超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉、雞蛋、牛奶中9種食源性興奮劑類藥物殘留

劉學(xué)芝, 趙英蓮, 馬 躍, 董詩詩, 王 彬, 張 洋

(1. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心, 北京 100123; 2. 中檢科(北京)測試技術(shù)有限公司, 北京 100176)

β-受體激動(dòng)劑又稱生長促進(jìn)劑,俗稱“瘦肉精”,家畜飼養(yǎng)時(shí)加大劑量長期使用,則有降低脂肪、提高瘦肉率、促進(jìn)生長,改善肉質(zhì)的作用。蛋白同化制劑又稱同化激素,俗稱合成類固醇,同樣具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,肌肉增生的作用。為了提高胴體品質(zhì)、快速增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率,某些飼料生產(chǎn)商和家畜生產(chǎn)者違禁使用這些藥物成為食源性興奮劑類藥物殘留的來源。β-阻斷劑,常用于運(yùn)輸前給動(dòng)物注射以減輕動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng),防止因應(yīng)激反應(yīng)造成的肉品安全和質(zhì)量大幅下降,且往往在屠宰前數(shù)小時(shí)使用,更容易造成藥物殘留,危害人類健康。農(nóng)業(yè)部250號(hào)公告《食品動(dòng)物中禁止使用的藥物及其他化合物清單》包括β-興奮劑類。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)發(fā)布的《禁用清單國際標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定蛋白同化制劑、β-受體激動(dòng)劑和β-阻斷劑為禁止使用的興奮劑類藥物。建立多種興奮劑的檢測可滿足食品安全應(yīng)急事件處置的需要,以及防止重大賽事中運(yùn)動(dòng)員因食用被污染的食品而導(dǎo)致的興奮劑陽性事件的出現(xiàn)。

食源性興奮劑的檢測有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[1]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[2-7]、超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF/MS)[8,9],其中GC-MS/MS需要衍生,操作繁瑣;高分辨質(zhì)譜儀多用于篩查與確證;LC-MS/MS測定時(shí)樣品不用衍生化,靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確,在殘留分析中應(yīng)用最為廣泛。我國現(xiàn)行有效的食源性興奮劑檢測標(biāo)準(zhǔn)[10-12]多以LC-MS/MS為主,其中β-受體激動(dòng)劑和蛋白同化制劑的檢測可參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),β-阻斷劑尚無檢測標(biāo)準(zhǔn)。

本文擬采用EMR凈化、LC-MS/MS檢測方法同時(shí)測定β-受體激動(dòng)劑和阻斷劑、蛋白同化制劑三大類共9種食源性興奮劑,該方法操作簡便,溶劑用量少,適用于大批量樣品的快速測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司);離心機(jī)(德國Beckman公司);渦旋混合器(德國IKA公司)。

鹽酸甲氧酪胺、阿替洛爾、酒石酸美托洛爾、克侖丙羅、脫氫表雄酮(純度均大于97%,英國LGC公司);齊帕特羅、鹽酸普萘洛爾、昔美酸沙美特羅、美替諾龍、氘代克倫特羅、氘代萊克多巴胺、氘代沙丁胺醇、氘代睪酮、氘代甲睪酮(質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,曼哈格檢測技術(shù)有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純,美國Fish公司);甲酸(色譜純,北京百靈威科技有限公司);乙酸銨(色譜純,美國Sigma公司);冰醋酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶(含β-葡萄糖醛苷酸酶>100 000 units/mL,芳基硫酸酯酶<20 000 units/mL,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管(EMR-Lipid dSPE)(美國Agilent公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量(精確至0.01 mg)甲氧酪胺、阿替洛爾、美托洛爾、克侖丙羅、脫氫表雄酮于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇稀釋成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

分別準(zhǔn)確量取適量(精確至0.01 mL)齊帕特羅、普萘洛爾、沙美特羅、美替諾龍及上述標(biāo)準(zhǔn)中間液用甲醇稀釋成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

分別準(zhǔn)確量取適量(精確至0.01 mL)氘代克倫特羅、氘代萊克多巴胺、氘代沙丁胺醇、氘代睪酮、氘代甲睪酮用甲醇稀釋成10 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)中間液。

針對(duì)高強(qiáng)高性能鋼筋的施工和加工難題，鋼鐵企業(yè)和施工單位要不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，研究新工藝和新技術(shù)，探索開發(fā)低成本的高強(qiáng)度鋼筋的技術(shù)應(yīng)用路線，解決高強(qiáng)鋼筋在工程中的應(yīng)用難題，降低鋼筋加工成本，加快高強(qiáng)鋼筋的應(yīng)用推廣。

稱取6份空白基質(zhì)樣品,經(jīng)樣品前處理,作為空白基質(zhì)溶液分別向其中加入250 μg/L混合內(nèi)標(biāo)工作液10 μL,加入不同體積的100 μg/L的混合外標(biāo)工作液,配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

