貴州六盤(pán)水地區(qū)大白菜黑斑病病原菌鑒定及培養(yǎng)特性研究

龍巧芳 梁 文 蔣芹娜 吳鳳康 李 倩 楊友聯(lián) 張曉勇

（六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤(pán)水 553004）

黑斑病又稱(chēng)黑霉病，是大白菜常見(jiàn)的重要病害之一，發(fā)病面積廣，近年暴發(fā)呈上升趨勢(shì)。黑斑病早期在大白菜上形成2～5 mm 的灰褐色近圓形斑，并有圓環(huán)狀同心輪紋，外圍呈淡黃色暈圈，病斑中央常見(jiàn)黑色霉?fàn)钗?；后期病斑逐漸擴(kuò)大，病部干枯穿孔，嚴(yán)重時(shí)整株葉片枯死（董偉，2012）。黑斑病在早春發(fā)生最為嚴(yán)重，最適發(fā)病溫度為13～15 ℃，低溫、高濕和雨霧天氣最適病害暴發(fā)和流行（鄧奇，2011）。前人研究表明，鏈格孢屬（）多種真菌如蕓薹鏈格孢、蘿卜鏈格孢（馬海霞 等，2013；云曉敏等，2015）、蕓薹生鏈格孢、蕪菁鏈格孢（張?zhí)煊睿?003）、日本鏈格孢（Ren et al.，2012）、鏈格孢、細(xì)極鏈格孢（Dunbar et al.，2017；郭潤(rùn)婷，2018）、茄鏈格孢（Shi et al.，2021）等都可為害大白菜葉片并形成黑斑病癥狀，有時(shí)多種鏈格孢真菌復(fù)合致病，給病害的識(shí)別和防治造成一定困難。

前人對(duì)大白菜黑斑病病原菌已有一定研究，但該病的病原菌種類(lèi)繁雜，存在明顯的季節(jié)性和區(qū)域性，同時(shí)對(duì)病原菌的生物學(xué)特性研究也缺乏系統(tǒng)性，不利于該病的識(shí)別、傳播規(guī)律調(diào)查及田間防治。本試驗(yàn)對(duì)貴州省六盤(pán)水地區(qū)4 個(gè)種植點(diǎn)的大白菜黑斑病病樣進(jìn)行病原菌分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)和多基因分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并研究了該病原菌的生物學(xué)特性和致死溫度等，以期為六盤(pán)水地區(qū)大白菜黑斑病田間準(zhǔn)確識(shí)別及防治提供理論及實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

2019、2020 年春季分別在貴州省六盤(pán)水市鐘山區(qū)明湖村、水城區(qū)野鐘鄉(xiāng)、六枝特區(qū)新場(chǎng)鄉(xiāng)和盤(pán)州市大山鎮(zhèn)4 個(gè)大白菜種植點(diǎn)進(jìn)行田間病害調(diào)查和采樣，每個(gè)種植點(diǎn)隨機(jī)采集1 份病葉并單獨(dú)裝入保鮮袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，采用稀釋涂布法分離、純化 得 到BA20191205、BA20191215、BA190721、BA190629 等4 個(gè)菌株。菌株在PDA 試管斜面上培養(yǎng)10 d 后置于4 ℃冰箱保藏備用。

1.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

分別將4 個(gè)菌株接種于PDA 培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)。打取直徑6 mm 的菌落邊緣小菌餅，接入另一PDA 平板中央，25 ℃、自然光照條件下培養(yǎng)10 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，觀察菌落特征。

同時(shí)將4 個(gè)菌株分別接種于馬鈴薯胡蘿卜瓊脂（PCA）培養(yǎng)基（20 g 去皮馬鈴薯和20 g 胡蘿卜切成小塊，加蒸餾水小火熬煮30 min 后雙層紗布過(guò)濾得到濾液，加入18 g 瓊脂，定容至1 000 mL 后滅菌備用）平板，20 ℃、自然光照條件下誘導(dǎo)產(chǎn)孢，然后刮取菌落表面分生孢子制成臨時(shí)裝片，采用奧林巴斯BX51 顯微攝像系統(tǒng)對(duì)分生孢子形態(tài)特征進(jìn)行觀察和拍攝，并采用Spot32 v4.0.8 軟件測(cè)量其顯微尺寸。

