氯碘羥喹對(duì)癲癇小鼠海馬神經(jīng)元凋亡和學(xué)習(xí)記憶功能的保護(hù)作用

竇曉娜，李霞，李心雨，張莉,3*

錦州醫(yī)科大學(xué) 1.組織胚胎學(xué)教研室，2.附屬第一醫(yī)院口腔科，3.生物人類學(xué)研究所，遼寧 錦州 121001

癲癇以反復(fù)、發(fā)作性的短暫腦功能異常為主要表現(xiàn)，可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡，影響學(xué)習(xí)記憶功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)發(fā)作的大腦異常放電可導(dǎo)致軸突終末大量釋放突觸小泡鋅，高濃度的鋅具有細(xì)胞毒性，是誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的主要原因。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)鋅螯合劑-氯碘羥喹通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)鋅代謝對(duì)阿爾茲海默病和腦缺血再灌注等疾病有神經(jīng)保護(hù)作用，提示氯碘羥喹是治療神經(jīng)退行性疾病的一種潛在藥物。目前，關(guān)于氯碘羥喹對(duì)癲癇海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究較少，而大劑量的氯碘羥喹其毒性可導(dǎo)致亞急性脊髓視神經(jīng)病和暫時(shí)性全身性遺忘等病癥，因此，在給藥劑量、給藥方式和抗癲癇機(jī)制等方面需更深入的研究。本研究建立匹羅卡品癲癇小鼠模型，觀察氯碘羥喹對(duì)癲癇海馬神經(jīng)元凋亡及學(xué)習(xí)記憶功能的保護(hù)作用，期為氯碘羥喹在癲癇治療中的應(yīng)用及機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物分組及給藥 54只CD1小鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)分3組。對(duì)照組：正常動(dòng)物腹腔注射生理鹽水；癲癇組：癲癇模型30 min后，腹腔注射生理鹽水；氯碘羥喹組：癲癇模型30 min后，一次性腹腔注射氯碘羥喹（15 mg/kg）。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)原則。

1.1.2 主要藥品及試劑 氯碘羥喹和匹羅卡品（Sigma公司）；兔抗小鼠多克隆Bcl-2和Bax抗體（Cell signaling Technology公司）；山羊抗兔IgG、兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體、ECL檢測(cè)試劑盒、蛋白Marker等（福州邁新公司）；Caspase-9和Caspase-3的ELISA檢測(cè)試劑盒（上海谷研生物科技有限公司）；尼氏染液、對(duì)苯二酚、乳化銀和硒酸鈉等（博士德公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 匹羅卡品癲癇模型建立與鑒定 小鼠腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg，30 min后，腹腔注射匹羅卡品300 mg/kg，制備癲癇小鼠模型[2]。根據(jù)Racine等[3]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)癲癇級(jí)別：0級(jí)，行為正常；Ⅰ級(jí)，面部肌肉痙攣，咀嚼運(yùn)動(dòng)、眨眼、動(dòng)須和濕狗樣顫動(dòng)；Ⅱ級(jí)，頸部肌肉痙攣，點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)；Ⅲ級(jí)，一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級(jí)，站立伴雙前肢陣發(fā)性痙攣；Ⅴ級(jí)，在Ⅳ級(jí)基礎(chǔ)上，身體向后倒下失去平衡，四肢抽動(dòng)。達(dá)到Ⅲ級(jí)以上者為癲癇發(fā)作，發(fā)作持續(xù)30 min以上者為癲癇持續(xù)狀態(tài)。癲癇發(fā)作1 h后，腹腔注射地西泮10 mg/kg終止癲癇發(fā)作。

1.2.2 取材與標(biāo)本制備 7 d取材。小鼠用4%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，取海馬。一部分制作冰凍切片，用于金屬自顯影和尼氏染色；另一部分用于免疫印跡和ELISA檢測(cè)。

