超臨界CO2提取葛縷子精油及其成分分析

龐 敏 崔秀明

(1. 上海杉達(dá)學(xué)院，上海 200120；2. 華寶香精股份有限公司，上海 201800)

葛縷子(CarumcarviL.)又稱藏茴香，具有特色香味，其籽中精油含量為3%～6%[1]，具有抑菌[2-3]、抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6]、助消化[7]等作用，可作為天然防腐劑和抗氧化劑。目前，有關(guān)葛縷子精油的提取方法主要有傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾提取[8]、超聲波輔助—鹽析—蒸餾法[9-11]、微波輔助蒸餾提取[12]，這類方法效率偏低，長(zhǎng)時(shí)間的高溫操作會(huì)導(dǎo)致熱敏性成分分解和損失，此外也有學(xué)者[13]采用索式提取等以溶劑浸提為基礎(chǔ)的提取方法，這類方法得到的精油成分較復(fù)雜、得率較低、有溶劑殘留。由于天然產(chǎn)物的獨(dú)特性質(zhì)以及人類對(duì)環(huán)境健康的要求日益嚴(yán)格，超臨界CO2提取技術(shù)逐漸受到重視，CO2不易燃，無(wú)毒無(wú)味，且無(wú)殘留，近年來(lái)被應(yīng)用于山茶油[14]、牡丹籽油[15]、蠶蛹油脂[16]、蘋果多酚[17]的提取中。文章擬對(duì)超臨界CO2提取葛縷子精油的工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)對(duì)葛縷子精油成分進(jìn)行分析，并與同時(shí)蒸餾萃取法對(duì)比，為葛縷子的深度開(kāi)發(fā)和精準(zhǔn)加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葛縷子籽粒：產(chǎn)地西藏；

無(wú)水乙醚：分析純，國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司；

正己烷：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司；

CO2氣體：純度99.9%，上海婁氧氣體灌裝有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

離心機(jī)：SL-16型，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

超臨界提取系統(tǒng)：SFE500型，美國(guó)Thar科技公司；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超臨界CO2法提取葛縷子精油工藝流程

葛縷子籽粒→45 ℃干燥5 h→粉碎過(guò)40目篩→超臨界CO2提取→解壓放料→4 000 r/min離心15 min→精油

1.2.2 超臨界提取單因素試驗(yàn)

(1) 提取壓力：固定提取釜溫度50 ℃，分離釜溫度40 ℃，分離釜壓力0.4 MPa，二氧化碳流速15 g/min，提取時(shí)間60 min，考察提取壓力(17，20，25，30，35 MPa)對(duì)葛縷子精油得率的影響。

(2) 提取溫度：固定分離釜壓力0.4 MPa，提取壓力30 MPa， 二氧化碳流速15 g/min，提取時(shí)間60 min，分離釜溫度40 ℃，考察提取溫度(40，45，50，55，60 ℃)對(duì)葛縷子精油得率的影響。

(3) CO2流速：固定提取時(shí)間60 min，提取壓力30 MPa，分離釜壓力0.4 MPa，提取溫度50 ℃，分離釜溫度40 ℃，考察CO2流速(10，15，20，25，30 g/min)對(duì)葛縷子精油得率的影響。

(4) 提取時(shí)間：固定提取壓力30 MPa，提取溫度50 ℃，分離釜溫度40 ℃，分離釜壓力0.4 MPa，CO2流速15 g/min，考察提取時(shí)間(30，60，90，120 min)對(duì)葛縷子精油得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取釜溫度、提取釜壓力、CO2流速、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以精油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定提取工藝。

1.2.4 同時(shí)蒸餾萃取法提取葛縷子精油 按1.2.1粉粹過(guò)篩，取30 g樣品置于同時(shí)蒸餾萃取儀一端的蒸餾燒瓶中，按料液比(m葛縷子∶V蒸餾水)1∶10 (g/mL)加蒸餾水，加熱至沸騰；按料液比(m葛縷子∶V乙醚)1∶4 (g/mL)加入無(wú)水乙醚，置于同時(shí)蒸餾萃取儀的另一端，60 ℃水浴加熱，萃取210 min，將萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得葛縷子精油。