1.3 病原菌分子鑒定

分別將4 個(gè)菌株接種于PDA 平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d 后刮取菌絲，采用改良的CTAB 法提取菌株DNA（張穎慧 等，2008）。擴(kuò)增的目的序列分別為內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、鏈格孢抗原相關(guān)蛋白基因（-）和翻譯延長(zhǎng)因子1α亞基基因（-）3 個(gè)基因片段。ITS 序列引物為ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG），-序列引物為Alt-for（ATGCAGTTCACCACCATCGC）和Alt-rev（ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC），-序列引物為EF1-526F（GTCGTYGTYATYGG HCAYGT）和EF1-1567R（ACHGTRCCRATACCAC CRATCTT）（Lawrence et al.，2013；Nishikawa &Nakashima，2020）。

PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參考Woudenberg 等（2013）的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序，所得序列已提交至GenBank。將所得序列輸入GenBank 的BLAST 中進(jìn)行同源序列檢索，查找相似性較高的菌株（表1）。

表1 參與分子系統(tǒng)學(xué)分析的序列

3 個(gè)基因序列利用Sequence Matrix 1.7.8 進(jìn)行拼接，運(yùn)用MEGA X 軟件的極大似然法（maximum likelihood method，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的分類(lèi)地位。

1.4 菌株致病性鑒定

供試大白菜品種為中華青（市售），5 葉期選取健壯無(wú)病害的幼苗定植于裝有滅菌草炭基質(zhì)的花盆，置于20 ℃光照培養(yǎng)箱中，緩苗后使用75%的酒精棉球?qū)θ~片進(jìn)行消毒，無(wú)菌水清洗4～5 次，無(wú)菌吸水紙吸去表面水分后用灼燒冷卻的接種針對(duì)由內(nèi)向外數(shù)第5 片葉形成微創(chuàng)傷口，用2 mm 打孔器打取菌株BA20191205 菌落邊緣小菌塊接種于微創(chuàng)傷口處（以菌絲面接觸傷口），再將幼苗置于20 ℃、光照10 h/黑暗14 h 的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，7 d 后觀察其致病效果。以接種直徑2 mm 的無(wú)菌瓊脂塊為對(duì)照，每處理接種3 株，6 次重復(fù)。

如葉片發(fā)病，待病斑部位產(chǎn)生分生孢子后，刮取分生孢子用稀釋涂布法進(jìn)行分離純化，并對(duì)分離的菌株與原菌株進(jìn)行比較。

1.5 病原菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)最佳溫度及pH測(cè)定

用6 mm 打孔器打取菌株BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點(diǎn)接種于PDA 平板中央，分別置于0、5、10、15、20、25、30、35 ℃等8 個(gè)溫度條件下，每處理接種3 皿，3 次重復(fù)。10 d 后測(cè)量各處理的菌落直徑。

利用1 mol·LNaOH 或HCl 調(diào)節(jié)PDA 培養(yǎng)基pH 值至4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 等10 個(gè)梯度，制成平板；然后用6 mm 打孔器打取菌株BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點(diǎn)接種于PDA平板中央，每處理接種3 皿，3 次重復(fù)。25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)量各處理的菌落直徑。

用滅菌解剖刀刮取菌株BA20191205 菌落表面的分生孢子懸浮于無(wú)菌水中，利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子懸浮液中的孢子密度，并用無(wú)菌水稀釋孢子懸浮液濃度至1 × 10個(gè)·mL。用移液槍吸取100 μL 孢子懸浮液加入PDA 平板，均勻涂布后分別置于0、5、10、15、20、25、30、35 ℃等8 個(gè)溫度條件下，每處理接種3 皿，3 次重復(fù)。24 h 后將涂布平板置于奧林巴斯BX51 顯微攝像系統(tǒng)下，隨機(jī)選取10 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)情況。