稱取試樣5.0 g(精確至0.01 g),放入50 mL離心管中,加入250 μg/L混合內(nèi)標(biāo)工作液40 μL,渦旋混勻,加入10 mL乙酸銨緩沖液(pH 5.2),加入50 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶,渦旋至混勻,于恒溫水浴振蕩器37 ℃振蕩酶解16 h。酶解后的試樣冷卻至室溫,10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH 9.5,加入12.0 mL乙腈渦旋提取2 min,加入鹽包(4 g無水硫酸鈉和1 g氯化鈉)渦旋2 min,鹽析分層,靜置10 min后8 000 r/min離心10 min。

移取6.0 mL乙腈提取上清液至EMR-Lipid凈化管中(預(yù)先用3 mL水活化),渦旋2 min, 5 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移全部上清液于15 mL離心管中,加入反萃鹽包(2 g無水硫酸鎂),渦旋2 min, 5 000 r/min離心5 min,取3.0 mL上清液于45 ℃氮吹至近干,加入1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(1∶9, v/v)定容,渦旋混勻,過0.22 μm濾膜待測。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:15 ℃;進(jìn)樣量:4 μL;流動(dòng)相:A(甲醇)-B(0.1%甲酸水溶液);梯度洗脫程序:0～2.5 min, 0%A～20%A; 2.5～7 min, 20%A～95%A; 7～8 min, 95%A～0%A; 8～9 min, 0%A。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源(ESI+);毛細(xì)管電壓:3.5 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L/h;碰撞氣流量:0.15 mL/min;多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。9種興奮劑的監(jiān)測離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能見表1, MRM圖見圖1。

表 1 9種興奮劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the nine stimulants

圖 1 9種興奮劑及5種內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖(2.0 μg/L)Fig. 1 MRM chromatograms of the nine stimulant drugs and five internal standards (2.0 μg/L)

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

β-受體激動(dòng)劑和蛋白同化制劑多為蛋白結(jié)合態(tài)存在,需要酸水解或酶解為游離態(tài)以利于有機(jī)溶劑的提取。實(shí)驗(yàn)采用β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶進(jìn)行酶解,考慮到除了蛋白同化制劑外,另外2類興奮劑化合物結(jié)構(gòu)中均含有氨基,故比較了酸性、中性和堿性提取條件對(duì)回收率的影響。由于豬肉、雞蛋、牛奶基質(zhì)中蛋白和脂肪含量較高,故提取液采用EMR進(jìn)行凈化。

以陰性豬肉基質(zhì)為例,實(shí)驗(yàn)比較了pH 5.2、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0條件下分別用乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑的效果。結(jié)果表明,乙酸乙酯提取液經(jīng)EMR凈化時(shí)乳化明顯,需較長時(shí)間高速離心破乳,且回收率差,其中齊帕特羅、克侖丙羅、普萘洛爾、美托洛爾的回收率在20%～50%之間,其他化合物均無回收。而乙腈提取并經(jīng)EMR凈化,回收率良好。比較了不同pH條件下乙腈提取的回收率和凈化效果,發(fā)現(xiàn)大部分化合物的回收率隨pH值增加而提高,齊帕特羅和阿替洛爾在pH 8.0以下回收率小于60%, pH 10.0時(shí)美托洛爾的回收率接近120%, pH對(duì)回收率的影響見圖2。脫氫異雄酮在pH 8.0以下,提取效率高,但樣品目標(biāo)峰處干擾嚴(yán)重,影響定量與定性,pH增大提取效率略有下降,但凈化效果明顯,可能是由于pH 8.0以下提取目標(biāo)物的同時(shí)提取了更多的雜質(zhì)。為保證凈化效果和滿足回收率要求,選擇在pH 9.5條件下提取,驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)凈化良好,回收率為65.2%～117.0%。綜上所述,最終選擇的提取條件和提取溶劑分別是pH 9.5和乙腈。

圖 2 pH條件對(duì)9種興奮劑回收率的影響Fig. 2 Effect of pH on recoveries of the nine stimulants

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件

比較了BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)兩種色譜柱,發(fā)現(xiàn)甲氧酪胺在BEH C18上保留較弱,基質(zhì)加標(biāo)樣品目標(biāo)峰處有明顯雜質(zhì)干擾峰,通過改變有機(jī)相種類和梯度無明顯變化,考慮到出峰時(shí)間太早不利于目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰的分離,故更換對(duì)極性化合物保留效果更好且耐純水相的HSS T3色譜柱。在相同梯度下分別以甲醇和乙腈作有機(jī)相,發(fā)現(xiàn)乙腈作有機(jī)相時(shí)大部分化合物響應(yīng)較甲醇作有機(jī)相時(shí)降低30%～50%,僅出峰較晚的兩個(gè)化合物響應(yīng)略有增加,故選用甲醇做流動(dòng)相。實(shí)際樣品測定中發(fā)現(xiàn),出峰較早的甲氧酪胺和阿替洛爾目標(biāo)峰處干擾較大,可能是由于凈化步驟去除的更多為非極性物質(zhì),而部分未能被水除去的極性較強(qiáng)的雜質(zhì)與出峰較早的目標(biāo)物共同流出,通過降低有機(jī)相初始比例來延長較早出峰的化合物保留時(shí)間,以保證不同基質(zhì)樣品中目標(biāo)峰與雜質(zhì)的很好分離。

