分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定農(nóng)產(chǎn)品中乙拌磷及其代謝物

孫 強, 李玉博, 溫廣月, 王偉民, 董茂鋒, 唐紅霞

(上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)藥安全評價研究中心, 上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所, 上海 201106)

乙拌磷是一種有機磷殺蟲劑,其化學名稱為O,O-二乙基-S-2-乙硫基乙基二硫代酸酯,可用于防治棉花、甜菜、馬鈴薯等苗期蚜蟲、葉螨及地下害蟲等,具有內(nèi)吸、觸殺、胃毒及熏蒸作用。乙拌磷純品是一種具有惡臭味的無色油狀物,易溶于正己烷、二氯甲烷、異丙醇和甲苯,難溶于水,在堿性條件下會分解失效。乙拌磷是一種高毒類有機磷農(nóng)藥,人體吸入、食入和經(jīng)皮吸收后會抑制膽堿酯酶活性,造成神經(jīng)功能紊亂,在環(huán)境中難降解,在生物體內(nèi)富集,干擾生物體的內(nèi)分泌機制,對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成巨大危害[1-3]。乙拌磷在動植物體內(nèi)均快速吸收和代謝,主要代謝產(chǎn)物是乙拌磷砜和乙拌磷亞砜,以及他們相應(yīng)的氧類似物及二乙基硫代磷酸酯[4],而且代謝物的降解速度均比乙拌磷緩慢[3]。我國規(guī)定劇毒、高毒農(nóng)藥不得用于防治衛(wèi)生害蟲,不得用于蔬菜、瓜果、茶葉、菌類、中草藥材的生產(chǎn)[5]。因此,為確保食品質(zhì)量安全,開發(fā)農(nóng)產(chǎn)品中乙拌磷及其代謝物的檢測方法至關(guān)重要。

目前《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]和農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議(JMPR)[7]將乙拌磷的殘留定義為乙拌磷、硫醇式-內(nèi)吸磷以及它們的亞砜化物和砜化物含量之和,以乙拌磷表示。文獻報道測定植物源食品中乙拌磷的方法包括氣相色譜法[8]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]。有報道采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]檢測人體血液和尿液中乙拌磷及其5個代謝物殘留量;氣相色譜法[3]測定種植咖啡土壤中乙拌磷的降解和遷移,檢測乙拌磷及其5個代謝物;雙氣相色譜-雙脈沖火焰光度法[10]檢測動物性食品中乙拌磷、乙拌磷亞砜、乙拌磷砜和內(nèi)吸磷-S;固相萃取柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]檢測當歸中乙拌磷、乙拌磷砜和乙拌磷亞砜。但是鮮有檢測植物源性食品中乙拌磷及其5個代謝物的相關(guān)報道。因此,為保證植物源農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,本研究擬采用UHPLC-MS/MS建立靈敏度高、簡便快速的定量分析乙拌磷及其代謝物的殘留方法。

目前農(nóng)藥殘留前處理方法主要有固相萃取法、分散液液萃取法和分散固相萃取法等[12-14]。固相萃取法操作步驟復(fù)雜且時間長,消耗溶劑量大,商品化固相萃取小柱種類多,由于化合物結(jié)構(gòu)特點不同,難以選擇一種合適的固相萃取小柱;分散液液萃取法需要消耗大量的有機溶劑且當化合物存在干擾時,無有效的解決措施;分散固相萃取法結(jié)合了液液萃取和固相萃取的原理,利用少量吸附劑加入到提取液吸附雜質(zhì),起到凈化效果。對比固相萃取法和分散液液萃取法,分散固相萃取操作步驟簡單、快速,凈化過程中不用額外的有機試劑。

本研究根據(jù)目標化合物的性質(zhì),采用分散固相萃取法,結(jié)合國際食品法典委員會(CAC)和我國關(guān)于乙拌磷的殘留限量要求,建立了5種典型性農(nóng)產(chǎn)品(豌豆、蘆筍、小麥、咖啡豆和花生)中乙拌磷及其代謝物農(nóng)藥殘留的UHPLC-MS/MS測定方法。本方法具有操作簡單便捷,適用于谷物、油料、蔬菜等多種基質(zhì)中乙拌磷及其代謝物的定性和定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30A超高效液相色譜儀、8060三重四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧電離(ESI)源)(日本Shimadzu公司); MX-F渦動混合器(中國Dragonlab公司); 5415D離心機(德國Eppendorf公司)。

