番茄立枯病菌拮抗菌B4-8的鑒定及生防作用評(píng)價(jià)

藍(lán)達(dá)愉 李鳳芳 何廣潔 許萌杏 吳小剛 黎起秦 林 緯 袁高慶

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004）

立枯絲核菌（）寄主范圍廣泛，可侵染多種作物引起立枯病、紋枯病和莖基腐病。其中番茄立枯病是番茄苗期以及移栽初期的主要病害之一，大田期還常常造成莖基腐病，在常年連作或輪作年限短的番茄主產(chǎn)區(qū)發(fā)生為害尤其嚴(yán)重（韓云 等，2015）。目前防治番茄立枯病的方法主要是通過使用化學(xué)藥劑以及加強(qiáng)苗期農(nóng)業(yè)措施管理，但長期使用化學(xué)藥劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性并引起污染環(huán)境等問題，而農(nóng)業(yè)措施有時(shí)實(shí)施不到位，達(dá)不到及時(shí)有效控制病害的目的。生物防治被認(rèn)為是重要的綠色防控技術(shù)，具有安全無污染、可持續(xù)發(fā)揮控制作用的特點(diǎn)，尤其適用于土傳病害的防治。挖掘有益的生防菌是對番茄立枯病實(shí)施生物防治的前提。

本試驗(yàn)前期工作中，從采自廣西和北京市郊的18 份土樣中分離到672 株細(xì)菌菌株。以番茄立枯病菌作為靶標(biāo)病原菌，通過平板抑菌活性測定，獲得具有拮抗作用的細(xì)菌菌株57 株，其中菌株B4-8對靶標(biāo)病菌的抑制作用最強(qiáng)（資料未發(fā)表）。本文擬對該菌株進(jìn)行鑒定，測定其抑菌譜和對番茄立枯病的室內(nèi)防治作用，并初步分析其生防機(jī)制和安全性，探討其生防價(jià)值，為利用該菌株防治番茄立枯病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病原菌：番茄立枯病菌（）、苦瓜枯萎病菌（）、香蕉煤紋病菌（）、煙草莖點(diǎn)霉葉斑病菌（）、柑橘沙皮病菌（）和蘋婆炭疽病菌（），由廣西大學(xué)植物病理研究室提供。

生防菌：菌株B4-8 由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病害生物防治課題組成員前期從土壤中分離獲得，保存于廣西大學(xué)植物病理研究室。對照生防菌株熒光假單胞菌（）2P24 和Pf-5分別高產(chǎn)生物膜、抗生素硝吡咯菌素，由廣西大學(xué)吳小剛博士提供。

供試番茄品種：真龍2 號(hào)，廣州市大農(nóng)園藝種子有限公司生產(chǎn)。

King’B 培養(yǎng)基：甘油10 mL，蛋白胨20.0 g，七水硫酸鎂1.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。NA 培養(yǎng)基：酵母粉3.0 g，蛋白胨5 g，蔗糖10 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。蛋白酶檢測培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，氯化鈉0.5 g，氯化鈣0.1 g，脫脂奶粉10.0 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。以上培養(yǎng)基pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min 備用。麥麩培養(yǎng)基：以麥麩與蒸餾水質(zhì)量比為5∶4 的比例混合，分裝于三角瓶中，121℃滅菌30 min，連續(xù)滅菌2 次后備用。

1.2 供試菌株培養(yǎng)

生防細(xì)菌菌株的培養(yǎng)：取保存在-80 ℃的菌株B4-8 于NA 培養(yǎng)基平板上28 ℃下活化，挑取單菌落于NA 固體培養(yǎng)基上或NB 液體培養(yǎng)基中28 ℃下培養(yǎng)24 h，待用。

病原菌的培養(yǎng)：將用于抑菌譜測定的病原菌接于PDA 培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)3 d 待用。另將用于接種的番茄立枯病菌菌落切成小塊，以10%的接種量移入麥麩培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 d，倒出自然晾干后搗碎，制成接種物。

