哮喘易感基因多態(tài)性與支氣管哮喘患兒的IgE水平及嗜酸性粒細胞水平關(guān)系的研究

張小寧 張向峰 張志英 靳秀紅

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

支氣管哮喘是一種與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病，與多基因遺傳有關(guān)，兒童中常見，嚴重威脅兒童的身體健康。有研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素-13（IL-13）基因的rs20541位點、IL-4基因的rs2243250位點、β2腎上腺素受體（ADRB2）基因的rs1042713位點、免疫球蛋白E（IgE）高親和力受體1β（FCER1B）基因的rs569108位點，細胞色素P450家族3亞家族A肽5（CYP3A5）基因的rs776746位點、花生四烯酸5脂氧合酶（ALOX5）基因的rs2115819位點、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1（GLCCI1）基因的rs37973位點、IgE低親和力受體II（FCER2）基因的rs28364072位點、白三烯C4合成酶（LTC4S）基因的rs730012位點、腺苷酸環(huán)化酶9（ADCY9）基因的rs2230739位點、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素受體2（CRHR2）基因的rs7793837位點、T-BOX轉(zhuǎn)錄因子21（TBX21）基因的rs2240017與兒童支氣管哮喘的發(fā)生有關(guān)[1-5]。IgE是介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)的主要抗體，同時也是反應(yīng)支氣管哮喘患兒氣道炎癥的重要指標(biāo)，過敏原與IgE結(jié)合后誘發(fā)肥大細胞釋放組胺，并產(chǎn)生前列腺素D2、半胱氨酸白三烯（LTC4、LTD4和LTE4）等，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)。嗜酸性粒細胞是變態(tài)反應(yīng)中的重要細胞，在T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子IL-5的作用下增殖和活化，并在氣道黏膜內(nèi)聚集，表達多種細胞因子受體，釋放多種炎性介質(zhì)，激發(fā)氣道炎癥反應(yīng)。因此，嗜酸性粒細胞水平是反應(yīng)支氣管哮喘患兒氣道炎癥的重要指標(biāo)。本研究中探討了支氣管哮喘患兒上述基因位點不同基因型與IgE水平及嗜酸性粒細胞水平的關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會審核通過。以2018年10月—2020年10月在河南省兒童醫(yī)院門診就診的270例支氣管哮喘患兒作為研究對象，其中男142例，女128例；年齡4個月～11歲，平均（35.83±26.52）月，所有患兒均依據(jù)文獻[6]中的相關(guān)標(biāo)準診斷為支氣管哮喘，排除合并貧血、自身免疫缺陷性疾病、嚴重臟器功能不全及有近30 d內(nèi)糖皮質(zhì)激素治療史的患兒。所有患兒家屬均簽署了本研究的知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 IgE水平的檢測 采集外周靜脈血2 mL，以EDTA抗凝，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行檢測。

1.2.2 外周血嗜酸性粒細胞的檢測 取外周靜脈血2 mL于普通促凝管中，4 000 r/min 離心5 min，制備血清，應(yīng)用全自動五分類血液分析儀進行檢測。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測 采用口腔拭子核酸提取方法。采樣前30 min清水漱口或清潔口腔，至采樣期間勿飲食。將采樣拭子小心伸入口腔左側(cè)內(nèi)腮處，不要觸及牙齒或舌，上下劃動采樣拭子，力度以面部腮部微凸為準，以一上一下為1次，10次后，將采樣拭子旋轉(zhuǎn)180°，再刮10次。取出采樣拭子，注意不要觸及牙齒、舌頭及其他任何物體，將拭子伸入裝有DNA保存液的離心管（由上海解碼醫(yī)學(xué)檢驗所提供）中，在刷柄的凹陷處將多余部分折斷，使刷頭留在離心管中，將蓋子擰緊。重復(fù)上述步驟采集右側(cè)內(nèi)腮處樣本，由上海解碼醫(yī)學(xué)檢驗所采用MassARRAY?DNA質(zhì)譜分析系統(tǒng)進行上述基因位點的基因多態(tài)性檢測。Massarray飛行時間質(zhì)譜方法基因分型采用iPLEX PCR反應(yīng)試劑盒，96-well SpectroCHIP生物芯片，HOTSTART Taq酶，蝦堿性磷酸酶（SAP酶），陽離子交換樹脂（均購自美國Agena Bioscience公司）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSSl7.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的定量資料采用表示，不服從正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25,P75）]表示。每個基因位點的3種基因型間IgE水平及嗜酸性粒細胞水平的差異采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因型檢測結(jié)果 在270例研究對象中，以下位點均可檢出3種基因型：rs20541位點檢出AA、AG、GG型；rs2243250位點檢出CC、CT、TT型；rs1042713位點檢出AA、AG、GG型；rs569108位點檢出AA、AG、GG型；rs776746位點檢出CC、CT、TT型；rs2115819位點檢出AA、AG、GG型；rs37973位點檢出AA、AG、GG型；rs28364072位點檢出AA、AG、GG型；rs730012位點檢出AA、AC、CC型；rs2230739位點檢出CC、CT、TT型；rs7793837位點檢出AA、AT、TT型；rs2240017位點檢出CC、CG、GG型。其中rs28364072位點3種基因型的飛行時間質(zhì)譜圖見圖1。各位點基因多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。