乙拌磷(99.4 mg/L)、乙拌磷砜(1 000.1 mg/L)、乙拌磷亞砜(1 000 mg/L)、內(nèi)吸磷-S(1 000.2 mg/L)、內(nèi)吸磷-S-亞砜(純度96%)購自北京振翔科技有限公司;內(nèi)吸磷-S-砜(100 mg/L)購自天津阿爾塔科技有限公司。乙腈和甲醇(色譜純)購自美國Merck公司;甲酸和乙酸銨(色譜純)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;氯化鈉和無水硫酸鎂(分析純)購自上海化學試劑公司。多壁碳納米管(MWCNT)、羥基化多壁碳納米管(OH-MWCNTs)、羧基化多壁碳納米管(COOH-MWCNTs)購自江蘇先豐納米材料科技有限公司;辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;氨丙基粉(NH2)、中性氧化鋁(N-Al2O3)、硅膠鍵合苯基磺酸強陽離子交換吸附劑(SCX)購自安捷倫科技(中國)有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)和石墨化炭黑(GCB)購自日本Shimadzu公司。

樣品:在廣西、河南、南京和上海分別采集10批次小麥,總計40個樣品;在河南、上海、浙江和山東分別采集10批次花生,總計40個樣品?？Х榷?鮮)等其他樣品均購于網(wǎng)絡(luò)。

1.2 標準溶液配制

準確稱取內(nèi)吸磷-S-亞砜10.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,得到960 mg/L的內(nèi)吸磷-S-亞砜標準儲備液。

分別量取1.006、0.100、0.100、0.100、0.104和1.000 mL的乙拌磷、乙拌磷砜、乙拌磷亞砜、內(nèi)吸磷-S、內(nèi)吸磷-S-亞砜和內(nèi)吸磷-S-砜標準儲備液,用甲醇定容至10 mL,得到混合標準中間液。將上述混合標準中間液用空白基質(zhì)提取液稀釋成質(zhì)量濃度為2、10、50、100、200 μg/L的系列混合標準溶液。

所有標準溶液均保存于-(18±2) ℃條件下。

1.3 樣品前處理

將豌豆或蘆筍樣品切碎、勻漿,將小麥、咖啡豆或花生樣品粉碎后充分混勻。

稱取試樣5.0 g(精確至0.001 g),置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈(其中小麥、咖啡豆或花生樣品先加入5 mL水潤濕),渦旋提取10 min,加入4 g氯化鈉,再次渦旋30 s,再以4 000 r/min離心5 min,準確移取1.5 mL提取上清液至盛有50 mg C18、50 mg PSA和50 mg NH2的2 mL凈化離心管中,渦旋1 min后,以10 000 r/min離心2 min,取上清液過0.22 μm有機微孔濾膜后上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

Thermo Syncronis C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫40 ℃;流動相A為乙腈,B為水;流速0.50 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%A; 1.0～6.0 min, 10%A～90%A; 6.0～7.0 min, 90%A; 7.0～7.5 min, 90%A～10%A; 7.5～10 min, 10%A。進樣量2 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

ESI+檢測方式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源接口電壓:3.5 kV;脫除溶劑管(DL管)溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;霧化氣流速:3.0 L/min (N2,純度99.999%);干燥氣流速:15 L/min(N2,純度99.999%)。乙拌磷及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

首先,對乙拌磷及其代謝物的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,將目標化合物的標準溶液在ESI+和ESI-兩種模式下進行掃描。結(jié)果顯示,乙拌磷及其代謝物在ESI+模式下得到[M+H]+準分子離子峰,質(zhì)譜信號響應(yīng)比ESI-模式強,因此選擇正離子模式開展后續(xù)優(yōu)化。選擇乙拌磷及其代謝物的特征準分子離子峰為前體離子進行二級質(zhì)譜分析,每個目標化合物選取2對響應(yīng)最強的特征離子作為定性離子,以響應(yīng)值最大的碎片離子為定量離子,自動優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),乙拌磷及其代謝物的最佳質(zhì)譜條件見表1。

表 1 乙拌磷及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of disulfoton and its metabolites

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱選擇

實驗對比了Agilent EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm)、Thermo Syncronis C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)、Waters Acquity C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Shimadzu InertSustainSwift C18(50 mm×2.1 mm, 3 μm)4種液相色譜柱對乙拌磷及其代謝物的分離效果。如圖1所示,所有化合物在4種色譜柱上均能實現(xiàn)有效保留及分離,但采用Agilent EC-C18和Thermo Syncronis C18色譜柱時峰形對稱性好，半峰寬窄,且出峰時間相同,但采用Thermo Syncronis C18色譜柱時峰面積明顯高于Agilent EC-C18色譜柱。因此最終選擇Thermo Syncronis C18色譜柱進行分離。