1.6 菌株生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基、碳源及氮源篩選

設(shè)置5 種培養(yǎng)基處理：PDA 培養(yǎng)基、10%PDA 培養(yǎng)基、PCA 培養(yǎng)基、10% PCA 培養(yǎng)基、合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂（SNA）培養(yǎng)基（0.2 g KHPO，0.2 g KCl，1.0 g KNO，0.5 g MgSO·7HO，0.2 g 葡萄糖，15 g 瓊脂，1 000 mL 蒸餾水，自然pH 值）（周曉榕 等，2006；張曉勇 等，2019）。用6 mm 打孔器打取菌株BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點(diǎn)接種于不同配方培養(yǎng)基平板中央，每處理接種3 皿，3次重復(fù)。25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)量各處理的菌落直徑。

以查氏培養(yǎng)基（1 g KHPO，3 g NaNO，0.01 g FeSO，0.50 g KCl，0.50 g MgSO·7HO，30 g蔗糖，15 g 瓊脂，1 000 mL 蒸餾水，自然pH 值）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（周曉榕 等，2006），分別用相同質(zhì)量的可溶性淀粉、甘油、麥芽糖、葡萄糖替代蔗糖，得到5 種含不同碳源的培養(yǎng)基；分別用相同質(zhì)量的硝酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鉀替代硝酸鈉，得到6 種含不同氮源的培養(yǎng)基。用6 mm打孔器打取菌株BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點(diǎn)接種于不同碳源或氮源的培養(yǎng)基平板中央，每處理接種3 皿，3 次重復(fù)。25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)量各處理的菌落直徑。

1.7 菌株致死溫度測(cè)定

取1 000 μL 濃度為1 × 10個(gè)·mL的菌株BA20191205 孢子懸浮液，加入1.5 mL 無(wú)菌離心管中，分別放入35、40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴中，每處理3 管，3 次重復(fù)；精確計(jì)時(shí)10 min，各處理分別取100 μL 孢子懸浮液均勻涂布于水瓊脂（WA）培養(yǎng)基平板上（劉一賢 等，2015），25 ℃條件下培養(yǎng)24 h，然后在奧林巴斯BX51 顯微攝像系統(tǒng)下隨機(jī)選取10 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)情況。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用DPS v7.05 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)及致病性鑒定

大白菜黑斑病主要發(fā)生在葉片上，初期形成輪紋狀黑斑，嚴(yán)重時(shí)造成穿孔（圖1-A）。經(jīng)分離純化，在PDA 平板上25 ℃培養(yǎng)10 d 后菌落直徑為（44.6 ± 2.7）mm，邊緣整齊，菌絲呈褐色，并且分泌黑褐色素，菌落表面淡黃色，背面褐色且有明顯輪紋（圖1-B、C）。在PCA 平板上形成的分生孢子多為單生，少數(shù)形成2～3 個(gè)孢子的短鏈（圖1-D）；孢身直立或略彎曲，淡灰褐色至褐色，倒棒狀，（74.2～148.8）μm ×（16.7～35.5）μm，具橫隔膜4～15 個(gè)，縱、斜隔膜0～6 個(gè)（圖1-E～H）；喙柱狀，長(zhǎng)28.80～84.95 μm，淡灰褐色，多有分隔?；谛螒B(tài)特征分析，初步將4 個(gè)菌株鑒定為蕓薹鏈格孢（Berk.）Sacc（Wiltshire，1945）。

將菌株BA20191205 接種于健康大白菜葉片上，20 ℃培養(yǎng)7 d 后與對(duì)照相比，接種處形成5～10 mm 的灰褐色病斑，并有顯著的圓環(huán)狀同心輪紋，與田間大白菜黑斑病早期癥狀相似（圖1-I）。再次挑取黑色霉層進(jìn)行分離純化，所得菌株菌落及分生孢子形態(tài)特征與原菌株一致。