1.3 菌株B4-8 的鑒定

常規(guī)鑒定：描述菌落特征，進(jìn)行菌體革蘭氏染色和生理生化性狀測定（東秀珠和蔡妙英，2001），用透射電鏡觀察菌體形態(tài)。

分子鑒定：采用通用引物16S-63F（5′-CAGG CCTAACACATGCAAGTC-3′）和16S-1387R（5′-GGGCGGTGATGTACAAGGC-3′）擴(kuò)增菌株16S rDNA 序 列（Marchesi et al.，1998）。PCR 擴(kuò) 增 體系（50 μL）為：DNA 模板4 μL，16S-63F 2 μL，16S-1387R 2 μL，mix 25 μL，ddHO 17 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸110 s，循環(huán)35 次；72℃修復(fù)延伸7 min；4 ℃保存待用；用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司純化并測序。之后將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有序列進(jìn)行同源性比對，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 菌株B4-8 的抑菌譜及其對番茄立枯病的室內(nèi)防治作用測定

1.4.1 抑菌譜測定 采用平板對峙培養(yǎng)法測定。在PDA 平板中央接種直徑7 mm 的病原真菌菌餅，在距離病原真菌菌餅2 cm 處接種菌株B4-8 懸浮液5 μL，以僅接種病原真菌菌餅未接菌株B4-8 的處理為對照，每處理設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)3 皿，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d，測量各病原菌的菌落面積，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=〔（對照組菌落面積 -處理組菌落面積）/對照組菌落面積〕 × 100

1.4.2 對番茄立枯病的防治作用測定 番茄幼苗長至10 cm 高時(shí)，將其移栽于含有基質(zhì)、泥土、牛糞（1∶5∶1）的種植缽中，每缽1 株。番茄第5 片葉長出后，將在NB 培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)24 h 的菌株B4-8 菌液濃度調(diào)成OD為0.20～0.25（即菌液濃度約為1 × 10cfu·mL），灌施于番茄幼苗根部，每株30 mL 菌液。以灌施30 mL 清水作為對照，以50%啶酰菌胺水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司生產(chǎn)）有效成分133.3 mg·kg的處理作為藥劑對照。接種生防菌2 d 后，將在麥麩培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 的立枯絲核菌以每株0.25 g 的量接種于番茄幼苗莖基部周圍并蓋上1 層細(xì)土。每處理設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 株番茄。接種病原菌5 d 后對番茄立枯病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。

發(fā)病率（%）=〔（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）〕× 100

防治效果（%）=〔（對照組發(fā)病率 -處理組發(fā)病率）/對照組發(fā)病率〕× 100

1.5 菌株B4-8 生防作用機(jī)制初步分析

1.5.1 生物膜產(chǎn)量和胞外酶活性測定 生物膜產(chǎn)量的測定：取菌株B4-8 新鮮菌液以2%的接種量接種于含有1 mL NA 培養(yǎng)液的EP 管中混勻，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)1 d，倒去菌液，用無菌水沖洗一遍后，加入1 mL 的1%結(jié)晶紫染液染色15 min，用無菌水將染液沖洗1 次，置于室溫下吹干，每管用1 mL 的95%乙醇反復(fù)用移液器輕輕抽打，徹底將離心管內(nèi)壁上形成的紫環(huán)沖洗下來，在600 nm 處測定吸光度值。以高產(chǎn)生物膜的生防菌株2P24 為對照菌，分別設(shè)置3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)3 管。

另外取5 μL 新鮮菌液分別接種于蛋白酶和幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基平板中（石磊 等，2013），置于28 ℃條件下分別培養(yǎng)2 d 和5 d，觀測菌落周圍透明水解圈大小。每處理設(shè)置3 次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3 皿。

