吡蟲啉對(duì)豌豆蚜GSTs和MFO酶活力的影響

郭耀霞，張廷偉，劉長仲，張育霞

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）屬半翅目蚜科，是在全世界范圍內(nèi)危害多種豆科作物和牧草的寡食性害蟲，也是我國西北地區(qū)苜蓿田中的優(yōu)勢(shì)害蟲[1-2]。該蟲在其年生活史當(dāng)中孤雌生殖，繁殖速度快，種群數(shù)量大，除直接取食為害外，還能傳播苜蓿花葉病毒、豌豆耳突花葉病毒等25種病毒[3-4]，為農(nóng)牧業(yè)害蟲主要防治對(duì)象[5-6]。長期以來，豌豆蚜的防治主要依賴化學(xué)殺蟲劑[7]，其中吡蟲啉作為一種取代有機(jī)磷及擬除蟲菊酯類的新煙堿類殺蟲劑，具有胃毒、觸殺、內(nèi)吸等作用[8-9]，以廣譜、高效、安全、低毒等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于刺吸式口器害蟲的防治[10]。由于吡蟲啉作為防治蚜蟲等害蟲的高效首選藥劑被大量使用[11]，豌豆蚜對(duì)吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑的解毒代謝問題已成為豆科植物害蟲防治中的首要任務(wù)。對(duì)于昆蟲的解毒代謝問題，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的研究，如Matsuura等[12]研究發(fā)現(xiàn)日本棉蚜（Aphis gossypii）對(duì)不同新煙堿類殺蟲劑解毒代謝能力不同；楊煥青等[13]研究發(fā)現(xiàn)棉蚜對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性的主要原因是解毒酶比活力提高；邱高輝等[14]研究了麥長管蚜（Sitobion avenae）對(duì)吡蟲啉的抗性發(fā)展中多功能氧化酶（MFO）和羧酸酯酶（CarEs）起重要作用；帥霞等[15]等研究表明桃蚜（Myzus persicae）抗性品系解毒酶活性高于敏感品系；汝陽等[16]研究報(bào)道二斑葉螨（Tetranychus urticae）對(duì)阿維菌素的代謝過程，其體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和MFO起主要作用。當(dāng)前有關(guān)吡蟲啉對(duì)豌豆蚜體內(nèi)GSTs和MFO 2種解毒酶活力變化規(guī)律的研究報(bào)道較少，鑒于豌豆蚜在西北地區(qū)豆科植物上為害的嚴(yán)重性，尤其是對(duì)苜蓿產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重威脅，本研究在測(cè)定吡蟲啉對(duì)豌豆蚜的致死中濃度（LC50）的基礎(chǔ)上，測(cè)定了吡蟲啉對(duì)豌豆蚜GSTs和MFO 2種解毒酶活力的影響，進(jìn)一步探索豌豆蚜對(duì)吡蟲啉的抗性機(jī)理，為豌豆蚜的抗藥性治理和新煙堿類殺蟲劑的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

供試害蟲為豌豆蚜，其敏感品系種群來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)田，期間未接觸過化學(xué)農(nóng)藥。豌豆蚜抗性品系是由敏感品系在室內(nèi)經(jīng)對(duì)吡蟲啉進(jìn)行噴霧死亡率達(dá)70%篩選而獲得?？剐赃x育時(shí)，每2周篩選1次，每2代進(jìn)行一次毒力測(cè)定，連續(xù)選育6代。

1.1.2 供試藥劑

98.5%吡蟲啉原藥，青島海利爾藥業(yè)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，上海譜振生物科技有限公司；牛血清蛋白，上海源聚生物科技有限公司；對(duì)硝基苯甲醚，上海康拓化工有限公司。

1.1.3 供試儀器

酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 室內(nèi)毒力測(cè)定

室內(nèi)毒力測(cè)定采用帶蟲浸葉法[15]。將吡蟲啉原藥用丙酮溶解后稀釋成6個(gè)濃度梯度，將帶有豌豆蚜的蠶豆葉片用紗布包裹葉柄后浸在不同濃度藥液中5 s，反面朝上放置在培養(yǎng)皿中，置于溫度24℃、光照16 h∶8 h（L∶D）的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。48 h后用毛筆輕輕觸動(dòng)蟲體檢查存活情況，以蟲體附肢完全不動(dòng)者記為死亡，統(tǒng)計(jì)死亡率。每個(gè)濃度處理30頭，重復(fù)3次，以蒸餾水處理作為空白對(duì)照。利用SPSS 19.0軟件中的Probit模塊中概率單位回歸法求出LC50，抗性倍數(shù)（RR）按式（1）計(jì)算。

1.3 酶源蛋白含量測(cè)定

酶源蛋白含量測(cè)定參照Bradford[17]的考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行。在酶標(biāo)板孔中加入200μL 0.002 5%考馬斯亮蘭G-250和50μL酶液，置于25℃下10 min，在595 nm處測(cè)OD值，根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)含量。

