擠壓處理對豌豆蛋白功能特性及結構的影響

張百汝 王 斌 王 琨 董宇晴 崔 波

(1. 齊魯工業(yè)大學〔山東省科學院〕生物基材料及綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南 250353；2. 齊魯工業(yè)大學〔山東省科學院〕食品科學與工程學院，山東 濟南 250353)

豌豆是世界重要的栽培作物之一，富含人體所需要的各種全面而均衡的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。豌豆蛋白作為豌豆主要組分之一，占比23%～25%，富含賴氨酸，含有人體所需的18種氨基酸，屬于全價蛋白質(zhì)[2-3]。與動物蛋白相比，豌豆蛋白不含膽固醇，致敏性低，還具有降低糖尿病和心腦血管疾病風險的作用[4]。目前，豌豆蛋白作為副產(chǎn)物并未得到有效的精深加工，造成了蛋白資源的浪費[5]。另外豌豆蛋白起泡性和乳化性等功能特性較差，也限制了其在食品工業(yè)中的應用[6]。隨著蛋白質(zhì)需求的增大，越來越多的研究者采用不同的改性方法對豌豆蛋白進行了深入研究，以此來提高豌豆蛋白的功能性質(zhì)[7-8]。

目前，針對蛋白質(zhì)的改性方法主要有物理法、化學法和酶法，最常用的是物理改性。物理改性主要是通過擠壓[9]、高壓均質(zhì)[10]和超聲[11]等方法來破壞蛋白質(zhì)的結構，達到改善蛋白質(zhì)功能特性的目的。其中，擠壓技術是一種高溫短時的加工技術，具有高生產(chǎn)率、低成本、無污染和多功能性等優(yōu)點[9]。在擠壓過程中，物料受到高溫、高壓和剪切力的作用，其結構會發(fā)生變化，從而改變蛋白質(zhì)的功能特性。沈?qū)幍萚12]采用雙螺桿擠壓確定了大豆蛋白的最佳工藝，擠壓溫度150 ℃，水分含量45%，證實了擠壓溫度對蛋白質(zhì)消化率的影響大于水分含量；趙學偉等[13]研究了小米蛋白在不同溫度和物料水分條件下擠壓后蛋白質(zhì)溶解度的變化，擠壓后溶解度下降，并表明疏水相互作用和二硫鍵是溶解度下降的主要原因；Beck等[14]采用低水分含量擠壓成功制備了豌豆分離蛋白膨化產(chǎn)品，膨化指數(shù)可達13；Palanisamy等[15]研究表明，利用羽扇豆蛋白生產(chǎn)高水分擠壓肉類類似物是可行的，可以滿足消費者的需求。但國內(nèi)外對豌豆蛋白的擠壓加工研究較少，且僅單一研究中低水分含量(≤40%)或者高水分含量(>40%)對其影響。研究擬通過改變物料含水量(質(zhì)量分數(shù)40%～60%)來探究擠壓處理對豌豆蛋白色度、持水性、乳化特性、微觀結構和二級結構的影響，旨在為豌豆蛋白改性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豌豆蛋白：蛋白含量82.1%(以干基計)，山東煙臺雙塔食品股份有限公司；

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

溴化鉀：光譜純，上海麥克林生化科技有限公司；

大豆油：金龍魚，益海糧油工業(yè)有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

雙螺桿擠壓試驗機：SLG35-A型，濟南大億機械有限公司；

水分測定儀：HE53/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

全自動測色色差計：ADCI-60-C型，北京辰泰克儀器技術有限公司；

高速低溫離心機：CR21N型，日本Hitachi公司；

高速分散均質(zhì)機：FJ200型，上海滬析實業(yè)有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-6100型，上海元析儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：Fei Quanta 200型，美國FEI公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Frontier型，美國PerkinElmer公司；

熒光光度計：F-2700型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 豌豆蛋白擠出物制備 稱取一定質(zhì)量的豌豆蛋白加蒸餾水調(diào)節(jié)含水量分別為40%，50%，60%(質(zhì)量分數(shù)，以蛋白質(zhì)干基計)，放置24 h平衡水分，設置擠壓條件，主機螺桿轉速300 r/min，喂料區(qū)螺桿轉速200 r/min，擠壓溫度從第一區(qū)到第五區(qū)分別為175，140，120，100，60 ℃。擠壓處理后的樣品于熱風干燥箱中55 ℃烘干至恒重，研磨成粉，過80目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 色度的測定 參照文獻[16]，用全自動色差計測量豌豆蛋白及其擠出物的色度。+a表示紅色，-a表示綠色，+b表示黃色，-b表示藍色，L表示顏色的明亮度，L值越大，表示擠出物越明亮。色差計用標準白瓷板校準，校準值分別為L*=91.68，a*=8.27，b*=4.33。通過式(1)計算總色差。

(1)

式中：

1.2.3 持水性的測定 參照文獻[17]，準確稱取1.000 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL去離子水，磁力攪拌10 min，分散均勻，室溫下靜置40 min使樣品充分持水，然后4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，將管內(nèi)的水吸干，稱量離心管與沉淀的總重量，按式(2)計算持水性(Water Holding Capacity，WHC)。