在色譜柱和流動(dòng)相梯度確定后,進(jìn)一步比較了不同定容液對(duì)各化合物的影響,實(shí)驗(yàn)比較了0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水(1∶9, v/v)、乙腈-0.1%甲酸水(2∶8, v/v)、乙腈-0.1%甲酸水(3∶7, v/v)4種定容液,發(fā)現(xiàn)甲氧酪胺在乙腈-0.1%甲酸水(2∶8, v/v)、齊帕特羅、阿替洛爾在乙腈-0.1%甲酸水(3∶7, v/v)時(shí)峰形分叉為雙峰,說明隨著有機(jī)相比例增大,溶劑效應(yīng)明顯;而出峰較晚的脫氫異雄酮、美替諾龍隨著有機(jī)相比例增大響應(yīng)明顯提高,綜合考慮選用乙腈-0.1%甲酸水(1∶9, v/v)作為定容液。

2.2.2質(zhì)譜條件

通過優(yōu)化離子對(duì)和碰撞能,獲得MRM采集參數(shù),選擇響應(yīng)值較高的子離子作為定量離子,另一個(gè)作為定性離子。分段掃描以增大駐留時(shí)間提高響應(yīng),同時(shí)開啟質(zhì)譜和廢液切換閥,以降低儀器維護(hù)頻率。

表 2 9種食源性興奮劑類藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the nine food-borne stimulant drugs

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指色譜分離時(shí)基質(zhì)中存在的干擾物與待測目標(biāo)化合物共洗脫從而改變待測組分的離子化效率,引起待測組分信號(hào)提高或抑制。

圖 3 不同基質(zhì)中9種興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 3 Matrix effects of the nine stimulants in different matrices

選取陰性豬肉、雞蛋、牛奶作為基質(zhì),經(jīng)前處理后作為空白基質(zhì)溶液與溶劑分別配制相同濃度的點(diǎn)進(jìn)樣分析。以空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)峰面積相比增加或減少的百分比來衡量基質(zhì)效應(yīng),即ME=(基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)峰面積/溶劑標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)峰面積-1)×100%表示基質(zhì)效應(yīng),當(dāng)ME>0時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng),ME<0時(shí)為基質(zhì)抑制,ME的絕對(duì)值<20%認(rèn)為不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)各有不同,見圖3,豬肉中除齊帕特羅、阿替洛爾、脫氫異雄酮為基質(zhì)增強(qiáng)外,其他化合物均不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng);雞蛋中美替諾龍、沙美特羅存在基質(zhì)抑制效應(yīng),牛奶中甲氧酪胺和普萘洛爾分別存在明顯的基質(zhì)抑制和基質(zhì)增強(qiáng)。故實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,由于未能獲得所有化合物的內(nèi)標(biāo),結(jié)合回收率、化合物結(jié)構(gòu)和出峰時(shí)間選取合適的內(nèi)標(biāo)定量,獲得良好的結(jié)果。

2.4 檢出限、定量限與線性范圍

選取豬肉、雞蛋、牛奶3種空白基質(zhì),配制不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測,以3倍信噪比為檢出限,10倍信噪比為定量限,方法檢出限(LOD)為0.3～0.6 μg/kg,定量限(LOQ)為1.0～2.0 μg/kg;以待測物與相對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)(y),相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表2所示,3種基質(zhì)的基質(zhì)匹配曲線9種待測物在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99。

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

選取空白豬肉、雞蛋、牛奶樣品,分別添加低、中、高3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)進(jìn)行前處理,每個(gè)水平重復(fù)測定6次,基質(zhì)匹配曲線內(nèi)標(biāo)法定量,計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。如表3所示,9種目標(biāo)化合物的平均回收率為65.2%～117.0%, RSD為1.3%～14.4%。

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.6 實(shí)際樣品檢測

測定了市售的豬肉、雞蛋、牛奶樣品共計(jì)50批次,均未有檢出。

3 結(jié)論

建立了一種基于QuEChERS EMR Lipid凈化結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬肉、雞蛋、牛奶中9種興奮劑類藥物殘留的方法。該方法前處理簡單,溶劑用量少,對(duì)脂質(zhì)含量較高的動(dòng)物源性食品凈化效果好,適用于大批量樣品的快速、準(zhǔn)確測定,可為多種食源性興奮劑的快速檢測技術(shù)研究提供參考。