左西孟旦對大鼠急性心肌梗死后心肌纖維化及心功能的影響

劉亞麗，李春彥，李雅麗，寇惠芬，許曉偉，李新軍*

河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院 1.心內(nèi)科，2.綜合病區(qū)，河北 張家口 075100

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是影響我國數(shù)百萬人生命健康的主要心血管疾病。其較為重要的病理特征為心肌纖維化，可表現(xiàn)為心肌梗死區(qū)細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，進而導(dǎo)致心肌組織硬化，限制心正常的活動[1]。雖然最初形成的纖維化組織對防止梗死心破裂具有保護作用，但持續(xù)的心肌纖維化會導(dǎo)致心功能下降[2]。據(jù)文獻報道：心肌纖維化與肌成纖維細胞TGF-β途徑結(jié)合TGF-β受體有關(guān)[3]。為防止心肌纖維化的進展，抑制TGF-β途徑介導(dǎo)的肌成纖維細胞形成至關(guān)重要。左西孟旦是一種通過穩(wěn)定肌鈣蛋白C而不增加心肌細胞內(nèi)鈣濃度來增強心肌收縮的正性肌力藥物，廣泛用于治療心力衰竭和低輸出量綜合征[4]。此外，它通過開放ATP敏感鉀通道和增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）依賴性NO釋放具有舒張血管的作用[5]。值得注意的是，最近臨床研究發(fā)現(xiàn)，左西孟旦能延緩慢性心力衰竭患者心肌纖維化進展[6]。相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，左西孟旦具有抗炎和抗凋亡的特性，如左西孟旦可降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞和成纖維細胞IL-6上調(diào)，保護H9C2心肌細胞免受同型半胱氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡[7]。然而，目前還沒有關(guān)于左西孟旦抗心肌纖維化作用的研究。本研究探討左西孟旦對MI大鼠心肌纖維化和TGF-β1刺激的原代大鼠心肌成纖維細胞的影響，并對其作用機制進行分析，為左西孟旦治療心肌纖維化的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

90只雄性SD大鼠購自上海凱學(xué)生物科技有限公司，合格證編號：SCXK 2008-0016。大鼠均為8周齡，體重200～240 g，不含特定病原體（SPF）。將大鼠在無病原體的條件下以12 h的明/暗周期飼養(yǎng)，溫度為（23±1）℃，濕度為（55±5）%，自由獲得食物和水。

1.2 研究方法

1.2.1 建立MI模型 參照文獻[8]，大鼠腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉，并使用小型動物呼吸機（美國Harvard 683公司）進行通氣氣管插管。然后，對大鼠進行開胸手術(shù)，用5-0聚丙烯縫合線結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支?？p合切口，將動物放回籠中。術(shù)后通過經(jīng)胸超聲心動圖評估心功能。根據(jù)超聲心動圖結(jié)果，將30只存活的MI大鼠隨機分為：模型組和左西孟旦組（Levo組），每組15只。假手術(shù)組（n=10）的大鼠同樣開胸但不進行動脈結(jié)扎。給予大鼠的左西孟旦劑量為4.67μg·kg-1·d-1（該劑量相當(dāng)于臨床上治療MI患者的劑量），將藥物溶解于蒸餾水中，灌胃給藥28 d。假手術(shù)組和模型組大鼠同時給等量蒸餾水。治療28 d后，各組存活情況：假手術(shù)組10只，模型組10只，Levo組14只。

1.2.2 超聲心動圖評價左室功能 治療28 d后，用Vevo 2100超聲（加拿大visualonics公司）及相應(yīng)探頭（MS-250）進行超聲心動圖檢查，中心頻率21 MHz。獲取左室胸骨旁短軸二維M型圖像，通過圖像測量相關(guān)數(shù)值，每個測量點記錄3個心動周期。測量并收集射血分數(shù)（ejection fraction，EF）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVEDs）、縮短分數(shù)（fractional shortening，F(xiàn)S）和左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDd）。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查 將心水平切割成兩部分。取上1/3部分，用4%多聚甲醛（pH 7.4）固定。用蘇木精-伊紅（HE）和馬森三色（Masson-trichrome）對大鼠心肌組織進行染色。顯微鏡下觀察病理切片。應(yīng)用Image Pro-Plus軟件分析梗死邊緣區(qū)膠原體積分數(shù)（CVF）。選擇8個Masson染色切片的單獨視圖（放大倍數(shù)＝原始圖像×400），采用以下公式計算，CVF＝膠原面積/總視覺面積×100%，評估心肌纖維化程度。