(2)

式中：

WHC——樣品持水性，g/g；

m——樣品質(zhì)量，g；

m1——離心管與樣品的質(zhì)量，g；

m2——離心后離心管與沉淀的質(zhì)量，g。

1.2.4 乳化特性的測定 參照文獻[18]，準確稱取豌豆蛋白及其擠出物樣品0.300 g于100 mL燒杯中，加入30 mL 蒸餾水，磁力攪拌10 min使樣品充分分散，加入10 mL大豆油，高速均質(zhì)機10 000 r/min均質(zhì)2 min。在均質(zhì)完成后的0 min和10 min，分別從燒杯底部吸取50 μL 溶液(在相同位置)用5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液稀釋，以SDS溶液為空白，稀釋液立即振蕩并測量樣品在500 nm處的吸光度。分別按式(3)和式(4)計算乳化活性(Emulsification Activity Index，EAI)和乳化穩(wěn)定性(Emulsion Stability Index，ESI)。

(3)

(4)

式中：

EAI——乳化性，m2/g；

ESI——乳化穩(wěn)定性，min；

N——稀釋倍數(shù)，101；

A0——均質(zhì)0 min時乳液的吸光度；

A10——均質(zhì)完成后10 min時乳液的吸光度；

C——乳狀液形成前豌豆蛋白的濃度，g/mL；

Φ——乳狀液中油相所占體積，1/4；

ΔT——10 min。

1.2.5 掃描電子顯微鏡 參照文獻[19]，將擠壓的新鮮樣品切成薄片，用導電膠將樣品固定在樣品臺上，表面進行噴金處理，于500倍下觀察樣品的微觀結構。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜 參照文獻[20]，取研磨過后的樣品和干燥溴化鉀于石英研缽中研磨并壓片，m樣品∶m溴化鉀=1∶100，掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為16次，分辨率為4 cm-1。利用OMNIC 8.0軟件對紅外圖譜進行傅里葉去卷積。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 20.0軟件中的Duncan法進行數(shù)據(jù)的差異性分析，Origin 8.5作圖，PeakFit v4.12進行高斯峰的擬合計算二級結構中各組分含量。

2 結果與分析

2.1 色差分析

擠壓過程中含水量對豌豆蛋白顏色指數(shù)L*、a*、b*和ΔE的影響如表1所示。色澤可以反映擠壓過程中的化學反應和營養(yǎng)變化程度。結果表明，豌豆蛋白原料的L*、a*和b*分別為81.01，17.19，29.77，擠出物明亮度L*顯著下降(P<0.05)，其范圍為76.56～81.01，a*和b*值顯著上升(P<0.05)，分別為17.19～18.33和29.77～31.18。豌豆蛋白原料及其擠出物的綜合色差ΔE無顯著差異(P>0.05)，表明豌豆蛋白經(jīng)過擠壓處理仍可以保持較好的產(chǎn)品色澤。

表1 擠壓前后豌豆蛋白色度變化?

當含水量從40%增加至50%時，亮度值L*逐漸增加，當含水量增加到60%時，亮度值顯著下降(P<0.05)。說明含水量為40%和50%時可以生產(chǎn)出更明亮的產(chǎn)品，但過高的含水量(60%)不利于產(chǎn)品的亮度。豌豆蛋白擠出物的亮度下降是由于游離氨基與還原糖發(fā)生美拉德反應引起的[21]。Wang等[22]研究結果顯示含水量對豌豆蛋白擠出物色澤的影響與其褐變程度有關，是因為溫度和濕度對豌豆蛋白產(chǎn)品的非酶促褐變有影響，這些產(chǎn)品中含有大量的蛋白質(zhì)和可溶性碳水化合物。Jebalia等[23]的研究有相似結果，豌豆基淀粉—蛋白共混物擠壓后的L*低于原材料，這一現(xiàn)象是美拉德反應導致的。

2.2 持水性

由圖1可知，擠壓處理后豌豆蛋白的持水性顯著下降(P<0.05)，但含水量對持水性無顯著影響(P>0.05)。蛋白質(zhì)的持水性是蛋白質(zhì)功能特性的一種，是指干燥蛋白質(zhì)直接與水作用時保持水分的能力，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)分子物理截留[24]。在擠壓處理過程中，豌豆蛋白經(jīng)加熱，發(fā)生變性，由原本不規(guī)則的和體積較小的顆粒態(tài)變成熔融狀態(tài)。該狀態(tài)下，蛋白質(zhì)天然網(wǎng)絡結構被破壞，蛋白質(zhì)完全變性，物料在高壓作用下隨著螺桿運動的方向向前移動，豌豆蛋白形成蛋白質(zhì)聚集體，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的縫隙被壓縮，形成了具有較少氣孔狀態(tài)的致密結構。當?shù)鞍踪|(zhì)與水直接作用時，水分子較難進入，蛋白質(zhì)分子物理截留作用下降，持水性下降[25-26]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 乳化特性

