EIF4A3結(jié)合并穩(wěn)定基質(zhì)金屬蛋白酶11促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程

韓思靜 賀丹 李昌平

1西南醫(yī)科大學(xué)（四川瀘州646000）；2成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院（成都610000）；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（四川瀘州646000）

結(jié)直腸癌現(xiàn)已成為全球第四高病死率的癌癥，遺傳、飲食習(xí)慣、肥胖、吸煙等多種因素都與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)［1］。結(jié)直腸癌的治療方案主要以手術(shù)切除聯(lián)合化療為主，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，局部手術(shù)治療、靶向療法和免疫治療也為患者帶來了新的福音，大幅提高結(jié)直腸癌晚期患者的總生存期。但即便如此，由于結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制不明確、診斷不及時等原因?qū)е陆Y(jié)直腸癌的治療形勢依舊十分嚴(yán)峻。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）介導(dǎo)基質(zhì)結(jié)締組織和基底膜成分的降解，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）過程中發(fā)揮重要作用［2-5］。MMP11 是MMP 家族蛋白的一員，有研究報(bào)道MMP11 在胃癌［6］、乳腺癌［3］、結(jié)直腸癌［7］、膀胱癌［8］、卵巢癌［9］中高表達(dá)，并且在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)敲除MMP11 能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲［10］。這些研究都表明MMP11 在癌癥中作為促癌因子發(fā)揮作用，故MMP11 具有作為癌癥治療靶點(diǎn)的潛力。但是MMP11 在結(jié)直腸癌中的研究主要集中在MMP11 與結(jié)直腸癌患者預(yù)后、臨床特征之間的相關(guān)性上［7］。因此需要深入研究MMP11 在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機(jī)制，為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的策略和思路。

1 材料和方法

1.1 試劑及材料DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、TRIzolRNA 分離試劑、全蛋白裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBRGreen 試劑盒均購自Thermo Fisher Scientific（中國）；放線菌素D購自范德（北京）生物科技有限責(zé)任公司；MMP11兔多抗、EIF4A3 兔單抗、Vimentin 兔單抗、N-cadherin 兔單抗、E-cadherin 兔單抗、GAPDH 兔單抗以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG 二抗均購自Abcam。

1.2 細(xì)胞系和組織正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞（FHC）和人結(jié)直腸癌細(xì)胞（SW480、HCT15、DLD1 和SW620）均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保種。將FHC、SW480、SW620 置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基中，HCT15、DLD1 在含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中在37 ℃、5% CO2，無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

獲取成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院核工業(yè)四一六醫(yī)院2019年4～8月進(jìn)行手術(shù)切除的20 例結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁組織（其中男10 例，女10 例，T1-T2 期樣本1 例，T3-T4 期樣本19 例，6 例不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，14 例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，11 例不存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，9 例存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移），組織采集后立馬保存在液氮中。組織采集已征得患者和家屬知情同意，并報(bào)告醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.3 方法

1.3.1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個可用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)的網(wǎng)站，通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)直腸癌患者中TOP25 高表達(dá)基因，和MMP11 在結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）患者中的表達(dá)水平。GEPIA2（http：//gepia2.cancerpku.cn/#index）是一個基于TCGA 和GTEx 項(xiàng)目人癌癥基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)庫，通過GEPIA2 數(shù)據(jù)庫查詢MMP11 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平。ENCORI（http：//starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php）是 一 個大型包含miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA、RBPRNA 和RNA-RNA 相互作用的在線網(wǎng)站，并包含了mRNA 和miRNA 在癌癥中表達(dá)水平及相關(guān)性的數(shù)據(jù)庫，通過ENCORI 查詢MMP11 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及MMP11 mRNA 能和真核翻譯起始因子4A3（EIF4A3）蛋白結(jié)合可能性。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組從上海生工購買si-EIF4A3、pEGFP1 載體構(gòu)建pEGFP1-EIF4A3 和pEGFP1-MMP11 重組質(zhì)粒及其陰性對照。將HCT15 細(xì)胞隨機(jī)分成陰性對照組、EIF4A3抑制組、EIF4A3過表達(dá)對照組、EIF4A3 過表達(dá)組、EIF4A3 抑制+MMP11 過表達(dá)對照組和EIF4A3 抑制+MMP11 過表達(dá)組。轉(zhuǎn)染前一晚將0.8 × 106個細(xì)胞接種在35 mm 培養(yǎng)皿中，等細(xì)胞到達(dá)對數(shù)生長期時，根據(jù)參考說明書使用LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美國）向各處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對應(yīng)的siRNA、重組載體和對照。