1.2.4 心肌成纖維細胞的分離和治療 用混合酶消化液（0.06%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型膠原酶溶于不含鈣和鎂的D-PBS）分離新生SD大鼠心肌成纖維細胞。利用心肌組織中不同細胞的黏附特性差異，將成纖維細胞從心肌細胞中分離。第2～6代細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后用20 ng/ml TGF-β1（美國PeproTech公司），20 ng/ml TGF-β1+100μmol/L Levo或20 ng/ml TGF-β1+100μmol/L Levo+1 μmol/L SIRT1特異性抑制劑Sirtinol（美國Selleck公司）處理細胞，持續(xù)24 h。收集細胞和上清液進行進一步實驗。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法測定上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量 使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國ImmunoWay Biotechnology公司）測量細胞上清液中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原。每組的細胞上清液用稀釋劑稀釋。經(jīng)過一系列步驟后，在450 nm處進行分光光度檢測。繪制曲線并計算樣品濃度。

1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定mRNA表達 用TRIzol試劑（美國Thermo Scientific公司）按照說明書步驟，提取總RNA。然后，使用cDNA合成試劑盒（上海威奧生物科技有限公司），根據(jù)步驟合成cDNA。用以下熱循環(huán)模式進行qPCR：50℃保持2 min，95℃保持2 min，然后進行40個循環(huán)的擴增（95℃保持15 min，60℃保持1 min和72℃保持30 min）。反應(yīng)體系為20μl，包括7μl焦碳酸二乙酯水（研科生物，中國）、10μl SYBRGreen Master（賽默飛，美國）、正向和反向引物各1μl以及1μl cDNA。在每個循環(huán)結(jié)束時檢測管中SYBR Green熒光的吸收值，并獲取相應(yīng)的Ct值。管家基因GAPDH用作內(nèi)部對照。目標(biāo)基因包括COL1A1和COL3A1。引物由美國Invitrogen公司提供。使用2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達值。引物序列：COL3A1：正向5'-ATATCAAACACGCAAGGCCA-3'和 反 向 5'-TTGCTGGGGTTTCAGAGAGTT-3'，COL1A1：正向5'-CAGAGCACCATTTTCCAAAGCA-3'和 反 向 5'-GGTACAGAGTCTCTTGCTTCCT-3’，GAPDH：正向5'-ATTCCATCCCAGACCCCATAAC-3'和 反 向 5'-GCAGCGAACTTTATTGATGGTAT-3'。

1.2.7 Western blot測定蛋白表達 研磨大鼠心，并用冷卻的RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑）置于冰上勻漿，提取總蛋白。使用BCA試劑盒（上海通蔚有限公司），按照使用說明書測量每個樣品中的蛋白質(zhì)濃度。通過電泳將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，用5%脫脂牛奶封閉膜2 h。然后在4℃下與所需的一抗孵育12 h，再與HRP山羊抗兔IgG二抗（1：10000，北京冠星宇科技有限公司）在37℃下孵育1 h，最后用ECL檢測試劑在室溫下處理1 min（美國GEHealthcare公司）。使用Bio-Rad Image Lab軟件對蛋白質(zhì)條帶進行可視化和分析。最終報告SIRT1、TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的數(shù)據(jù)是通過GADPH歸一化的條帶密度，而p-Smad3用Smad3標(biāo)準(zhǔn)化。SIRT1一抗、TGF-β1一抗、α-SMA一抗、p-Smad3一抗及Smad3一抗購自美國Abcam公司；GAPDH抗體、CollagenⅠ抗體和CollagenⅢ抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表示為平均值±SEM，所有結(jié)果的統(tǒng)計顯著性使用方差檢驗或非參數(shù)檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左西孟旦對MI大鼠心功能的影響

超聲心動圖測量大鼠的心功能發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的LVEDs和LVEDd顯著增加（P＜0.01），而EF和左心室FS顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，Levo組大鼠的LVEDs降低（P＜0.05），而EF和FS顯著升高（P＜0.01）。詳見表1。這些結(jié)果表明，左西孟旦可以改善MI大鼠的心功能。

表1 超聲心動圖評估大鼠心功能Tab.1 Echocardiographic evaluation of cardiac function in rats

2.2 左西孟旦對MI大鼠梗死邊緣區(qū)膠原沉積的影響

HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)正常，而模型組可觀察到廣泛的壞死心肌組織，并伴有炎性細胞浸潤。左西孟旦治療可顯著減少壞死心肌組織并抑制炎性細胞的浸潤（圖1A）。Masson染色顯示，模型大鼠梗死邊界區(qū)域存在大量膠原蛋白沉積，而左西孟旦處理可顯著減少膠原蛋白沉積的含量。進一步定量膠原蛋白的體積分數(shù)（CVF）。與假手術(shù)組相比，模型組CVF增加了408.2%（P＜0.001）。用左西孟旦治療后，CVF降低了52.63%（P＜0.01，圖1B）。通過RT-qPCR進一步評估心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的含量，與假手術(shù)組相比，模型組膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的mRNA表達顯著提高（P＜0.001），而左西孟旦治療顯著降低了心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的含量（P＜0.01），見圖1C，D。這些結(jié)果表明，左西孟旦可以通過抑制膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的表達和沉積來有效減輕心肌纖維化。

