-catenin活化，阻抑人腹膜間皮細胞EMT過程。蓋李樂等[18]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮可降低自然衰老大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad3和α-SMA 的蛋白表達水平，并且可減少炎性細胞浸潤、減輕氧化應激對腎臟造成的損傷，從而改善腎臟纖維化。高利超等[19]發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1可通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路來調節(jié)糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化和炎癥細胞因子表達水平，從而起到對DN大鼠的腎臟保護作用。許小琪等[20]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠在體外發(fā)揮抑制成纖維細胞的過度增殖和轉分化的作用，可抑制TGF-β1/Smad信號通路，并減少VEGF的分泌起到抗纖維化的作用。張小鹿等[21]學者研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪具有拮抗含糖乳酸鹽透析液刺激人間皮細胞水通道蛋白高表達的作用，起到保護腹膜細胞組織結構，改善PD超濾功能的作用。值得一提的是，近年來由于大黃素具有抗纖維化作用被廣泛認識，大黃素在PD相關性腹膜纖維化的治療中也取得了一定的效果，多項研究證實大黃素有助于降低TGF-β1、α-SMA、E-cadherin相關纖維化指標，有助于延緩腹膜纖維化[22，23]。

本研究結果顯示，對于維持性腹膜透析患者，通過加用腹膜化纖散治療可有效改善辨證為脾腎氣(陽)虛、濕濁血瘀證PD患者臨床證候(P<0.05)?？娠@著改善PD患者腹膜超濾量，通過對比治療前后2組腹膜功能Durea/Pureah、D4/D0相關指標，提示對PD患者腹膜功能有明顯改善作用(P<0.01)。治療后，治療組患者殘腎GFR、總Ccr、KT/V明顯高于對照組(P<0.01)，提示治療組患者腹膜透析充分性指標改善明顯。其中治療組TGF-β1、Smad2、VEGF、α-SMA水平與對照組相比均明顯降低(P<0.01)，提示治療組患者腹膜纖維化較對照組有明顯改善。

綜上所述，中藥腹膜化纖散可顯著下調PD患者腹膜透析液中VEGF、α-SMA纖維化因子的表達，進而保護腹膜細胞組織結構，改善腹膜超濾功能，延緩高糖腹膜透析液誘導的腹膜纖維化，可能是通過抑制TGF-β1/Smad信號通路的表達水平有關。由于本研究條件有限，所納入樣本量小，觀察時間較短，其具體作用機制還有待進一步深入研究。