圖1 rs28364072位點3種基因型的飛行時間質(zhì)譜圖

2.2 各位點不同基因型患兒間IgE水平差異rs28364072位點基因3種基因型患兒間IgE水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），GG基因型患兒IgE水平高于其他2種基因型（表1）。其余位點不同基因型間IgE水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.3 上述各位點基因型患兒間嗜酸性粒細胞水平差異 上述各位點基因間嗜酸性粒細胞水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

表1 支氣管哮喘易感基因不同基因型患兒間IgE水平及嗜酸性粒細胞水平比較[M（P25, P75）]

3 討 論

支氣管哮喘是一種多基因遺傳相關(guān)性疾病，有研究發(fā)現(xiàn)，ADRB2、GLCCI1與哮喘的嚴重程度和呼吸道重塑有關(guān)；FCER1B基因、IL-13基因與哮喘的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)；IL-4主要參與IgE合成與Th2細胞分化，并促進嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞及肥大細胞發(fā)育。CYP3A5基因被認為可以作為發(fā)現(xiàn)早期階段哮喘的血液生物標(biāo)志物；ALOX5、LTC4S和孟魯司特鈉的應(yīng)答相關(guān)；FCER2、GLCCI1、ADCY9、TBX21基因和吸入性糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答相關(guān)；CRHR2基因與沙丁胺醇的應(yīng)答相關(guān)。本研究中未發(fā)現(xiàn)除FCER2基因以外其他上述基因不同基因型間IgE水平有差異[1-5]。Amo等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在變應(yīng)性鼻炎患者中，F(xiàn)CER1B基因的rs569108位點變異等位基因患者較野生型患者IgE水平低，但在變應(yīng)性鼻炎合并支氣管哮喘的情況下，rs569108位點變異等位基因患者較野生型患者IgE水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另一項研究發(fā)現(xiàn)，rs569108位點基因多態(tài)性可能影響支氣管哮喘的發(fā)病風(fēng)險，但在整個人群中沒有發(fā)現(xiàn)rs569108位點基因多態(tài)性與支氣管哮喘有明顯的相關(guān)性[8]。本研究中rs569108位點不同基因型間IgE水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，rs569108位點與IgE水平及支氣管哮喘的關(guān)系還需要更大樣本量作進一步研究。Bai等[1]報道了基于IL-13基因的rs20541位點、IL-4基因的rs2243250位點、ADRB2基因的rs1042713位點、FCER1B基因的rs569108位點建立了漢族兒童支氣管哮喘易感基因預(yù)測模型，在這一模型基礎(chǔ)上的支氣管哮喘高危組臍血總IgE水平較低危組更高。但在本研究中上述4個位點不同基因型間IgE水平無明顯差異，可能與納入的研究對象不同有關(guān)，本研究納入對象全部為支氣管哮喘患兒。

FCER2基因位于第19號染色體，其11個外顯子中的第9、10、11外顯子負責(zé)編碼FCER2受體與LgE結(jié)合。有研究報道FCER2基因多態(tài)性與IgE水平及支氣管哮喘發(fā)作嚴重程度相關(guān)[9-10]。本研究中rs28364072位點GG基因型較其他兩種基因型IgE水平高；這一基因型可增加支氣管哮喘難控風(fēng)險。一項針對支氣管哮喘患兒皮質(zhì)類固醇反應(yīng)不良預(yù)測因素的研究發(fā)現(xiàn)，這種基因型兒童支氣管哮喘復(fù)發(fā)和急性加重的風(fēng)險較AA基因型兒童高3.3倍和3倍，肺功能差的風(fēng)險比AA基因型兒童高9倍[11]。另一項關(guān)于兒童支氣管哮喘的藥物遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CER2基因rs28364072位點GG基因型患兒與支氣管哮喘相關(guān)的住院風(fēng)險增加，支氣管哮喘失控風(fēng)險增加，類固醇劑量增加[12]。據(jù)此推測，rs28364072位點GG基因型可能通過增加IgE水平而增加支氣管哮喘難控風(fēng)險。