1.2.3 金屬自顯影技術(shù) 小鼠腹腔注射0.1%硒酸鈉（20 mg/kg），1.5 h后麻醉，2.5%戊二醛灌流固定，取腦組織。腦組織固定3 h，30%蔗糖4℃浸泡12 h，制冰凍切片。切片在染液（5.7%對(duì)二苯酚15 ml、0.1 mol/L檸檬酸10 ml、50%阿拉伯膠60 ml及0.8%乳化銀15 ml混勻）中26℃水浴染色1 h。常規(guī)脫水、透明、封片。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每個(gè)樣本選取5張切片，400倍光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，測(cè)灰度值，計(jì)算光密度，取5張切片的平均值作為該樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 尼氏染色 動(dòng)物麻醉后用4%多聚甲醛灌流固定，取海馬組織制作冰凍切片。室溫下切片用0.1%焦油紫染液染色10 min，PBS沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，觀察海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，方法同上。

1.2.5 免疫印跡技術(shù) 組織沖洗、稱重后剪碎，超聲粉碎，裂解12 h。離心取上清，測(cè)蛋白濃度，沸水里煮5 min，冷卻后離心。制膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、染膜、裁膜。室溫封閉2 h。加兔抗小鼠Bcl-2和Bax多克隆抗體（1：500），內(nèi)參用GAPDH。4℃反應(yīng)12 h，TBST洗膜。室溫下山羊抗兔IgG（1：5000）反應(yīng)2 h，TBST洗膜。ECL顯色，測(cè)光密度。用目的條帶與內(nèi)參條帶光密度的比值表示待測(cè)蛋白含量。

1.2.6 ELISA檢測(cè) 海馬組織清洗、剪碎、超聲粉碎，離心取上清。酶標(biāo)包被板37℃封閉2 h。去除封閉液，加入標(biāo)準(zhǔn)液、樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37℃孵育1 h，PBS清洗。酶標(biāo)二抗37℃孵育1 h，PBS清洗。TMB底物室溫避光顯色10～30 min，加終止液。檢測(cè)OD450值。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算直線回歸方程式，根據(jù)樣品OD值計(jì)算樣品濃度。

1.2.7 動(dòng)物行為學(xué)觀察 ①癲癇造模后7 d，觀察小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作級(jí)別和總的發(fā)作持續(xù)時(shí)間，觀察時(shí)間為2 h。②T迷宮實(shí)驗(yàn)。先進(jìn)行2 d的適應(yīng)實(shí)驗(yàn)。小鼠放入T迷宮5 min，在迷宮的兩側(cè)臂放置食物，等小鼠取食后將其取出。第3 d開(kāi)始訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)。Forced run中，隨機(jī)關(guān)閉左或右臂，小鼠只能進(jìn)入開(kāi)放臂取食。15 s后進(jìn)行Test run測(cè)試。開(kāi)放兩臂，將小鼠放入開(kāi)始臂，小鼠進(jìn)入未曾進(jìn)入的臂為正確選擇，給食物獎(jiǎng)勵(lì)；重復(fù)進(jìn)入相同的臂為錯(cuò)誤選擇，不給食物。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練10次，每次間隔15 min。癲癇造模后7 d測(cè)試，將Forced run和Test run之間的間隔設(shè)置為15 s、60 s和180 s，計(jì)算正確率。③Y迷宮實(shí)驗(yàn)。癲癇造模后6 d測(cè)試。當(dāng)Y迷宮的一個(gè)臂亮燈時(shí)，底部的銅網(wǎng)無(wú)電流，為安全區(qū)；另兩個(gè)臂燈滅，底部銅網(wǎng)有電流，為非安全區(qū)。第1 d，把小鼠放入迷宮適應(yīng)環(huán)境5 min。把小鼠所在臂作為起步區(qū)電擊，小鼠直接逃入安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。小鼠到達(dá)安全區(qū)30 s后，以小鼠所處的臂為起步區(qū)，隨機(jī)變換安全區(qū)位置，再進(jìn)行下一次電擊。連續(xù)10次測(cè)試有9次正確反應(yīng)作為達(dá)到學(xué)會(huì)逃避的標(biāo)準(zhǔn)，記錄小鼠達(dá)標(biāo)需要訓(xùn)練的次數(shù)。24 h后重新測(cè)試，每只小鼠測(cè)試10次，計(jì)算正確率，作為24 h記憶保持率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 金屬自顯影技術(shù)觀察鋅在海馬的分布