1.3.3 mRNA 半衰期測定將si-EIF4A3 及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染到HCT15 和DLD1 細(xì)胞中，24 h 后加入10 μg/mL 的放線菌素D，并在0、3、6、9、12 h 后提取細(xì)胞中總RNA，檢測MMP11 mRNA的表達(dá)量。

1.3.4 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）將各組細(xì)胞用預(yù)冷的IP buffer 裂解液在冰上裂解30 min 后，4 ℃，12 000 rpm 離心15 min 后，取上清液分裝在兩個離心管中，加入Protein A/G 4 ℃孵育過夜。離心取上清，分別加入EIF4A3 和IgG 抗體4 ℃孵育1 h后，再加入預(yù)處理好的Protein A/G 4 ℃孵育過夜，離心后棄去上清。加入IP buffer 裂解液洗滌3 次，Trizol提取總RNA，檢測MMP11相對表達(dá)量。

1.3.5 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）使用Trizol（Invitrogen）按照制造商的方案從細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒（Invitrogen）合成cDNA。按照制造商的方案使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實(shí)驗(yàn)組的目的基因相對表達(dá)量的差異。實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。

表1 MMP11 和GAPDH 的引物序列Tab.1 The primer sequences of MMP11 and GAPDH

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot）收集各處理組細(xì)胞用預(yù)冷的全蛋白裂解液冰上裂解10 min后，將等量蛋白于100 V 進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，以60 V、120 min 將蛋白遷移至NC 膜，一抗4 ℃過夜孵育，加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG，室溫下孵育120 min，之后用ECL 試劑盒（Solarbio，Beijing，China）進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，拍照觀察蛋白印記。抗體：有關(guān)使用抗體的詳細(xì)信息見表2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表2 實(shí)驗(yàn)中所有抗體的相關(guān)信息Tab.2 Information about all the antibodies in the experiment

1.3.7 Transwell實(shí)驗(yàn)分離HCT15細(xì)胞，在PBS中洗滌兩次，然后再懸浮在無血清RPMI-1640 中。將5 × 105個細(xì)胞按200 μL 置入Matrigel 基質(zhì)包被的上室中，下腔內(nèi)填充400 μL RPMI-1640/10%胎牛血清。孵育24 h 后，輕輕刮去上腔內(nèi)未遷移的細(xì)胞，并對膜下表面的細(xì)胞用0.5% 結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將HCT15 細(xì)胞（5 × 105）接種在6 孔板上，當(dāng)細(xì)胞長到80%的時候。用移液槍槍頭在孔平面輕輕劃過，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，去除游離細(xì)胞。加入無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下觀察和拍照0 h 和24 h 的細(xì)胞遷移情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，并用GraphPad Prism8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP11 在結(jié)直腸癌患者和組織中高表達(dá)UALCAN 數(shù)據(jù)庫獲得結(jié)直腸癌患者中TOP25 高表達(dá)基因（P＜0.05，圖1A），發(fā)現(xiàn)MMP11 在結(jié)腸腺癌患者中顯著高表達(dá)（P＜0.05，圖1B）。此外，分別在GEPIA2 和ENCORI 數(shù)據(jù)庫中證實(shí)MMP11 在結(jié)直腸癌中高表達(dá)（P＜0.05，圖1C-D）。從成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院核工業(yè)四一六醫(yī)院獲得20 例結(jié)直腸癌患者癌及癌旁組織，qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MMP11 在癌組織中高表達(dá)（P＜0.001，圖1E），這與數(shù)據(jù)庫結(jié)果相一致。qRT-PCR 和western blot 分析正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞及結(jié)直腸癌細(xì)胞，結(jié)果顯示相較于正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞MMP11 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著提高（P＜0.001，圖1F-G）。因?yàn)镠CT15 細(xì)胞中MMP11 表達(dá)水平最高，因此采用HCT15 細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

