干旱脅迫下外源水楊酸對野生大豆生理特性的影響

張秀玲，孫 穎，孟 巖，牟文玉，祝巖巖，趙若銘，戴忠民，2，崔培培，2

（1.德州學院生命科學學院，山東德州253023；2.山東省高校生物技術(shù)與生物資源利用重點實驗室，山東德州253023）

干旱是制約植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之一，隨著全球氣候變暖，越來越多的地區(qū)受到了干旱災(zāi)害的嚴重影響［1］。我國約有52.5%的土地處于干旱半干旱地區(qū)，在半濕潤地區(qū)也經(jīng)常遭受旱災(zāi)的影響［2］。研究表明，在遭受干旱逆境脅迫時，植物葉片相對含水量降低，因水分虧缺新陳代謝發(fā)生紊亂［3］，植物體內(nèi)自由基形成與清除之間的平衡遭到破壞，自由基清除系統(tǒng)的能力降低，自由基在體內(nèi)積累，可使蛋白質(zhì)氧化，生物膜造成傷害，導致植物損傷甚至死亡［4］。干旱脅迫導致光合速率下降，作物減產(chǎn)［5］。

水楊酸（Salicylic acid，SA）是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的小分子酚類物質(zhì)，在植物的許多生理過程中起調(diào)控作用。大量的研究發(fā)現(xiàn)，SA不僅有誘導植物產(chǎn)生抗病性的作用，還能提高植物對干旱、低溫、病害、鹽害脅迫的抗性［1，6］。SA作為植物應(yīng)對脅迫反應(yīng)的重要信號分子，可參與呼吸代謝及抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，清除過量自由基，減輕逆境脅迫對植物的傷害［7-9］。

野生大豆（Glycinesoja）是栽培大豆的近緣種［10］，擁有極其寶貴的遺傳基因，具有耐鹽堿、抗寒、抗病等優(yōu)良性狀，在農(nóng)業(yè)育種上可利用野生大豆進一步培育優(yōu)良的大豆品種。目前，通過使用外源SA調(diào)控野生大豆抗旱性響應(yīng)的研究少見報道。本試驗用聚乙二醇（PEG-6000）溶液模擬干旱脅迫，研究不同濃度水楊酸噴施對干旱脅迫下野生大豆生理特性的變化規(guī)律，為深入研究野生大豆抗旱機制，充分開發(fā)利用野生大豆資源，強化植物抗旱性提供理論依據(jù)，為農(nóng)作物抗旱的化學調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生大豆種子2018年10月上旬采收于山東省德州市岔河岸邊，野生大豆單優(yōu)群落。土壤系黃河沖積物，年降雨量600~700 mm，地理位置為北緯36°24′~38°0′，東經(jīng)115°45′~117°24′，具顯著的大陸性氣候特征。年平均日照時數(shù)2 592 h，日照率為60%，太陽總輻射量為124.8 Kcal/cm2。

1.2 試驗設(shè)計

用0.1%HgCl2表面消毒10 min，無菌水沖洗干凈，然后將種子放置在鋪有兩層消毒濾紙的培養(yǎng)皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，保持濾紙濕潤。3 d后野生大豆胚根突破種皮，將野生大豆種植于石英砂：營養(yǎng)土為1：1的混合培養(yǎng)土中，溫室內(nèi)盆栽培養(yǎng)，光照時間為14 h，晝夜溫度25±1℃，濕度為70~80%，盆高27 cm，直徑為30 cm。每盆6株，待幼苗長至30 cm時，選取長勢相同的盆栽幼苗進行處理，期間正常肥水管理。

試驗共有處理：（1）CK（空白對照，無干旱脅迫且無水楊酸處理）；（2）0（10%PEG-6000溶液）；（3）0.5（10%PEG溶液+0.5 mmol/L SA）；（4）1（10%PEG溶液+1 mmol/L SA）；（5）1.5（10%PEG溶液+1.5 mmol/L SA）；（6）2（10%PEG溶液+2 mmol/L SA）6個處理，每個處理3個重復，隨機排列。試驗先進行10%PEG模擬干旱處理，每天9：00用微型噴霧器向野生大豆幼苗葉片噴施，噴至所有葉片滴液為度，每次每盆葉面均勻噴施10 mL，對照處理植株噴等量清水，連續(xù)處理4 d；第5 d起每2 d噴施水楊酸1次，共噴施2次，每次每盆用量10 mL。水楊酸處理結(jié)束后3 d采集同一部位真葉，測定生理生化指標［22］。