陽(yáng)性反應(yīng)為棕褐色細(xì)顆粒狀。與對(duì)照組相比，癲癇組海馬CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性顆粒更密集，棕褐色加深，光密度增大，提示海馬鋅增多；與癲癇組相比，氯碘羥喹組的陽(yáng)性顆粒密集程度降低，棕褐色變淺，光密度減小，提示海馬鋅減少（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 鋅在海馬的分布A：海馬金屬自顯影染色B：CA3區(qū)的光密度 C：CA1區(qū)的光密度*P＜0.01，與對(duì)照組相比#P＜0.01，與癲癇組相比n=6Fig.1 Distribution of zinc in hippocampusA:Autometallography of hippocampus;B:Average optical density in CA3;C:Average optical density in CA1*P＜0.01 vs Control group;#P＜0.01 vs Epilepsy group;n=6

2.2 尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量

與對(duì)照組相比，癲癇組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元變小，細(xì)胞皺縮，尼氏體模糊，色深，細(xì)胞數(shù)量減少；與癲癇組相比，氯碘羥喹組神經(jīng)元的形態(tài)明顯改善，細(xì)胞皺縮減輕，尼氏體較清晰，色淺，細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 海馬神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量（箭頭所指為海馬神經(jīng)元）A：海馬尼氏染色B：CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量C：CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量*P＜0.01，與 對(duì) 照 組相比#P＜0.01，與癲癇組相比n=6Fig.2 Morphology and number of hippocampal neurons (Arrows referred to the hippocampal neurons)A:Nissl staining of hippocampus; B:The number of neurons in CA3;C:The number of neuronsin CA1*P＜0.01 vs Control group;#P＜0.01 vs Epilepsy group;n=6

2.3 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)海馬Bcl-2和Bax表達(dá)

與對(duì)照組相比，癲癇組Bcl-2減少，光密度降低，Bax增多，光密度增高，Bcl-2/Bax值減??；與癲癇組比較，氯碘羥喹組Bcl-2增高，光密度增大，Bax減少，光密度降低，Bcl-2/Bax值增大（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 海馬Bcl-2和Bax的表達(dá)A：免疫印跡條帶B：Bcl-2表達(dá)C：Bax表達(dá)D：Bcl-2與Bax比值*P＜0.01，與對(duì)照組相比#P＜0.01，與癲癇組相比n=6Fig.3 Expressionsof Bcl-2 and Bax in hippocampusA:The image of immunoblotting;B:Expression of Bcl-2;C:Expression of Bax;D:The ratio of Bcl-2 and Bax expression;*P＜0.01 vs Control group;#P＜0.01 vs Epilepsy group,n=6

2.4 ELISA檢測(cè)海馬Caspase-9和Caspase-3表達(dá)

與對(duì)照組相比，癲癇組和氯碘羥喹組Caspase-9和Caspase-3表達(dá)均明顯增多；與癲癇組相比，氯碘羥喹組Caspase-9和Caspase-3表達(dá)減少（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 海馬Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)*P＜0.01，與對(duì)照組相比#P＜0.01，與癲癇組相比n=6Fig.4 The expression of caspase-9 and caspase-3 in hippocampus*P＜0.01 vs Control group;#P＜0.01 vs Epilepsy group,n=6

2.5 自發(fā)性癲癇的發(fā)作級(jí)別、發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間