1.2.5 葛縷子精油GC-MS分析

(1) 葛縷子精油前處理：參照文獻(xiàn)[18]。

(2) GC-MS分析色譜柱條件：DB-5MS (60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍33～450 amu，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃。

1.3 葛縷子精油得率計(jì)算

按式(1)計(jì)算葛縷子精油得率。

(1)

式中：

w——葛縷子精油得率，%；

w1——葛縷子精油質(zhì)量，g；

w2——葛縷子原料質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，并采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖；GC-MS分析采用NIST2005譜庫(kù)進(jìn)行檢索，采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取壓力對(duì)葛縷子精油得率的影響 由圖1可知，精油得率隨提取壓力的增大呈升高趨勢(shì)，提取壓力升高，二氧化碳密度逐漸增大，對(duì)物質(zhì)的溶解能力增強(qiáng)，故精油得率逐漸增大。當(dāng)提取壓力為35 MPa時(shí)，精油得率與30 MPa的無(wú)顯著增加，且考慮到設(shè)備要求及生產(chǎn)成本，故選擇提取壓力為30 MPa。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.2 提取溫度對(duì)葛縷子精油得率的影響 由圖2可知，提取溫度升高，精油得率先升高后降低，由于提取溫度對(duì)二氧化碳溶解目標(biāo)物質(zhì)的影響較為復(fù)雜，提取溫度升高，精油在超臨界流體中的溶解度增大，另一方面，等壓條件下，提取溫度升高，二氧化碳密度降低，溶解能力降低，這兩種相反的影響導(dǎo)致一定壓力下，精油溶解度與提取溫度間的關(guān)系曲線會(huì)出現(xiàn)一個(gè)極值點(diǎn)[19]，為滿足得到較高的精油得率，故選擇提取溫度為50 ℃。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 CO2流速對(duì)葛縷子精油得率的影響 由圖3可知，隨著CO2流速的增加，精油得率先升高后逐漸平穩(wěn)，由于CO2流速的大小正比于液料比，流速較小時(shí)，CO2流體中已溶出的精油濃度與顆粒內(nèi)的濃度相差不大，故顆粒內(nèi)的目標(biāo)物質(zhì)難以溶出，所以CO2流速增大，意味著液料比增加，精油得率會(huì)逐漸增加，當(dāng)CO2流速>15 g/min時(shí)，繼續(xù)增大CO2流速并未明顯提高精油得率，考慮到工藝成本，選擇CO2流速為15 g/min。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)葛縷子精油得率的影響 由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，精油得率先升高后逐漸穩(wěn)定，這是因?yàn)樘崛r(shí)間短，二氧化碳與葛縷子顆粒不能深度接觸，難以滲入顆粒內(nèi)部，90 min后，精油大部分已被提取出來(lái)，提取時(shí)間延長(zhǎng)至120 min時(shí)，精油得率與90 min時(shí)無(wú)顯著提高，故選擇提取時(shí)間為90 min。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇提取溫度、提取壓力、CO2流速和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

由表2可知，各因素對(duì)葛縷子精油得率影響的主次順序?yàn)樘崛毫?提取溫度>CO2流速>提取時(shí)間。綜合各因素作用，得到超臨界CO2提取葛縷子精油的最適工藝條件為提取釜溫度50 ℃，提取釜壓力30 MPa，二氧化碳流速20 g/min，提取時(shí)間90 min。

表2 超臨界CO2提取正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)最適提取工藝進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到精油的平均得率為4.79%，均高于單因素組和正交試驗(yàn)組的精油得率，故可確定該組合為最適提取工藝條件。

2.3 與同時(shí)蒸餾萃取比較

由表3可知，超臨界CO2提取葛縷子精油的得率高于同時(shí)蒸餾萃取的，并且提取時(shí)間縮短，這是因?yàn)槌R界技術(shù)通過(guò)提高壓力和溫度，使CO2達(dá)到超臨界流體狀態(tài)，快速擴(kuò)散并能充分溶解分子中的精油成分，從而提高精油得率。