圖 1 采用不同色譜柱時乙拌磷及其代謝物(0.05 mg/L) 的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ions chromatograms of disulfoton and its metabolites (0.05 mg/L) with different columnsa. Agilent EC-C18 (100 mm×3.0 mm, 2.7 μm); b. Thermo Syncronis C18 (150 mm×2.1 mm, 5 μm); c. Waters Acquity C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); d. Shimadzu InertSustainSwift C18 (50 mm×2.1 mm, 3 μm). Peak identifications: 1. disulfoton sulfoxide; 2. disulfoton sulfone; 3. demeton-S; 4. demeton-S sulfoxide; 5. demeton-S sulfone; 6. disulfoton.

圖 2 采用不同流動相時乙拌磷及其代謝物(0.05 mg/L) 的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ions chromatograms of disulfoton and its metabolites (0.05 mg/L) with different mobile phases a. methanol-water; b. acetonitrile-water; c. acetonitrile-0.05% formic acid aqueous solution. Peaks 1-6 were the same as that in Fig. 1.

2.2.2流動相選擇

對于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,流動相條件是影響目標化合物分離度和響應(yīng)的一個重要方面。在水相中添加甲酸銨或甲酸等試劑是改善色譜峰形、提高儀器響應(yīng)值和離子化效率的常用手段,通常采用酸性流動相有利于在正離子模式下進行質(zhì)譜檢測,而甲酸是最常用的試劑之一。以乙拌磷及其代謝物的質(zhì)量濃度為0.05 mg/L為實驗條件,首先比較甲醇-水(見圖2a)和乙腈-水(見圖2b)兩種流動相對6種化合物分離度的影響。結(jié)果表明,采用乙腈-水作為流動相,乙拌磷及其代謝物的分離度明顯優(yōu)于甲醇-水。其次比較了乙腈-水和乙腈-0.05%甲酸水(見圖2c)兩種流動相對6種化合物響應(yīng)的影響。如圖顯示,6種化合物在乙腈-水流動相中,峰高更高。因此最終采用乙腈-水作為流動相。

2.3 吸附劑種類的優(yōu)化

實驗選擇MWCNTs、OH-MWCNTs、COOH-MWCNTs、C8、C18、NH2、SCX、N-Al2O3、GCB和PSA 10種常見的分散固相萃取吸附材料,考察了其對目標化合物的吸附情況。分別稱取10 mg MWCNTs、OH-MWCNTs、COOH-MWCNTs和50 mg C8、C18、NH2、SCX、N-Al2O3、GCB和PSA,對乙拌磷及其代謝物(0.05 mg/L)在乙腈中吸附情況進行考察。如圖3a結(jié)果所示,MWCNTs、OH-MWCNTs、COOH-MWCNTs、C8、SCX或N-Al2O3凈化時內(nèi)吸磷-S亞砜的回收率都低于56.2%; GCB凈化時,乙拌磷的回收率偏低(71.5%);其余3種吸附劑(C18、NH2或PSA)凈化時,乙拌磷及其代謝物的回收率為87.9%～109.0%,均能滿足檢測方法的要求。

圖 3 不同吸附劑對乙拌磷及其代謝物(a、b)回收率和(c)基質(zhì)效應(yīng)的影響(n=5)Fig. 3 Effect of different sorbents on the (a, b) recoveries and (c) MEs of disulfoton and its metabolites (n=5) MWCNTs: multiwalled carbon nanotubes; SCX: strong cation exchange.

2.4 吸附劑用量的優(yōu)化

C18主要吸附脂類和甾醇等非極性雜質(zhì)[15], NH2主要吸附碳水化合物和部分脂肪[16], PSA主要吸附極性有機酸、脂肪酸、極性色素和糖[15,17]。鑒于本方法擬適用于谷物、油料和蔬菜等多種基質(zhì),選擇了具有代表性的花生(油脂類)、蘆筍(高含水蔬菜類)、小麥(谷物類)3種基質(zhì)進一步開展C18、NH2和PSA不同組合的回收率和基質(zhì)效應(yīng)的評價。

結(jié)合上述實驗結(jié)果,以高含油量作物(花生)、高含水量作物(蘆筍)和高淀粉含量作物(小麥)為基質(zhì),分別選定不同吸附材料(見圖3b)處理凈化后的提取液配制乙拌磷及其代謝物的標準溶液(0.05 mg/L),進行添加回收評價。如圖3b所示,7種吸附劑組合方式下，乙拌磷及其代謝物在花生、蘆筍和小麥中的回收率均無明顯影響,目標化合物的回收率為81.0%～109.3%,相對標準偏差(RSD)為0.6%～12.5%,均滿足分析方法要求。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的探究