圖1 左西孟旦對MI大鼠梗死邊緣區(qū)膠原沉積的影響A：HE和Masson-trichrome染色心肌組織的代表性圖像（比例尺50μm，放大200倍，箭頭分別標(biāo)注炎性細胞和膠原纖維）B：分析CVF以定量評估心肌組織中的膠原蛋白含量C，D：RT-qPCR分析心肌組織中Ⅰ和Ⅲ型膠原的RNA表達*P＜0.05，***P＜0.001，與假手術(shù)組相比##P＜0.01，與模型組相比Fig.1 Effect of levosimendan on collagen deposition in theinfarct margin of MIratsA:HE and Masson's representative images of heart tissue stained(Scale:50μm,×200,arrows indicated inflammatory cells and collagen fibers,respectively)；B:CVF was analyzed to quantitatively evaluate the collagen content in heart tissue；C,D:RT-qPCR was used to analyze the RNA expression of typeⅠand typeⅢcollagen in heart tissueCompared with sham group,*P＜0.05,***P＜0.001;compared with model group,##P＜0.01

2.3 左西孟旦對MI大鼠心肌組織中SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路影響

SIRT1/TGF-β1/Smads信號通路與心肌纖維化密切相關(guān)。本研究測量SIRT1、TGF-β1和Smad3在小鼠心肌中的表達，如圖2所示，與假手術(shù)組相比，模型組SIRT1蛋白表達下調(diào)67%（P＜0.001），TGF-β1和p-Smad3蛋白表達上調(diào)851%和397%（P＜0.001）。而左西孟旦治療顯著上調(diào)MI大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達（增加168%），下調(diào)TGF-β1（降低60%）和p-Smad3（降低47%）蛋白表達，均為P＜0.01。

圖2 左西孟旦對MI大鼠心肌組織中SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路的影響A：Western blot分析心肌組織SIRT1、TGF-β1、p-Smad3和Smad3蛋白表達 B～D：SIRT1、TGF-β1、p-Smad3和Smad3蛋白表達的定量分析***P＜0.001，與假手術(shù)組相比##P＜0.01，與模型組相比Fig.2 Effect of levosimendan on SIRT1/TGF-β1/Smad3 signaling pathway in theheart of MIratsA:Western blot analysis of SIRT1,TGF-β1,p-Smad3 and Smad3 protein expression in heart tissue;B-D:Quantitative analysis of SIRT1,TGF-β 1,p-Smad3 and Smad3 protein expression；Compared with sham group,***P＜0.001;compared with model group,##P＜0.01

2.4 左西孟旦對TGF-β1刺激心肌成纖維細胞的影響

研究進一步分析左西孟旦和SIRT1特異性抑制劑Sirtinol對TGF-β1刺激的心肌成纖維細胞的影響。采用ELISA檢測試劑盒檢測上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量，結(jié)果見表2所示，TGF-β1處理的細胞型膠原含量明顯高于對照DMEM培養(yǎng)基處理的細胞（P＜0.001）。左西孟旦處理顯著降低了TGF-β1誘導(dǎo)的膠原水平（P＜0.01），而Sirtinol的加入明顯降低了左西孟旦的抑制能力（P＜0.01）。

表2 左西孟旦對TGF-β1刺激的心肌成纖維細胞膠原蛋白產(chǎn)生的影響Tab.2 Effect of levosimendan on collagen production in TGF-β1 stimulated cardiac fibroblasts

TGF-β1誘導(dǎo)上皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，成纖維細胞是膠原的主要生產(chǎn)者，其特征在于存在α-SMA[9]。肌成纖維細胞是成纖維細胞的活化形式。通過Western blot分析心肌成纖維細胞SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路和膠原蛋白表達，結(jié)果見圖3和表3所示，在TGF-β1刺激的細胞中，α-SMA、p-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達上調(diào)（P＜0.001），表明成纖維細胞在表型上轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞，并合成膠原。左西孟旦處理抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、p-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達（P＜0.01），而Sirtinol的加入明顯降低了左西孟旦的抑制能力（P＜0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路在心肌成纖維細胞膠原合成中起重要作用，左西孟旦可能通過該信號通路抑制成纖維細胞向成肌纖維細胞的轉(zhuǎn)化，從而有效抑制心肌成纖維細胞的膠原合成，降低心肌纖維化。