1.5.2 硝吡咯菌素及其合成相關(guān)基因檢測 將新鮮B4-8 菌株接種到NA 平板上，置于28 ℃下培養(yǎng)7 d，將培養(yǎng)基切碎后轉(zhuǎn)移到100 mL 三角瓶中，加入50 mL 乙酸乙酯，37 ℃下振蕩90 min，室溫靜置5 min，收集上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得硝吡咯菌素粗提物，用100 μL 甲醇溶解，以氯仿與丙酮混合物（19∶1）為展開劑進(jìn)行薄層 層 析（張 清 霞 等，2018）。按 照Mavrodi 等（2001）描述的方法，對菌株B4-8 產(chǎn)生硝吡咯菌素的基因進(jìn)行PCR 檢測，引物為prnCF：5′-CCACAAGCCCGGCCAGGAGC-3′，prnCR：5′-GAGAAGAGCGGGTCGATGAAGCC-3′。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：DNA 模板4 μL，上下游引物各2 μL，mix 25 μL，ddHO 17 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 50 s，循環(huán)35 次；72℃修復(fù)延伸7 min；用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以上檢測均以菌株P(guān)f-5 作為陽性對照。

取B4-8 菌株硝吡咯菌素粗提物5 μL，按照1.4.1中的方法測定其對番茄立枯病菌的抑菌率，分別以新鮮菌液、Pf-5 硝吡咯菌素粗提物和甲醇作對照。

1.6 菌株B4-8 安全性測定

1.6.1 對洋蔥致病性的測定 選取健康的洋蔥鱗片，采用針刺與浸泡的方法對洋蔥進(jìn)行接種試驗(yàn)，菌株B4-8 接種濃度為1 × 10cfu·mL，以同樣方法接種無菌水作為對照，設(shè)置3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)1 塊洋蔥鱗片，每塊洋蔥鱗片接種4 處，觀察發(fā)病癥狀。

1.6.2 對人體安全性的測定 首先檢測菌株B4-8是否具有毒力基因BCESM（epidemic strain marker）：按Mahenthiralingam 等（1997）的方法擴(kuò)增BCESM 基因，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；72 ℃修復(fù)延伸10 min；4 ℃保存待用。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外采用生菜葉中脈致病模型進(jìn)行檢測（Ibrahim et al.，2012）：選用新鮮健康的葉用萵苣（生菜）葉，采用針刺法接種濃度為1 × 10cfu·mL的B4-8 菌株于生菜葉中脈，以接種無菌水作為對照，設(shè)置3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種1 片葉片，在葉片中脈接種3 處，觀察發(fā)病癥狀。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 和DPS 7.05 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株B4-8 的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征 在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，菌株B4-8 菌落呈圓形或近圓形，產(chǎn)生黃綠色熒光色素，表面稍凸起，水潤且粘稠，邊緣整齊或不整齊。在透射電鏡下，菌體（圖1）呈短桿狀，大小為（1.63～2.25）μm ×（1.0～1.5）μm，單端叢生鞭毛。

圖1 菌株B4-8 的菌體形態(tài)透射電鏡圖

2.1.2 生理生化特性 菌株B4-8 革蘭氏染色陰性，能進(jìn)行反硝化反應(yīng)，可產(chǎn)生氧化酶，可水解精氨酸、明膠、淀粉，可利用鼠李糖、麥芽糖、檸檬酸鹽、2，3-丁二醇。根據(jù)菌落和菌體形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)和生理生化特征，初步將菌株B4-8 歸屬為伯克氏菌屬。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株B4-8 的16S rDNA序列雙向測序后，經(jīng)在NCBI 上進(jìn)行比對，與多株洋蔥伯克氏菌（）菌株的相似性達(dá)到99%。選取伯克氏菌不同種的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），菌株B4-8 與洋蔥伯克氏菌（MG923808）處于同一分支內(nèi)。結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征，將菌株B4-8 鑒定為洋蔥伯克氏菌。

圖2 菌株B4-8 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株B4-8 的抑菌譜以及對番茄立枯病的防治作用

2.2.1 抑菌譜 菌株B4-8 對6 種植物病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌率為52.64%～68.27%。其中B4-8 對番茄立枯病菌的拮抗能力表現(xiàn)最強(qiáng)，對蘋婆炭疽病菌的拮抗能力表現(xiàn)最弱（表1）。

表1 生防菌B4-8 對供試病原真菌的抑菌率

2.2.2 對番茄立枯病的防治作用 菌株B4-8 對番茄立枯病的室內(nèi)防治效果達(dá)71.43%，與化學(xué)藥劑50%啶酰菌胺水分散粒劑使用有效成分133.3 mg·kg劑量的防效相當(dāng)（表2）。