國際純粹與應(yīng)用化學聯(lián)合會(IUPAC)定義基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的其他成分對待測物測定值的綜合影響?；|(zhì)效應(yīng)一般受分析儀器、樣品基質(zhì)、前處理方式等因素的影響[12,18]。樣品基質(zhì)中存在對待測成分有干擾的化合物,在UHPLC-MS/MS分析中,離子化過程時,干擾成分同待測成分離子化競爭,從而引起待測成分信號抑制或增強,對方法的靈敏度、精密度和準確度造成影響。

根據(jù)文獻[15,19]報道, ME=(基質(zhì)中分析物的峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫锏姆迕娣e-1)×100%。當ME>0,為基質(zhì)增強效應(yīng);當ME=0,無基質(zhì)效應(yīng);當ME<0,為基質(zhì)抑制效應(yīng)。一般認為當|ME|≤20%,認為該基質(zhì)沒有基質(zhì)效應(yīng);若在20%～50%之間,表明有中等基質(zhì)效應(yīng);當大于50%,對目標化合物有較強的基質(zhì)效應(yīng)。實驗比較了溶劑標準溶液(0.05 mg/L)、7種吸附劑組合方式凈化后基質(zhì)匹配標準溶液和未凈化的基質(zhì)匹配標準溶液。

由圖3c可知,乙拌磷及其代謝物在7種預(yù)定方式凈化后,基質(zhì)效應(yīng)絕對值均呈明顯下降,但是采用50 mg PSA、50 mg NH2和50 mg C18混合時凈化效果最佳。在3種吸附材料凈化條件下,仍然有部分|ME|值超過20%(花生基質(zhì)中的乙拌磷和蘆筍基質(zhì)中的硫醇式-內(nèi)吸磷亞砜)。因此,為了確保分析方法的準確性,尤其在油料和蔬菜基質(zhì)中,仍然需要通過配制基質(zhì)標準溶液進行定量分析。

2.6 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

根據(jù)1.2節(jié)配制基質(zhì)混合標準溶液,分別進樣2 μL,在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下進行測定,以各分析物的質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標,以其相應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標,得到各分析物的線性方程。結(jié)果顯示,乙拌磷及其代謝物在2.0～200.0 μg/L線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.998 1。乙拌磷及其代謝物的檢出限(LOD)為3倍信噪比所對應(yīng)的含量,為0.02～2.0 μg/kg(見表2)。根據(jù)歐盟文件SANTE/11813/2017規(guī)定,當最小添加水平回收率滿足70%～120%及相對標準偏差≤20%時,定量限(LOQ)可以為最小添加水平。本實驗的最小添加水平為5 μg/kg,乙拌磷及其代謝物的回收率≥75.0%, RSD≤14.9%,因此乙拌磷及其代謝物的LOQ為5 μg/kg。

表 2 乙拌磷及其代謝物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和相對標準偏差(n=5)Table 2 Regression equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs), recoveries and RSDs of disulfoton and its metabolites (n=5)

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.7 回收率和精密度

選擇不含待測物的樣品(豌豆、蘆筍、小麥、咖啡豆和花生)進行添加回收試驗,添加水平分別為5、100和1 000 μg/kg,每個樣品基質(zhì)做5次平行試驗,最高添加水平用空白基質(zhì)稀釋5倍后檢測。結(jié)果如表2所示,乙拌磷及其代謝物的回收率為75.0%～110.0%, RSD為0.7%～14.9%。符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》的要求[20]。

2.8 實際樣品的測定

選取各地市售的40份小麥、40份花生樣品,采用所建立的方法,按照最優(yōu)實驗條件進行乙拌磷及其代謝物殘留的檢測。檢測結(jié)果顯示,所有樣品均未檢出乙拌磷及其代謝物。

3 結(jié)論

本文建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定乙拌磷及其代謝物在不同農(nóng)產(chǎn)品中的檢測方法,該方法有較好的檢測靈敏度和準確度。該方法操作簡單,靈敏度高,回收率高,準確度好,檢出限低,滿足定性和定量要求,適用于高含水類、高淀粉含量類和高含油量類作物中乙拌磷及其代謝物的檢測,可為乙拌磷在高淀粉含量類和高含油量類作物的風險監(jiān)控提供有效的技術(shù)支持。