對(duì)照組小鼠無(wú)自發(fā)性癲癇發(fā)作。癲癇組和氯碘羥喹組都有自發(fā)性癲癇發(fā)作；與癲癇組相比，氯碘羥喹組的發(fā)作級(jí)別降低，發(fā)作次數(shù)減少，發(fā)作持續(xù)時(shí)間縮短（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 癲癇發(fā)作級(jí)別、發(fā)作次數(shù)和發(fā)作持續(xù)時(shí)間比較A：癲癇發(fā)作級(jí)別B：發(fā)作次數(shù)C：發(fā)作持續(xù)時(shí)間 *P＜0.01，與對(duì)照組相比#P＜0.01，與癲癇組相比n=12Fig.5 Comparison of theseizurelevel,seizuretimesand durationA:Seizurelevel;B:Seizuretimes;C:Duration *P＜0.01 vs Control group;#P＜0.01 vs Epilepsy group,n=12

2.6 T迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能

當(dāng)Force run與Test run間隔15 s和60 s時(shí)，3組的正確率無(wú)明顯差異（P＞0.05）。當(dāng)間隔180 s時(shí)，與對(duì)照組相比，癲癇組和氯碘羥喹組的正確率降低，氯碘羥喹組的正確率高于癲癇組（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 T迷宮檢測(cè)正確率*P＜0.01，與對(duì)照組相比#P＜0.01，與癲癇組相比n=6Fig.6 Accuracy by Tmaze detection*P＜0.01 vs Control group;#P＜0.01 vs Epilepsy group,n=6

2.7 Y迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能

與對(duì)照組相比，癲癇組和氯碘羥喹組達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的次數(shù)增多，24 h記憶保持率降低；與癲癇組相比，氯碘羥喹組達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的次數(shù)減少，24 h記憶保持率增高（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖7 Y迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能A：達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需次數(shù)B：24 h記憶保持率 *P＜0.01，與對(duì)照組相比#P＜0.01，與癲癇組相比n=6Fig.7 Learning and memory ability by Y mazedetectionA:Times to meet institute standards;B:Memory retention rate of 24 h*P＜0.01 vs Control group;#P＜0.01 vs Epilepsy group,n=6

3 討論

癲癇與神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致的海馬結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)，而鋅在神經(jīng)元內(nèi)的大量聚集是凋亡的主要原因[4]。高濃度鋅具有明顯的細(xì)胞毒作用，能破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞外鈣內(nèi)流，細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，利用瘦素降低細(xì)胞內(nèi)的鋅離子水平，維持鋅穩(wěn)態(tài)，能對(duì)抗谷氨酸對(duì)HT22細(xì)胞的細(xì)胞毒性[6]。香芹芬和2-氨基乙氧基苯硼酸能減少癲癇誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鋅積累和活性氧的產(chǎn)生，顯著降低癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元凋亡[7]。氯碘羥喹能減少海馬鋅水平，抑制腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)元凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇小鼠海馬鋅增多，神經(jīng)元受損，數(shù)量減少，Bcl-2減少，Caspase-9、Caspase-3和Bax增多，Bcl-2/Bax減小，證實(shí)了鋅的神經(jīng)毒性。給予氯碘羥喹后，小鼠海馬鋅明顯減少，神經(jīng)元損傷減輕，數(shù)量增加，Bcl-2增多，Caspase-9、Caspase-3和Bax減少，Bcl-2/Bax增大，提示氯碘羥喹可通過(guò)減少海馬鋅降低鋅毒性，抑制癲癇小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，鋅能抑制GABA合成酶和谷氨酸脫羧酶，阻斷GABAA受體，增加中樞興奮性，誘導(dǎo)癲癇[8]。給予小劑量的鋅能使動(dòng)物出現(xiàn)強(qiáng)直陣攣性抽搐和跳躍等神經(jīng)興奮性表現(xiàn)，誘發(fā)Cav 2.3轉(zhuǎn)基因小鼠癲癇發(fā)作[9]；PRG5基因沉默可通過(guò)增加海馬鋅提高小鼠癲癇易感性[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，癲癇組小鼠海馬鋅增多，自發(fā)性癲癇增多、級(jí)別增加，持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)；給予氯碘羥喹后，海馬鋅減少，自發(fā)性癲癇減少、級(jí)別降低、持續(xù)時(shí)間縮短，提示，氯碘羥喹可通過(guò)減少小鼠海馬鋅抑制自發(fā)性癲癇。分析其原因可能是：一方面，氯碘羥喹通過(guò)減少海馬鋅降低中樞興奮性；另一方面，氯碘羥喹通過(guò)減輕鋅的細(xì)胞毒性，保護(hù)海馬神經(jīng)元，減少因神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致的異常神經(jīng)環(huán)路的形成。

