熒光定量PCR 法定量檢測(cè)混合煙葉中的紅花大金元

李 萌，候?qū)帉帲?鵬，王旭東，宋嘉寶，孫九喆，馬 林*

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號(hào) 450001

2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)第三大街8 號(hào) 450000

煙葉是卷煙工業(yè)企業(yè)不可或缺的原料，其質(zhì)量的好壞直接影響卷煙產(chǎn)品的吸食品質(zhì)［1］。煙葉質(zhì)量指標(biāo)包括外觀質(zhì)量、化學(xué)成分和物理特性等方面［2］，受自身生物學(xué)特性及栽培、氣候等條件的影響，不同煙葉品種在感官和理化特性上存在較大差異，其在各配方中的應(yīng)用也有所不同。在煙葉收購(gòu)過(guò)程中，由于不同品種煙葉收購(gòu)價(jià)存在差異，混種、混區(qū)、混級(jí)等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，從而導(dǎo)致煙葉質(zhì)量波動(dòng)、卷煙配方失真，給工業(yè)企業(yè)控制卷煙產(chǎn)品質(zhì)量帶來(lái)影響［3］。目前煙葉原料的品種鑒定主要以感官評(píng)吸和理化檢測(cè)為主，感官評(píng)吸主觀性較強(qiáng)而煙葉理化指標(biāo)受產(chǎn)地、氣候及栽培條件的影響較大［4-5］，尚缺乏生產(chǎn)中能夠使用的快速、客觀且準(zhǔn)確的品種鑒定方法。

分子生物學(xué)檢測(cè)方法以物種基因組DNA 序列為檢測(cè)對(duì)象，具有干擾因素少、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)外觀和感官檢測(cè)的不足。RAPD、SCAR 和SSR 等分子標(biāo)記技術(shù)是煙草上研究較多的分子檢測(cè)技術(shù)，可以對(duì)煙葉品種進(jìn)行有效區(qū)分［6-9］。如肖炳光等［6］利用18條RAPD引物成功將29個(gè)烤煙品種進(jìn)行區(qū)分；馬林等［7］采用組合標(biāo)記策略，利用6個(gè)SCAR 引物準(zhǔn)確地區(qū)分了12 個(gè)煙葉品種；孫九喆等［8］篩選出5對(duì)SSR引物，實(shí)現(xiàn)了11個(gè)煙葉品種的快速區(qū)分。然而，以上研究雖能對(duì)煙葉品種進(jìn)行有效區(qū)分，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)煙葉品種的定量檢測(cè)。

熒光定量PCR可對(duì)檢測(cè)成分進(jìn)行相對(duì)定量甚至絕對(duì)定量的測(cè)定，已經(jīng)普遍用于食品、飼料及藥品等特定生物成分的定性、定量檢測(cè)［10-13］，而在煙草行業(yè)中，尤其在煙葉品種的定性、定量檢測(cè)方面鮮有熒光定量PCR 應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。為此，應(yīng)用TaqMan MGB 探針熒光定量PCR 檢測(cè)混合煙葉中紅花大金元的含量，建立基于熒光定量PCR 的特定煙葉品種定量檢測(cè)方法，以期為煙葉收購(gòu)和配方均一性檢測(cè)等生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的煙葉品種識(shí)別、定量檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

以鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草生物技術(shù)研究室保存的卷煙企業(yè)常用的4個(gè)烤后煙葉品種（2017年）為試驗(yàn)材料，品種信息見(jiàn)表1。

表1 4個(gè)烤后煙葉品種及編號(hào)Tab.1 Cultivars and numbers of four cured tobacco leaf samples

1.1.2 試劑

以實(shí)驗(yàn)室前期篩選的SCAR6序列為模板［14］，應(yīng)用軟件 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì) 5 對(duì) SCAR 引物（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成；利用上海生工在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（https://www.sangon.com/new Primer Design）設(shè)計(jì) TaqMan MGB 熒光探針H1-T（表3），并由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行合成，該探針5′端標(biāo)記熒光染料FAM，3′端標(biāo)記MGB 基團(tuán)；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ和 2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