豌豆蛋白和豌豆蛋白擠出物的EAI和ESI的變化如圖2所示。擠壓處理后，豌豆蛋白的EAI和ESI顯著上升(P<0.05)。這主要是因為在擠壓處理過程中，高溫和剪切力會破壞維持蛋白質(zhì)的次級鍵，蛋白質(zhì)變性伸展，多肽鏈被解聚成小分子肽和游離氨基酸[9]。在擠壓機內(nèi)，蛋白質(zhì)重新定向排列，蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)之間相互作用，形成蛋白質(zhì)聚集體[27]。在高速均質(zhì)過程中，蛋白質(zhì)聚集體受到高剪切力的破壞變成小分子物質(zhì)，使得原先包裹在蛋白質(zhì)聚集體內(nèi)部的疏水性基團暴露出來，并與脂肪分子結合，親水性基團與水分子結合，從而形成一層薄膜覆在脂肪球表面，形成一個穩(wěn)定的水包油體系，從而提高了豌豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性[28]。當含水量為40%時，蛋白質(zhì)在高溫作用下變性較大，暴露出更多的疏水性基團，因此EAI增大；當含水量為60%時，物料與物料、物料與機筒的摩擦減少，豌豆蛋白在擠壓機內(nèi)的停留時間減少[29]，蛋白質(zhì)變性較小，疏水性基團數(shù)量減少，EAI和ESI均減小。Bueno等[28]研究表明，擠壓蒸煮會造成蛋白質(zhì)的部分熱變性，從而提高了大豆分離蛋白和果膠共混物的乳化特性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 掃描電子顯微鏡

如圖3所示，豌豆蛋白原料呈明顯的顆粒狀態(tài)，大小和形狀不規(guī)則，其表面或光滑，或有凹陷[30]。經(jīng)過擠壓處理后，豌豆蛋白由顆粒狀態(tài)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)且形狀發(fā)生明顯變化，表面凹凸感增強，且有氣孔結構出現(xiàn)。在擠壓過程中，物料在機筒內(nèi)熔融，在高溫高壓下向前運動，在?？谔帨囟群蛪毫眲〗档?，物料中的水分迅速汽化，因而會形成明顯的氣孔結構[31]。當含水量為40%時，豌豆蛋白擠出物表面的氣孔數(shù)量最少，且分布極不均勻。隨著含水量的增加，氣孔數(shù)量不斷增加，分布較為均勻。當含水量為50%時，氣孔形成蜂窩狀結構。

A. 原料 B、C、D. 物料含水量分別為40%，50%，60%時制備的樣品

2.5 傅里葉變換紅外光譜

如圖4所示，隨著含水量的增加，擠壓處理后蛋白質(zhì)未產(chǎn)生新的特征吸收峰。在3 600～3 100 cm-1范圍內(nèi)，所有樣品均出現(xiàn)一寬峰，主要是—OH、—NH和—CH的伸縮振動引起的；在2 925 cm-1附近均出現(xiàn)一個尖峰，主要是由飽和C上的—CH伸縮振動引起的[32]。

A. 原料 B、C、D. 物料含水量分別為40%，50%，60%時制備的樣品

從表2可以看出，豌豆蛋白主要是以β結構形式存在的，Jackson等[33]和Carbonaro等[34]證實了由β結構組成的聚集體是穩(wěn)定構象。豌豆分離蛋白經(jīng)過擠壓處理后，β-折疊結構含量由未擠壓的47.91%減少到40.91%，且隨著含水量的減少而減少，β-轉角含量由24.76%增加到30.95%，無規(guī)卷曲含量由12.24%增加到14.76%，α-螺旋含量由15.09%減少到12.99%，說明在擠壓過程中，β-折疊和α-螺旋是向β-轉角和無規(guī)卷曲結構轉變的。在高溫加熱過程中，由于蛋白質(zhì)變性，存在于其分子內(nèi)部的氫鍵斷裂，蛋白質(zhì)發(fā)生解螺旋，所以α-螺旋含量下降。同時，蛋白質(zhì)解螺旋后，蛋白質(zhì)結構由有序趨向于無序，無規(guī)卷曲含量上升。β-折疊含量下降主要是因為擠壓處理形成的蛋白質(zhì)聚集體，使得變性后暴露的疏水性基團被覆蓋。

表2 擠壓處理前后豌豆蛋白二級結構組分含量變化

3 結論

擠壓加工技術是一種適用性高、成本低、應用范圍廣的物理改性手段。豌豆蛋白經(jīng)過擠壓處理后，保持了產(chǎn)品原有的色澤，持水性下降，乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著提高，形成了蛋白質(zhì)聚集體，結構穩(wěn)定性增強。因此，擠壓處理可以有效改善豌豆蛋白的理化特性。為了探究豌豆蛋白擠壓機理，有必要進一步研究擠壓溫度和螺桿轉速對蛋白質(zhì)理化特性和結構的影響。