在臨床上，約60%以上的顳葉癲癇患者出現(xiàn)由神經(jīng)元死亡導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，新生大鼠癲癇能導(dǎo)致海馬鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體-1減少、鋅增多，認(rèn)知功能降低[11]。低壓缺氧模型中，鋅在海馬的大量聚集與神經(jīng)元丟失和記憶功能障礙有關(guān)；利用鋅螯合劑Ca2+EDTA能抑制神經(jīng)元損傷，改善空間記憶和聯(lián)想記憶[12]。氯碘羥喹能改善阿爾茲海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[13]；能降低血漿鋅，改善手術(shù)后學(xué)習(xí)記憶障礙[14]。本研究結(jié)果與以上研究相似，癲癇組T迷宮的正確率、Y迷宮達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練次數(shù)和24 h記憶保持率均降低，提示癲癇破壞了小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能；給予氯碘羥喹能顯著改善學(xué)習(xí)記憶功能，分析其可能是通過(guò)螯合鋅離子抑制了神經(jīng)元凋亡和細(xì)胞缺失而發(fā)揮此作用。

氯碘羥喹是治療神經(jīng)退行性疾病的潛在藥物。但是，氯碘羥喹與亞急性脊髓視神經(jīng)病和暫時(shí)性全身性遺忘有關(guān)。小鼠連續(xù)2周腹腔注射30 mg/kg氯碘羥喹即可損傷突觸可塑性和認(rèn)知能力，因此，用藥的安全性及其機(jī)制尚需深入研究。本組前期研究發(fā)現(xiàn)[15]，在制備匹羅卡品小鼠癲癇模型前，連續(xù)腹腔注射小劑量氯碘羥喹1周能顯著減少癲癇海馬鋅，增加神經(jīng)元數(shù)量，降低血清和腦脊液S-100β和NSE蛋白表達(dá)，減輕損傷，縮短逃避潛伏期，延長(zhǎng)目標(biāo)象限滯留時(shí)間，提示氯碘羥喹對(duì)神經(jīng)元和學(xué)習(xí)記憶有保護(hù)作用。但是，動(dòng)物的癲癇發(fā)作率和發(fā)作級(jí)別增高，潛伏期縮短，癲癇易感性增強(qiáng)，分析可能是由氯碘羥喹預(yù)處理造成的海馬低鋅對(duì)匹羅卡品易感而致。因此，本次實(shí)驗(yàn)改進(jìn)給藥劑量和給藥時(shí)機(jī)，采用在癲癇造模后一次性給予中等劑量的氯碘羥喹，結(jié)果證明該給藥劑量和方法安全有效，有效降低了海馬鋅，抑制了小鼠自發(fā)性癲癇發(fā)作，降低發(fā)作級(jí)別、發(fā)作次數(shù)和發(fā)作持續(xù)時(shí)間，保護(hù)了小鼠海馬神經(jīng)元，抑制其細(xì)胞損傷與凋亡，提高了學(xué)習(xí)記憶功能。