1.3 測定方法

用NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶（Su?peroxide dismutase，SOD）活性［11］；用愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性［12］；用紫外分光光度法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性［11］；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（Malondial?dehyde，MDA）和可溶性糖（Soluble sugar）含量［13］；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量［14］；采用考馬斯亮藍（G-250）法測定可溶性蛋白含量［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對干旱脅迫下野生大豆葉片抗氧化酶活性的影響

由圖1A可知，與對照相比，干旱脅迫對照的野生大豆，POD活性提高了51.72%，表明干旱脅迫誘導了POD活性上升。施加SA后，不同濃度的SA處理提高了POD活性，隨著SA濃度的增加，POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在施加SA為0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L濃度下，相比干旱脅迫對照處理，POD活性分別上升了12.16%、16.60%、28.86%、4.9%。這說明SA處理明顯提高了干旱脅迫下野生大豆的POD活性，1.5 mmol/LSA處理效果最顯著。

由圖1B所示，相比對照處理，干旱脅迫對照下的野生大豆CAT活性升高了50.7%。這說明干旱脅迫下，野生大豆CAT活性增強，隨著SA濃度的增加，CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。CAT活性均低于干旱脅迫對照處理，同時又都高于對照處理，比對照處理分別提高了4.69%、5.47%、35.94%、17.13%，1.5 mmol/L SA處理效果最明顯。

由圖1C可知，與對照相比，干旱脅迫對照下SOD活性升高了26.46%，隨SA濃度梯度增加SOD活性呈基本上升趨勢，在SA為0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L濃度處理下，均高于對照處理，與對照差異顯著，且均低于干旱脅迫對照，分別比對照處理提高 了10.08%、21.96%、21.99%、20.10%，其 中1.5 mmol/L的SA處理達到最大值，高于干旱脅迫對照，差異不顯著。

因此，外源SA能通過提高葉片POD活性增強抗氧化能力；通過提高野生大豆葉片SOD活性，增強清除超氧自由基能力；施加不同濃度SA對三種抗氧化酶活性影響不同，低濃度SA未能提高CAT活性，高濃度SA提高了CAT活性，增加了清除過氧化氫的能力，從而增強了野生大豆抗旱能力。

2.2 SA對干旱脅迫下野生大豆葉片丙二醛的影響

由圖1D可知，與對照處理相比，干旱脅迫對照野生大豆MDA含量增加了45.61%，顯著高于對照。噴施外源SA后，隨SA濃度增加，MDA含量呈先降后升的趨勢，在0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L SA濃度下，分別比干旱對照下降16.55%、39.95%、40.55%、19.93%，均顯著低于干旱脅迫對照下MDA含量。試驗結(jié)果顯示，在1.5 mmol/L SA濃度下MDA含量為最低。

圖1 SA對干旱脅迫下野生大豆抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of SA on antioxidant enzyme activity and malondialdehyde

2.3 S A對干旱脅迫下野生大豆?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量影響

由圖2A可知，相比對照，干旱脅迫對照野生大豆可溶性糖含量增加了11.32%。這說明干旱脅迫能促進野生大豆可溶性糖合成，以減輕干旱脅迫造成的傷害。在噴施外源SA情況下，隨SA濃度增加，可溶性糖含量基本呈現(xiàn)下降的趨勢。在0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L SA濃度下，分別比干旱脅迫對照下降6.78%、24.58%、33.90%、47.46%，其中1~2 mmol/L SA濃度處理，與對照和干旱脅迫對照，均差異顯著。原因可能是野生大豆產(chǎn)生了一些干旱脅迫誘導蛋白，蛋白的合成會消耗糖的含量，所以可溶性糖的含量降低。

圖2 SA對干旱脅迫下野生大豆?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of concentration of SA on content of osmotic adjustment

由圖2B可知，與對照處理相比，干旱脅迫對照野生大豆中脯氨酸含量提高了5.19%。隨SA濃度的增加，脯氨酸含量的變化趨勢是先上升后下降，當SA濃度為1.0 mmol/L時，比對照提高了8.41%，達到野生大豆中最大值。在除濃度為1.5、2.0 mmol/LSA處理之外的其它濃度處理中野生大豆中脯氨酸含量均高于干旱脅迫對照。因此，適宜濃度的SA可促進野生大豆中脯氨酸的積累。