表2 5對(duì)SCAR引物序列Tab.2 Sequences of 5 SCAR primer pairs

表3 熒光探針H1-TTab.3 Sequence of fluorescence probe H1-T

1.1.3 儀器

JXSF TPRP-2 組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Vetiti型梯度PCR儀（美國(guó)ABI公司）；Mini Bis Pro 型凝膠成像分析系統(tǒng)（以色列DNR 凝膠成像系統(tǒng)有限公司）；StepOnePlus 型熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

紅花大金元、云煙85、云煙87 與K326 4 個(gè)品種煙葉樣品各取0.1 g至1.5 mL離心管中，應(yīng)用組織研磨儀磨成粉末（2 min，65 Hz），然后參照改良后的CTAB 法［15］操作步驟提取DNA，利用超微量紫外分光光度計(jì)和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的濃度及質(zhì)量。最后將 DNA 稀釋至55 ng·μL-1，-20 ℃保存。

1.2.2 紅花大金元特異性引物篩選

SCAR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）：DNA 模板，55 ng·μL-1、0.5 μL；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ，10μL；上下游引物，10 μmol/L 濃度各0.5 μL；ddH2O 加至20 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性50 s，引物的退火溫度根據(jù)表2 結(jié)果退火20 s，72 ℃延伸25 s，從變性到延伸反應(yīng)30 個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸6 min；PCR 產(chǎn)物在4 ℃條件下保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在80 V穩(wěn)定電壓下，以1×TAE作為電泳緩沖液，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠置于緩沖液中，上樣后電泳40 min，經(jīng)由紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照后，建立凝膠電泳圖進(jìn)行分析。根據(jù)電泳結(jié)果最終選出特異性強(qiáng)且能產(chǎn)生特異性條帶的SCAR引物用于紅花大金元品種鑒定。

1.2.3 引物與探針特異性測(cè)試

利用篩選好的特異性引物與探針H1-T組合，分別以紅花大金元、云煙85、云煙87 和K326 基因組DNA 為模板進(jìn)行引物與探針特異性測(cè)試。熒光定量PCR反應(yīng)體系如表4所示，反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃污染消化2 min；95 ℃預(yù)變性5 min；在 95 ℃變性10 s、49 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s 條件下循環(huán) 40 次，在此過(guò)程收集數(shù)據(jù)。以ddH2O 為空白對(duì)照，根據(jù)引物探針組合的擴(kuò)增曲線形態(tài)（S）、Ct 值確定引物的特異性。

1.2.4 熒光定量PCR擴(kuò)增體系及程序優(yōu)化

根據(jù)引物、探針組合的擴(kuò)增曲線形態(tài)（S）、Ct 值確定最佳引物，設(shè)置4 個(gè)模板DNA 含量梯度（1、2、3和4 μL），以紅花大金元DNA 為模板按照1.2.3 程序進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 方法靈敏度測(cè)試

將紅花大金元基因組DNA 用ddH2O 進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)珼NA 的濃度分別為 55、5.5、0.55、0.055 和0.005 5 ng·μL-1。利用優(yōu)化后的熒光定量PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將紅花大金元基因組 DNA（55 ng·μL-1）與ddH2O 混合稀釋成不同濃度，紅花大金元基因組DNA稀釋后的濃度分別為5.5、11.0、16.5、22.0、27.5、33.0、38.5、44.0、49.5 和 55.0 ng·μL-1。將 2 μL 紅花大金元基因組DNA 加入到20 μL 反應(yīng)體系后，其實(shí)際濃度分別為0.55、1.10、1.65、2.20、2.75、3.30、3.85、4.40、4.95 和5.50 ng·μL-1。利用以上的紅花大金元基因組DNA為模板，通過(guò)優(yōu)化后的熒光定量PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。以紅花大金元基因組DNA 在20 μL 反應(yīng)體系中的實(shí)際濃度為橫坐標(biāo)，Ct值均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 煙葉基因組DNA預(yù)混樣品測(cè)定

將紅花大金元基因組DNA 與云煙85 基因組DNA 按照不同體積比例進(jìn)行混合。實(shí)驗(yàn)中混合樣品比例設(shè)計(jì)如表5 所示，紅花大金元基因組DNA 與云煙85的基因組DNA體積比分別為5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，分別用A、B、C、D、E、F表示，以紅花大金元煙葉DNA為模板，用引物與探針組合對(duì)樣品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)熒光定量PCR擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)紅花大金元進(jìn)行定量分析。