圖1 MMP11 在結(jié)直腸癌患者和組織中高表達(dá)Fig.1 MMP11 is highly expressed in COAD patients and tissues

2.2 EIF4A3結(jié)合并穩(wěn)定MMP11 mRNAENCORI數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)MMP11 mRNA 能和EIF4A3 蛋白結(jié)合（圖2A），并且RIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EIF4A3 蛋白能夠與MMP11 mRNA 共沉淀（圖2B），證實(shí)EIF4A3 蛋白和MMP11 mRNA 之間的相互作用。RBP 能延長mRNA 的半衰期，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。因此在HCT15和DLD1 細(xì)胞中通過添加放線菌素D 檢測MMP11 mRNA 的半衰期，結(jié)果顯示降低EIF4A3 表達(dá)后MMP11 mRNA的半衰期縮短（P＜0.05，圖2C），這表明EIF4A3能結(jié)合MMP11 mRNA，并增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

圖2 EIF4A3 結(jié)合增強(qiáng)MMP11 mRNA 穩(wěn)定性Fig.2 EIF4A3 combined to enhance the stability of MMP11 mRNA

2.3 EIF4A3 調(diào)節(jié)MMP11 蛋白表達(dá)上述研究證實(shí)EIF4A3 能增強(qiáng)MMP11 mRNA 的穩(wěn)定性，因此在HCT15 細(xì)胞中通過western blot 檢測分別干擾EIF4A3 表達(dá)和過表達(dá)EIF4A3 后對MMP11 蛋白表達(dá)的影響。與陰性對照組相比，抑制EIF4A3表達(dá)能在一定程度上降低MMP11蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）；而過表達(dá)EIF4A3則能在一定程度上增加MMP11的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05，圖3）。表明EIF4A3 能在一定程度上增加MMP11蛋白的表達(dá)水平。

圖3 EIF4A3 調(diào)節(jié)MMP11 蛋白表達(dá)Fig.3 EIF4A3 regulates MMP11 protein expression

2.4 過表達(dá)MMP11 反轉(zhuǎn)了EIF4A3 敲低對侵襲遷移的抑制與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染si-EIF4A3 后，MMP11蛋白表達(dá)水平降低，而同時轉(zhuǎn)染si-EIF4A3+pEGFP1-MMP1 則在一定程度上回復(fù)MMP11 蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖4A）。Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾EIF4A3 后，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，而同時轉(zhuǎn)染si-EIF4A3 + pEGFP1-MMP1 使HCT15 細(xì)胞的侵襲能力得到一定程度的回復(fù)（P＜0.05，圖4B）；劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾EIF4A3 后，細(xì)胞遷移能力減弱，而同時轉(zhuǎn)染si-EIF4A3+pEGFP1-MMP1 則逆轉(zhuǎn)上述作用（P＜0.05，圖4C）。表明過表達(dá)MMP11 能在一定程度上逆轉(zhuǎn)EIF4A3 敲低對HCT15 細(xì)胞的抑制作用。

圖4 過表達(dá)MMP11 逆轉(zhuǎn)EIF4A3 敲低對侵襲遷移的抑制作用Fig.4 Overexpression of MMP11 reverses the inhibitory effect of EIF4A3 knockdown on invasion and migration

2.5 MMP11過表達(dá)反轉(zhuǎn)了EIF4A3敲低對EMT相關(guān)蛋白的影響western blot 分別檢測抑制EIF4A3表達(dá)和共轉(zhuǎn)染si-EIF4A3+ pEGFP1-MMP11 后對HCT15 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白的影響，結(jié)果顯示和陰性對照組相比，EIF4A3 抑制組E-cadherin 蛋白表達(dá)增加（P＜0.001），Vimentin、N-cadherin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.001）；而共轉(zhuǎn)染si-EIF4A3+pEGFP1-MMP11 后發(fā)現(xiàn)與EIF4A3 抑制+MMP11 過表達(dá)對照組相比，Vimentin、N-cadherin 蛋白表達(dá)略有升高，E-cadherin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，圖5）。表明抑制EIF4A3 表達(dá)抑制EMT 進(jìn)程，而MMP11 過表達(dá)反轉(zhuǎn)了EIF4A3 敲低對EMT 的抑制作用。