表3 不同提取方法的比較

2.4 葛縷子精油成分GC-MS分析

由表4可知，超臨界CO2法制備的精油中揮發(fā)性成分種類更多，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>0.01%的有22種，同時(shí)蒸餾萃取法的為14種。兩種方法制備的葛縷子精油中主要成分均為D-檸檬烯和香芹酮，超臨界CO2法中二者占精油成分總質(zhì)量的97.61%，同時(shí)蒸餾萃取中二者占精油成分總質(zhì)量的92.12%。與超臨界CO2法相比，同時(shí)蒸餾萃取法制備的精油中有12種揮發(fā)性成分含量均存在不同程度的下降，可能是由于制備過(guò)程中存在的熱處理導(dǎo)致了揮發(fā)性成分的分解與損失，由此推斷，超臨界CO2法比同時(shí)蒸餾萃取法更適合葛縷子精油的提取。

表4 葛縷子精油成分GC-MS分析

葛縷子精油中的D-檸檬烯具有新鮮橙子香氣及檸檬樣香氣，可作為修飾劑用于食用香精配方[20]，此外還具有抑菌[21]、抗腫瘤[22]作用，也是合成萜醇類物質(zhì)的基礎(chǔ)原料。香芹酮具有清涼和特有的芳香甜味，有抑菌作用，也可抑制馬鈴薯發(fā)芽[23]；α-蒎烯和β-蒎烯為同分異構(gòu)體，二者均存在于多種天然精油中，α-蒎烯具有松木和松節(jié)油香氣[24]，感官閾值很低，香氣明顯，微量可用于調(diào)配薰衣草、香葉等日用香精和肉豆蔻、柑橘等食用香精，也可用于合成松油醇、香葉醇、芳樟醇等一些檀香型香料；β-蒎烯與α-蒎烯類似，也具有松木和樹(shù)脂樣香氣。β-水芹烯具有柑橘和胡椒香氣[25]，可用于調(diào)配柑橘、辛香等香型的食用香精，β-羅勒烯具有花香、藥草香和甜香[26]，檸檬醛具有濃郁的檸檬香氣，這些不同成分的協(xié)同作用使葛縷子精油具有清甜香型和良好的抗菌活性，可用于醫(yī)藥、農(nóng)藥[27-28]、食品添加劑和精細(xì)化工領(lǐng)域，具有較好前景。

3 結(jié)論

以葛縷子籽粒為原料，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超臨界CO2提取葛縷子精油的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，超臨界CO2提取葛縷子精油的最佳工藝條件為提取釜溫度50 ℃，分離釜溫度40 ℃，提取釜壓力30 MPa，分離釜壓力0.4 MPa，二氧化碳流速20 g/min，提取時(shí)間90 min，此條件下精油得率為4.79%，與同時(shí)蒸餾萃取法相比，其精油得率提高，說(shuō)明此方法能使CO2達(dá)到超臨界流體狀態(tài)，快速擴(kuò)散到樣品顆粒中并充分溶解精油成分，具有提取時(shí)間短、無(wú)溶劑殘留的優(yōu)點(diǎn)，可避免長(zhǎng)時(shí)間高溫條件下導(dǎo)致的活性物質(zhì)分解，是一種較為理想的制取葛縷子精油的方法。

經(jīng)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，與同時(shí)蒸餾萃取法相比，超臨界CO2法制備的葛縷子精油中所含揮發(fā)性成分含量高，種類豐富，主要成分為烯烴類和酮類化合物，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是D-檸檬烯(50.96%)，其次為香芹酮(46.65%)。不同成分的協(xié)同作用使葛縷子精油具有特色清甜香味和抑菌活性，在此基礎(chǔ)上可將葛縷子精油進(jìn)一步分離提純，將各組分按其功效用途應(yīng)用到風(fēng)味食品、日化加工、醫(yī)藥和農(nóng)藥等產(chǎn)品中，以擴(kuò)展葛縷子精油精準(zhǔn)加工的途徑和范圍。