圖1 大白菜黑斑病發(fā)病癥狀及病原菌形態(tài)特征

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將本試驗(yàn)中分離得到的4 個(gè)菌株的ITS、-和-序列與從GenBank 中下載的22 個(gè)同源性較高的序列（表1），以CBS116490 作為外類(lèi)群（Nishikawa &Nakashima，2020），利用MEGA X 軟件構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。結(jié)果表明，4 個(gè)菌株都與蕓薹鏈格孢以100% 的高支持率聚為一支，即這4 個(gè)菌株均為蕓薹鏈格孢（Berk.）Sacc。

圖2 基于ITS、Alt-a1 和tef-1 序列構(gòu)建的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 不同碳源、氮源和不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同碳源、氮源和培養(yǎng)基配方對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響達(dá)到顯著水平（圖3）。該病原菌在PDA培養(yǎng)基中的菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于其他培養(yǎng)基，說(shuō)明該病原菌最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA（圖3-A）。相同條件下，菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的菌落直徑顯著大于其他處理，說(shuō)明葡萄糖為該病原菌最佳生長(zhǎng)碳源（圖3-B）；菌株在以酵母浸粉和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最佳（圖3-C），菌落直徑顯著大于其他處理。

圖3 不同碳源、氮源和不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 不同培養(yǎng)溫度和pH 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)速度及孢子萌發(fā)率的影響均達(dá)到顯著水平（表2）。在5～30 ℃范圍內(nèi)，該病原菌菌絲均可生長(zhǎng)，孢子均能萌發(fā)，25 ℃處理的菌絲生長(zhǎng)速度最快，孢子萌發(fā)率最高，在20～30 ℃范圍內(nèi)孢子萌發(fā)率差異不顯著；當(dāng)溫度低于0 ℃或超過(guò)35 ℃后菌絲即停止生長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率也急劇下降。

表2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

不同pH 培養(yǎng)基處理對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響也達(dá)到了顯著水平（圖4），pH 值在6～8 范圍內(nèi)該病原菌生長(zhǎng)良好，最佳pH 值為7。

圖4 不同pH 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 病原菌致死溫度測(cè)定

由圖5 可知，隨著處理溫度的升高，病原菌孢子萌發(fā)率顯著降低；當(dāng)處理溫度達(dá)到55 ℃后，孢子萌發(fā)率降為0。說(shuō)明病原菌致死溫度為55 ℃處理10 min。

圖5 病原菌致死溫度的測(cè)定

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，大白菜黑斑病在貴州六盤(pán)水地區(qū)為害區(qū)域呈擴(kuò)大趨勢(shì)，前期田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，所選擇的大白菜種植點(diǎn)在3—4 月均有黑斑病發(fā)生，嚴(yán)重的地塊發(fā)病率達(dá)到80%～100%，給大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重?fù)p失。本試驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS、-、-多基因序列分析，確定六盤(pán)水地區(qū)4個(gè)菌株均為蕓薹鏈格孢。蕓薹鏈格孢是世界性分布的弱寄生病原菌，其寄主專(zhuān)化性不強(qiáng)，除了常導(dǎo)致大白菜、蘿卜、甘藍(lán)、芥菜等蕓薹屬植物的葉部病害，以及蘆薈（Ghosh &Banerjee，2014）、辣 根（Blagojevi et al.，2015）、龍 葵（Caesar &Lartey，2009）和 柚 木（Borges et al.，2018）等多種非蕓薹屬植物葉斑病，還可引起葉用萵苣（生菜）等植物的根腐?。ㄊ酉?等，2019），對(duì)多種農(nóng)作物的生產(chǎn)造成影響。