由圖2C可知，相比對照處理，干旱脅迫對照可溶性蛋白含量增加了44.47%，與對照差異顯著，說明干旱脅迫促進了可溶性蛋白合成。隨著SA濃度的增加，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升的趨勢，在1.5、2.0 mmol/L SA濃度下，比對照提高了25.53%和28.53%，顯著高于對照和干旱對照。這表明適宜濃度的SA能明顯促進野生大豆中可溶性蛋白的合成。

3 討論與結(jié)論

3.1 外源SA處理對干旱脅迫下野生大豆抗氧化酶活性的影響

逆境影響植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，增加活性氧的產(chǎn)量，并進一步啟動膜脂脫脂作用，破壞膜結(jié)構(gòu)。SOD、CAT和POD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵保護酶［15］，在清除超氧自由基、防止膜質(zhì)過氧化、維護細胞膜正常代謝起到了重要作用［16］。SOD的主要功能是催化植物組織的歧化反應(yīng)，使超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生O2和H2O2［17］，產(chǎn)生的過氧化氫再由POD和CAT分解成水和氧氣。POD可清除胞漿和線粒體中的H2O2，CAT可以使H2O2發(fā)生歧化生成水和氧分子。本試驗中，干旱脅迫下野生大豆中SOD、POD、CAT活性均增加，隨著外源SA噴施濃度的增加，野生大豆SOD、POD、CAT活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與馬明莉［17］、覃泳智［18］、孫軍利［19］對逆境脅迫下酶活性變化的研究結(jié)果一致。外源SA能刺激和誘導抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，使其在逆境脅迫下處于較高的活性狀態(tài)，從而更有利于清除H2O2，維持細胞膜完整性和穩(wěn)定性，提高野生大豆抵御干旱的能力［19］。

3.2 外源SA處理對干旱脅迫下野生大豆丙二醛含量的影響

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低可用來表示植物細胞膜損傷程度［20-21］。本研究中，干旱脅迫下野生大豆葉片中MDA含量明顯增加，適量濃度SA處理顯著抑制了MDA的累積，以1.5 mmol/L效果最好，這與單長卷對小麥幼苗、可靜對研究黑果枸杞結(jié)果相似［22，16］。

3.3 外源S A處理對干旱脅迫下野生大豆?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱脅迫的一種重要方式，而可溶性蛋白和游離脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。植物細胞可溶性蛋白的積累有利于植物抵抗逆境傷害，維持植物細胞的滲透勢［16］。本試驗結(jié)果表明，干旱脅迫下可溶性蛋白含量增加，隨著噴施外源SA濃度的增加，蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)增加的趨勢，這與何舒懷對廣東潤楠的研究結(jié)果類似［23］；植物細胞脯氨酸含量的高低也是衡量植物抗逆性強弱的指標，含量越高，植物對逆境的滲透調(diào)節(jié)能力越強［24］。游離脯氨酸可清除活性氧、防止細胞脫水。野生大豆葉片中脯氨酸含量在干旱脅迫下高于對照，當SA濃度為1.0 mmol/L時，較單獨干旱處理提高8.41%，達到最大值。這說明野生大豆在干旱脅迫下能積累脯氨酸來改變細胞滲透勢，從而改變自身的滲透調(diào)節(jié)能力以提高抗旱能力。毛培利對刺槐的研究表明，可溶性糖在干旱脅迫初期是主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在脯氨酸脅迫后期起主要作用［25］?？扇苄蕴鞘呛铣善渌袡C溶質(zhì)的碳架和能量來源，可以增大細胞原生質(zhì)濃度，進而增強植物的抗旱性［26］。本試驗結(jié)果表明，干旱脅迫下可溶性糖含量升高，隨著外源SA濃度增加，可溶性糖含量下降，可能是由于蛋白的合成消耗糖的所致。

綜上所述，SA能夠通過提高SOD、POD活性和脯氨酸、可溶性蛋白的含量，增強野生大豆幼苗的抗氧化及抗?jié)B透脅迫能力，抑制膜脂過氧化，從而一定程度上緩解了干旱脅迫對野生大豆帶來的傷害。SA處理有一定的濃度效應(yīng)，以1.5 mmol/L的濃度對野生大豆的緩解效果最為明顯。