表2 菌株B4-8 對番茄立枯病的防治作用

2.3 菌株B4-8 的生防機(jī)制

2.3.1 生物膜的形成 結(jié)晶紫染色法測定B4-8菌株生物膜合成的結(jié)果顯示，以熒光假單胞菌（）菌株2P24 作為對照，2 株菌株在EP 管培養(yǎng)液與空氣交界處的管壁上都可形成一道清晰的紫色環(huán)痕，用95%乙醇將紫色環(huán)痕洗脫下來后，在600 nm 處的吸光度值分別為1.098 和1.042，二者的吸光度值相比未達(dá)到差異顯著水平，說明生防菌B4-8 生物膜合成量與熒光假單胞菌2P24 處于同一水平。

2.3.2 產(chǎn)生的代謝物質(zhì) 水解圈測定結(jié)果顯示，菌株B4-8 在含蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)平板上產(chǎn)生明顯的水解圈，其半徑分別為1.0 cm 和 0.3 cm，表明該菌株可產(chǎn)生蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等抗菌代謝物?？股叵踹量┚鼗驒z測結(jié)果顯示，該菌株存在片段為720 bp 左右的基因（圖3-a）。通過薄層層析法進(jìn)一步驗(yàn)證菌株B4-8 可產(chǎn)生抗生素硝吡咯菌素（圖3-b）。

圖3 菌株B4-8 產(chǎn)生硝吡咯菌素的檢測及驗(yàn)證

2.3.3 硝吡咯菌素對番茄立枯病菌的抑制作用 菌株B4-8 產(chǎn)生的硝吡咯菌素粗提物對番茄立枯病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，且強(qiáng)于對照菌株P(guān)f-5 產(chǎn)生的硝吡咯菌素粗提物對病菌的抑制作用（圖4）。

圖4 菌株B4-8 硝吡咯菌素粗提物對番茄立枯病菌的拮抗作用

2.4 菌株B4-8 的安全性

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用針刺法與浸泡法接種洋蔥，菌株B4-8 都不能使洋蔥致病。對其基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，未檢測到BCESM 毒力基因。采用生菜葉中脈致病模型驗(yàn)證菌株B4-8 的致病性，結(jié)果顯示B4-8 不能使生菜葉中脈發(fā)病。以上結(jié)果說明，菌株B4-8 用于防治植物病害應(yīng)當(dāng)是安全可靠的。

3 討論

伯克氏菌（spp.）屬于變形菌門（Proteobacteria）細(xì)菌，有62 個(gè)種，廣泛存在于土壤、水體和動(dòng)植物等環(huán)境中（Suare-moreno et al.，2011）。部分spp.菌株可以有效地控制一些作物土傳病害的發(fā)生，如JX-1 對番茄青枯病的室內(nèi)防效能達(dá)到80.89%（許萌杏 等，2021）。spp.用于防治植物病害的種類還有：抑制瓜果腐霉（）的、抑制終極腐霉菌（）的、抑制鐮刀菌（sp.）的、抑制辣椒疫霉（）的、抑制灰葡萄孢菌（）的和抑制立枯絲核菌的（況衛(wèi)剛，2016）。洋蔥伯克氏菌原命名為洋蔥假單胞菌（），因其能引起洋蔥鱗莖腐爛，于1950 年首次作為植物病原菌報(bào)道（Burkholder，1950），1992 年被歸到屬（Yabuuchi et al.，1992）。又因不同菌株在基因水平上的差異，被統(tǒng)稱為洋蔥伯克氏菌群（complex，簡稱Bcc）。目前明確歸入到Bcc菌群里的有10個(gè)不同的基因型（Ⅰ～Ⅹ）。但近年來不斷有新的基因型被發(fā)現(xiàn)，且由于不同基因型的菌株之間的DNA 雜交率很低，因此可將洋蔥伯克氏菌一個(gè)基因型作為1 個(gè)種，目前已有22 個(gè)種（Rojas-Rojas et al.，2019）。感染人的幾乎都是Ⅲ型菌（）和Ⅱ型菌（），其中大部分屬于Ⅲ型菌。