圖5 過表達(dá)MMP11 逆轉(zhuǎn)EIF4A3 敲低對EMT 相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Overexpression of MMP11 reverses the effect of EIF4A3 knockdown on EMT-related proteins

3 討論

目前結(jié)直腸癌的治療形勢依舊十分嚴(yán)峻，大多患者確診時發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者的療效不佳、預(yù)后不良［11］。EMT 是許多惡性腫瘤（包括結(jié)直腸癌）發(fā)生局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移所必須的轉(zhuǎn)化過程［12］，MMP 則在這一過程中發(fā)揮重要作用。有研究指出MMP2、MMP9、MMP3、MMP8、MMP11 等一系列MMP 家族蛋白酶廣泛參與各種癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移當(dāng)中［13-14］。MMP11 在多種癌癥中高表達(dá)，并且和乳腺癌［15］、透明細(xì)胞腎癌［16］、胰腺癌［17］等癌癥的臨床特性相關(guān)，可以作為腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物。敲除MMP11 能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲［10］，并且miRNA 能夠通過靶向吸附MMP11 發(fā)揮腫瘤抑制作用［18］。但是MMP11 在結(jié)直腸癌中的研究寥寥無幾，大多局限在其作為生物標(biāo)志物的研究上，本文中通過UALCAN、GEPIA2 和starbase 數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)MMP11在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，在我院獲得的20 例CRC 組織樣本中同樣發(fā)現(xiàn)MMP11 高表達(dá)，同時RT-PCR和western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP11 在SW480、HCT15、DLD1、SW620 等CRC 細(xì)胞系中高表達(dá)，并且在HCT15 細(xì)胞系中表達(dá)程度最高。為了進(jìn)一步挖掘MMP11 在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用，筆者通過ENCORI 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)MMP11 能和EIF4A3 相互作用，但是其具體調(diào)控機(jī)制還尚未有研究報(bào)道。

RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBP）是細(xì)胞中一類能和RNA 特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，進(jìn)而參與RNA 的剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、定位等一系列轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用［19］。RBP 廣泛參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展及炎癥反應(yīng)，并有研究指出RBP可以作為癌癥新的治療位點(diǎn)［20-21］。EIF4A3 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、癌基因表達(dá)、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［22］。研究報(bào)道EIF4A3 在多種癌癥中高表達(dá)，并且能夠促進(jìn)三陰乳腺癌［22］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［23-24］、非小細(xì)胞肺癌［25］、上皮性卵巢癌等癌癥的惡性進(jìn)展，這表明EIF4A3 在癌癥中作為致癌因子發(fā)揮作用。本研究通過RIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EIF4A3 能夠和MMP11 mRNA 相互作用，增強(qiáng)MMP11 mRNA 的穩(wěn)定性，并通過western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制EIF4A3表達(dá)能夠降低MMP11 蛋白表達(dá)水平，而過表達(dá)EIF4A3能夠增加MMP11 蛋白表達(dá)水平。此外，在HCT15細(xì)胞中抑制EIF4A3 表達(dá)，transwell 和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HCT15 細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化，結(jié)果顯示抑制EIF4A3 表達(dá)能抑制HCT15 細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而抑制EIF4A3 表達(dá)的同時過表達(dá)MMP11能夠逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制EIF4A3 表達(dá)抑制EMT 過程，而抑制EIF4A3 表達(dá)的同時過表達(dá)MMP11 Vimentin、N-cadherin 蛋白表達(dá)增加，E-cadherin 蛋白表達(dá)降低，逆轉(zhuǎn)了抑制EIF4A3 對EMT 的抑制作用。

綜上所述，MMP11 在結(jié)直腸癌組織和HCT15細(xì)胞中高表達(dá)，EIF4A3能夠和MMP11相互作用，并增加MMP11 mRNA的穩(wěn)定性。干擾EIF4A3表達(dá)能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和EMT，而同時過表達(dá)MMP11 則能逆轉(zhuǎn)上述作用，說明EIF4A3 通過結(jié)合MMP11 增加MMP11 mRNA 的穩(wěn)定性，促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和EMT。