1.4 酶活力測(cè)定

1.4.1 酶液制備

取10頭無翅成蚜，于冰浴中加入1.5 mL 0.1 mol/L、pH 7.6的磷酸緩沖液（PBS）［含1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、1 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）、1 mmol/L苯基硫脲（PTU）、1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）及20%甘油］進(jìn)行勻漿，4℃下10 000 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液，冰浴備用。

1.4.2 GSTs活性測(cè)定

GSTs測(cè)定參照Habig等[18]的測(cè)定方法：分別將1.2 mmol/L CDNB、6 mmol/L GSH、酶液、0.1 mol/L pH 7.6 PBS各100、100、10、90μL加到酶標(biāo)板孔中，在340 nm處，以1 min為間隔，記錄15 min內(nèi)OD值的變化，每處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)。按式（2）、（3）計(jì)算GSTs活性。

式中：ΔOD340為每分鐘變化值；V為反應(yīng)總體積，μL；ε為消光系數(shù)，9.6 mL/(μmol·cm)；L為光程，1 cm；比活力，μmol/[min·mg(pro)]。

1.4.3 MFO活性測(cè)定

MFO活性測(cè)定參照Rose等[19]的測(cè)定方法，用無水乙醇配成的母液溶解對(duì)硝基苯甲醚，再用緩沖液稀釋成2 mmol/L。將稀釋后的緩沖液取100μL加到酶標(biāo)板中，再加入80μL酶液，于27℃溫育3 min后加入10μL NADPH開始反應(yīng)。在405 nm處，以1 min為間隔，記錄10 min內(nèi)OD值的變化。MFO活力以每分鐘每毫克組織蛋白催化產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚的含量表示。MFO比活力參照式（3）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蚜抗吡蟲啉品系的選育

由表1可以看出，紅綠色型豌豆蚜對(duì)吡蟲啉抗性發(fā)展較為緩慢，但隨著選育代數(shù)的增加，抗性倍數(shù)逐漸增加。經(jīng)連續(xù)6代藥劑篩選后，紅色型（RMP）、綠色型（GMP）豌豆蚜對(duì)吡蟲啉的敏感度（LC50）分別由選育前的0.149 2、0.136 3 mg/L提高為選育后的0.499 0、0.429 9 mg/L；抗性分別增長到3.34和3.15倍。2種色型相比，紅色型較綠色型抗性倍數(shù)增長更快。在抗性篩選過程中，毒力回歸方程的斜率有變小的趨勢(shì)，說明豌豆蚜群體中抗性個(gè)體不穩(wěn)定，群體發(fā)生了異質(zhì)性變化，抗性倍數(shù)有進(jìn)一步增加的潛力。

表1 豌豆蚜吡蟲啉抗性選育結(jié)果

2.2 吡蟲啉對(duì)2種色型豌豆蚜GSTs比活力的影響

用吡蟲啉處理后豌豆蚜體內(nèi)GSTs比活力變化見表2。2種色型豌豆蚜體內(nèi)GSTs比活力隨著選育世代的增加均有顯著升高。F0～F8各世代間解毒酶活性變化有顯著差異。GMP F8GSTs比活力達(dá)到26.68μmol/[min·mg(pro)]，較F0比活力增加15.10 μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的2.3倍。RMP F8GSTs比活力達(dá)到28.35μmol/[min·mg(pro)]，較F0代比活力增加18.51μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的2.88倍。通過吡蟲啉處理后，2種色型豌豆蚜體內(nèi)的GSTs比活力均有所增加，表明豌豆蚜對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性可能與GSTs比活力增強(qiáng)有關(guān)。

表2 豌豆蚜吡蟲啉抗性選育過程中GSTs活性變化

2.3 吡蟲啉對(duì)2種色型豌豆蚜MFO比活力的影響

經(jīng)吡蟲啉連續(xù)篩選后豌豆蚜MFO活性變化見表3。隨著篩選代數(shù)的增加，2種色型豌豆蚜F0～F8體內(nèi)的MFO比活力均有所提高，且有顯著差異。GMP豌豆蚜F8MFO比活力為1.72μmol/[min·mg(pro)]，與F0相比較比活力增加0.53μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的1.45倍；RMP F8MFO比活力達(dá)到2.05 μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的1.56倍，表明豌豆蚜對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性可能與MFO比活力增強(qiáng)有關(guān)。

表3 豌豆蚜吡蟲啉抗性選育過程中MFO活性變化

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，隨著選育代數(shù)的增加，紅綠色型豌豆蚜體內(nèi)的GSTs和MFO比活力和活性比均有所提高，且F2～F8代豌豆蚜的GSTs、MFO活性較F0差異顯著。此外，在豌豆蚜對(duì)吡蟲啉解毒代謝過程中，紅色型解毒酶比活力的升高較綠色型更顯著。然而，本試驗(yàn)僅測(cè)定了吡蟲啉對(duì)豌豆蚜體內(nèi)GSTs和MFO酶活性變化的影響，為深入了解吡蟲啉對(duì)豌豆蚜體內(nèi)解毒酶的活性影響，今后還需進(jìn)一步研究其體內(nèi)其他解毒酶的活性變化，為深層次揭示豌豆蚜對(duì)吡蟲啉解毒代謝發(fā)展規(guī)律提供科學(xué)佐證。