Bcc 菌株應(yīng)用于植物病害防治的基因型主要有Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ型，在植物病害防治中具有良好潛能（Rohini et al.，2019）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株B4-8 對番茄立枯病具有較好的室內(nèi)防治效果，與化學(xué)藥劑50%啶酰菌胺水分散粒劑使用有效成分133.3 mg·kg劑量的防效相當(dāng)。

明確生防菌的生防機(jī)制可為提高其生防效果提供科學(xué)依據(jù)。Nacamulli 等（2006）發(fā)現(xiàn)，Bcc 菌株可迅速定殖玉米植株成為優(yōu)勢菌株，造成玉米根際微生物系統(tǒng)紊亂。生物膜的產(chǎn)生被認(rèn)為是與生防菌定殖能力密切相關(guān)的重要因子（Danhorn &Fuqua，2007），本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株B4-8 具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，暗示該菌株可能具有較強(qiáng)的定殖能力。但該菌株是否可在番茄根際形成優(yōu)勢種群和有效地抑制番茄立枯病菌入侵寄主，還有待進(jìn)一步深入探究。

Bcc 菌株可以分泌幾丁質(zhì)酶、淀粉酶和纖維素酶等多種胞外酶（張立新 等，2006），還可產(chǎn)生多種抗生素，包括硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）、吩嗪（phenazine）、蔥假胞素（cepacin）等以及其他未鑒定的化合物（De-Souza &Raaijmakers，2003）。硝吡咯菌素對病原真菌的抑菌機(jī)制主要在于抑制葡萄糖磷?；嘘P(guān)的轉(zhuǎn)移，并抑制菌絲的生長。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株B4-8 可以產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、硝吡咯菌素等胞外代謝物，且硝吡咯菌素對番茄立枯病菌有較強(qiáng)的抑制作用，推測B4-8 產(chǎn)生的胞外酶和硝吡咯菌素是該菌株發(fā)揮拮抗作用的重要生防因子。

Bcc 菌株在生物防治上有很大的潛力，但也存在對植物和人體致病的風(fēng)險(xiǎn)，需要對其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)?；駼CESM 是已被證實(shí)的與人體致病相關(guān)的遺傳基因，且被作為Bcc 生防菌致病性評(píng)估的一個(gè)指標(biāo)（Mahenthiralingam et al.，1997）。不同的致病模型之間存在一定程度上的差異性，有研究表明，采用生菜模型及擬南芥模型與小白鼠模型的結(jié)果呈現(xiàn)高度一致（Ibrahim et al.，2012）。本試驗(yàn)對菌株B4-8 的BCESM 基因進(jìn)行檢測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該菌株存在BCESM 基因，采用生菜葉進(jìn)行致病性驗(yàn)證的結(jié)果與毒力基因檢測結(jié)果一致，且對洋蔥不致病，初步表明菌株B4-8 對人和植物安全。

當(dāng)前Bcc 菌株對人和作物致病機(jī)制尚未完全明晰，其抗生素的拮抗機(jī)制也有待深入研究，在許多問題還未探索清楚之前，應(yīng)當(dāng)對其采取嚴(yán)格的管控措施，避免產(chǎn)生不必要的風(fēng)險(xiǎn)。然而目前菌株B4-8 在多方面表現(xiàn)出良好的生防潛力，對其進(jìn)行深入的研究很有意義和價(jià)值。后續(xù)計(jì)劃開展田間試驗(yàn)驗(yàn)證其生防效果，然后進(jìn)行相關(guān)安全性試驗(yàn)，包括大鼠急性經(jīng)口毒試驗(yàn)、家兔急性皮膚刺激試驗(yàn)等，進(jìn)一步確定菌株B4-8 的毒性，并結(jié)合分子技術(shù)深入研究該菌株的生防機(jī)制與抗生素調(diào)控機(jī)理，為今后該菌株在生物防治中的安全應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

菌株B4-8 被鑒定為洋蔥伯克氏菌，其對番茄立枯病菌的室內(nèi)防效達(dá)71.43%，可通過產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶及硝吡咯菌素等拮抗物質(zhì)發(fā)揮防病作用，初步表明對人體和植物安全，具有防治番茄立枯病的潛力。