大白菜黑斑病病原菌較為復(fù)雜，其分布存在明顯的區(qū)域性。郭潤(rùn)婷（2018）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大白菜黑斑病病原菌在內(nèi)蒙古主要為細(xì)極鏈格孢，在山東主要為蕓薹生鏈格孢，在北京主要為鏈格孢。同時(shí)，大白菜黑斑病病原菌分布還存在明顯的季節(jié)性和周期性，秋冬季一般由蕓薹鏈格孢引起，而春夏季主要由蕓薹生鏈格孢引起（李明遠(yuǎn)，2004；王風(fēng)敏 等，2007）。本試驗(yàn)中，蕓薹鏈格孢在20～25℃下菌絲生長(zhǎng)速度和孢子萌發(fā)率都較高，前人報(bào)道蕓薹鏈格孢在14.6 ℃時(shí)附著胞形成率最高（馬海霞 等，2013），而蕓薹生鏈格孢最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃（王春明 等，2020），說(shuō)明蕓薹鏈格孢是低溫型病原菌，蕓薹生鏈格孢是高溫型病原菌，大白菜黑斑病病原菌的區(qū)域性和季節(jié)性變化是由其生物學(xué)特性決定的。本試驗(yàn)中早春在六盤(pán)水地區(qū)采集的大白菜黑斑病材料的病原菌均為蕓薹鏈格孢，未發(fā)現(xiàn)蕓薹生鏈格孢，與上述研究結(jié)果一致。

早期鏈格孢屬真菌分類(lèi)主要是基于分生孢子結(jié)構(gòu)，Simmons（1992）依據(jù)分生孢子成鏈特性、孢身結(jié)構(gòu)、喙的有無(wú)和喙形態(tài)等制定了詳細(xì)的鏈格孢形態(tài)學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。但鏈格孢種內(nèi)和種間孢子形態(tài)變化幅度大，種間形態(tài)特征常常會(huì)交叉，形態(tài)鑒定無(wú)法保證準(zhǔn)確性（張?zhí)煊睿?003），且分生孢子形態(tài)會(huì)受到培養(yǎng)條件的影響，因此現(xiàn)在普遍采用PCA培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行鏈格孢產(chǎn)孢誘導(dǎo)，以方便比較種間菌落形態(tài)、分生孢子成鏈特性及顯微結(jié)構(gòu)，以提高鏈格孢形態(tài)鑒定的準(zhǔn)確度（Simmons，2007）。分子生物學(xué)方法是鏈格孢鑒定有力的補(bǔ)充，現(xiàn)廣泛用于鏈格孢屬真菌鑒定的基因主要有ITS、、、-、、-等（Nishikawa &Nakashima，2020）。

蕓薹鏈格孢對(duì)環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)。該病原菌主要在植物殘?bào)w和土壤中越冬，成為翌年的初侵染源（鄧奇，2011）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蕓薹鏈格孢在pH 值4～11 范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，但對(duì)堿性條件相對(duì)較為敏感；分生孢子在55 ℃下處理10 min 即完全失去萌發(fā)能力，比李明遠(yuǎn)和柯常?。?991）測(cè)得的菌絲致死溫度高5 ℃，可能是由于分生孢子耐熱性高所致。因此，生產(chǎn)上可采用撒施石灰配合夏季高溫悶棚或土壤火焰消毒等措施降低土壤初侵染菌量來(lái)預(yù)防病害的發(fā)生。蕓薹鏈格孢分生孢子不耐干旱，需要相對(duì)濕度在75%時(shí)才能在葉片上萌發(fā)（李明遠(yuǎn)和柯常取，1991），因此生產(chǎn)中在持續(xù)低溫、高濕條件下要重點(diǎn)監(jiān)測(cè)和預(yù)防黑斑病。本試驗(yàn)中，以含蛋白質(zhì)較高的酵母浸粉、蛋白胨作為氮源可顯著促進(jìn)蕓薹鏈格孢生長(zhǎng)，所以生產(chǎn)中要合理施肥，避免偏施氮肥，以減輕黑斑病的發(fā)生。