表3 左西孟旦對TGF-β1刺激的心肌成纖維細胞SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路和膠原蛋白的影響Tab.3 Effects of levosimendan on SIRT1/TGF-β1/Smad3 signaling pathway and collagen in TGF-β1 stimulated cardiac fibroblasts

圖3 Western blot分析心肌成纖維細胞SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路和膠原蛋白表達Fig.3 Western blot analysis of SIRT1/TGF-β1/Smad3 signaling pathway and collagen expression in cardiac fibroblasts

3 討論

心肌纖維化是一種與幾乎所有形式的心肌病相關(guān)的病理變化。心肌細胞的這種病理重塑涉及肌成纖維細胞產(chǎn)生的ECM蛋白的過度沉積，有助于降低組織順應(yīng)性并加速向心衰的進展[3]。肌成纖維細胞的起源目前尚未達成一致意見，通常心肌損傷后可促進肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，而心肌成纖維細胞的激活即可導(dǎo)致心肌纖維化[10]。因此，靶向心肌成纖維細胞和ECM的沉積將是心血管疾病的一種有吸引力的治療方法。左西孟旦因為其具有保護心肌等重要功能，已廣泛應(yīng)用于臨床治療缺血性心肌病[6]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠LAD結(jié)扎術(shù)后心功能嚴(yán)重受損，梗死區(qū)邊緣區(qū)紊亂的心肌細胞中廣泛沉積Ⅰ型和Ⅲ型膠原。左西孟旦治療28 d后發(fā)現(xiàn)，大鼠心功能明顯改善且膠原沉積明顯減少，提示左西孟旦可改善心肌纖維化。先前的研究表明，左西孟旦可以通過抑制花生酸代謝、抑制氧化應(yīng)激和減緩心力衰竭的進展來改善心功能和保護H9C2細胞[7]。本研究進一步探討了左西孟旦抗纖維化作用的分子機制。

SIRT1是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，與多種疾病相關(guān)，這是因為其參與了細胞中的多種活動如：細胞存活、凋亡、基因沉默和表達、細胞代謝、細胞衰老等[11]。先前的研究表明，活化的SIRT1可以保護心肌免受血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚和功能障礙的影響，且上調(diào)心肌細胞中SIRT1，可減少細胞氧化應(yīng)激損傷，進而抑制細胞凋亡和衰老[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MI大鼠心肌組織中以及TGF-β1刺激的心肌成纖維細胞中SIRT1的表達降低。然而，在體內(nèi)和體外給藥左西孟旦顯著增加了SIRT1蛋白的表達。值得注意的是，在體外試驗中，SIRT1特異性抑制劑Sirtinol逆轉(zhuǎn)了左西孟旦改善TGF-β1誘導(dǎo)的膠原水平和相關(guān)膠原蛋白合成的作用。這些數(shù)據(jù)表明，SIRT1參與左西孟旦對TGF-β1誘導(dǎo)的心肌纖維化的保護作用。

SIRT1活性的增加可能影響一系列下游靶點，包括TGF-β1，一種多效性細胞因子（促纖維化和炎癥因子），參與免疫應(yīng)答和纖維化的發(fā)展[11]。TGF-β1信號途徑與成纖維細胞活化以及ECM生成密切相關(guān)[14]。通過TGF-β1與質(zhì)膜受體相結(jié)合，繼而誘導(dǎo)Smad3轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，然后磷酸化的Smad3轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，進一步增加纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原[15]。TGF-β/Smad3已成為改善心肌纖維化的潛在治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)MI大鼠心肌梗死區(qū)邊緣區(qū)有大量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原沉積，TGF-β1和Smad3表達明顯上調(diào)，提示TGF-β1/Smad3通路在MI大鼠心肌纖維化的過程中起到一定的作用。左西孟旦可改善心功能，抑制TGF-β1和Smad3的表達。Smad3與心肌梗死密切相關(guān)，在心肌纖維化重塑的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[14]。它還能促進肌成纖維細胞增殖、分化、遷移等方式來調(diào)控ECM蛋白的合成[15]。體外研究表明，左西孟旦可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞Smad3磷酸化，還能抑制心肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，肌成纖維細胞是膠原的主要生成者。結(jié)果表明，左西孟旦可部分通過SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路減輕心肌纖維化。

總之，本研究組體內(nèi)和體外研究表明，左西孟旦具有抗纖維化和心肌保護作用。這些作用可能通過SIRT1/TGF-β1/Smad3信號通路介導(dǎo)。SIRT1和TGF-β 1是目前治療心肌纖維化有吸引力的靶點，本研究為左西孟旦在纖維化疾病中的臨床應(yīng)用提供了新的思路。