調(diào)查表明，盡管積極使用常規(guī)抗支氣管哮喘藥物（包括白三烯拮抗劑、皮質(zhì)類固醇、長效腎上腺素能激動劑等）治療，但仍有高達60%的支氣管哮喘患兒病情未得到很好的控制[13]。IgE是介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)的主要抗體，同時也是反應(yīng)支氣管哮喘患兒氣道炎癥的重要指標(biāo)。研究表明，IgE水平與支氣管哮喘的嚴重程度及支氣管哮喘臨床癥狀有關(guān)[14]。IgE主要通過與高親和力受體FCER1和低親和力受體FCER2（CD23）這兩個細胞受體的相互作用來發(fā)揮其致病作用。發(fā)生超敏反應(yīng)時，IgE與FCER1結(jié)合，能夠活化肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞，這些細胞分泌大量細胞因子，引起更高的氣道反應(yīng)性，患者出現(xiàn)喘息癥狀。IgE的低親和力受體CD23通過向T細胞呈遞變應(yīng)原、調(diào)節(jié)IgE反應(yīng)和增強經(jīng)皮變應(yīng)原遷移而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[15]。CD23是Ⅱ型膜糖蛋白，它的羥基末端由C型凝集素頭組成，以鈣依賴性方式結(jié)合IgE。雖然CD23單體對IgE的親和力較低，但膜結(jié)合的CD23可以形成三聚體，允許CD23對IgE形成高親和力。有研究表明，在人氣道上皮細胞表達的CD23可以通過胞吞作用，將IgE或抗原-IgE免疫復(fù)合物透過氣道上皮細胞形成物理屏障在氣道上皮層間轉(zhuǎn)運[16]。CD23影響IgE系統(tǒng)和參與免疫調(diào)節(jié)，作為細胞因子和信號受體，是治療干預(yù)的重要靶點。近年來，抗IgE療法藥物（如奧馬珠單抗）被批準為新的抗炎治療藥物。奧馬珠單抗通過阻斷IgE與CD23受體結(jié)合，改善重癥支氣管哮喘患兒的哮喘癥狀，并且能夠改善未控制支氣管哮喘患兒的臨床癥狀[13,17]。CD23在調(diào)節(jié)支氣管哮喘患者IgE反應(yīng)中起重要作用，而CD23是由FCER2基因編碼，F(xiàn)CER2基因多態(tài)性篩選可能有助于預(yù)測患者對抗IgE療法的治療反應(yīng)。

嗜酸性粒細胞參與變態(tài)反應(yīng)，其被激活后聚集于氣道黏膜，表達細胞因子受體，釋放多種炎性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道炎癥。有研究發(fā)現(xiàn)，中、重度支氣管哮喘患者血液中嗜酸性粒細胞計數(shù)升高可能導(dǎo)致病情加重[18]。但也有研究顯示，支氣管哮喘嚴重程度與嗜酸性粒細胞水平?jīng)]有相關(guān)性[19]。陳玲等[20]的研究也顯示，雖然與正常兒童比較，支氣管哮喘患兒嗜酸性粒細胞水平升高，但其并不能反映病情的進展?fàn)顩r。本研究中未發(fā)現(xiàn)上述基因多態(tài)性與支氣管哮喘患兒的嗜酸性粒細胞水平有關(guān)。嗜酸性粒細胞水平在判斷支氣管哮喘患兒嚴重程度方面的價值及與支氣管哮喘基因多態(tài)性的關(guān)系方面仍需要進一步的研究。

綜上，F(xiàn)CER2基因的rs28364072位點GG基因型支氣管哮喘患兒IgE水平較其他2種基因型高，F(xiàn)CER2基因多態(tài)性篩選可能有助于預(yù)測患者對抗IgE療法的治療反應(yīng)。嗜酸性粒細胞水平在判斷支氣管哮喘患兒嚴重程度方面的價值及與支氣管哮喘基因多態(tài)性的關(guān)系仍需要進一步的研究。