1.2.8 混合煙葉樣品測(cè)定

將紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和K326進(jìn)行混合并編號(hào)。1～3 號(hào)樣品為紅花大金元分別與云煙 85、云煙 87 和 K326 按照質(zhì)量比 5 ∶5 進(jìn)行混合；4～6 號(hào)樣品分別為紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和 K326 按照質(zhì)量比 7 ∶3 進(jìn)行混合；7～9 號(hào)樣品分別為紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和K326 按照質(zhì)量比9∶1進(jìn)行混合。將上述樣品磨成粉末，各取0.1 g 于1.5 mL 離心管中，利用改良的CTAB 法提取上述混合樣品的基因組DNA，將提取后的DNA 用ddH2O稀釋至55 ng·μL-1，并使用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 烤后煙葉基因組DNA提取

由圖 1 可看出，1～4 號(hào)樣品 DNA 條帶都較為清晰單一，無(wú)雜帶，主條帶亮度高且DNA 條帶完整性較好。由表6 可知，提取的基因組DNA OD260/OD280的值在1.8～2.0 之間，純度較高。利用改良的CTAB法提取的煙葉基因組DNA 質(zhì)量及純度達(dá)到后續(xù)PCR 對(duì)DNA 模板的要求。將4 個(gè)煙葉樣品的DNA用ddH2O稀釋至55 ng·μL-1，備用。

表6 煙葉基因組DNA濃度與純度檢測(cè)結(jié)果Tab.6 Concentration and purity of tobacco genomic DNA

圖1 煙草基因組DNA凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoregram of tobacco genomic DNA

2.2 紅花大金元特異性引物篩選

以紅花大金元、云煙85、云煙87與K326基因組DNA 為模板，對(duì)所設(shè)計(jì)的5 對(duì)引物進(jìn)行篩選。PCR反應(yīng)條件為1.2.2 節(jié)的SCAR-PCR 反應(yīng)體系與程序。結(jié)果（圖2）顯示，只有引物H1-R/F 以紅花大金元基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 時(shí)可擴(kuò)增出明亮的條帶，無(wú)其他雜帶產(chǎn)生，表明引物H1-R/F 對(duì)紅花大金元基因組DNA有很強(qiáng)的特異性，可用于紅花大金元品種的定性鑒定。

圖2 引物篩選結(jié)果Fig.2 Screening results by using primers

2.3 引物與探針特異性測(cè)試

熒光定量PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小在80～200 bp 較為適宜，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)篩選出的引物H1-R/F 符合該要求。利用熒光引物H1-R/F 與探針H1-T 組合，以紅花大金元、云煙85、云煙87 和K326 的基因組DNA為模板進(jìn)行特異性測(cè)試。結(jié)果（圖3）顯示，紅花大金元出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，其余樣品雖有擴(kuò)增曲線，但Ct 值均大于32，可判定為陰性。以上結(jié)果表明該引物、探針組合具有良好的特異性，可以用于下一步試驗(yàn)。

圖3 特異性測(cè)試結(jié)果Fig.3 Test results for specificity

2.4 熒光定量PCR擴(kuò)增體系及程序優(yōu)化

利用引物與探針組合H1-R/F/T，設(shè)置4 個(gè)模板DNA含量梯度（1、2、3和4 μL），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定熒光定量PCR 最佳反應(yīng)體系。結(jié)果如表7 所示，Ct值隨著模板DNA 含量的增加而減小。熒光定量PCR Ct值要求在25～30之間，故確定模板DNA的含量為2 μL。

表7 熒光定量PCR體系優(yōu)化Ct值Tab.7 Ct values of optimized fluorescent quantitative PCR system

2.5 方法靈敏度測(cè)試

將紅花大金元基因組DNA 用ddH2O 梯度稀釋?zhuān)脙?yōu)化后的熒光定量PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增以確定該方法的檢測(cè)限。結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)紅花大金元DNA初始濃度大于0.055 ng·μL-1時(shí)，擴(kuò)增曲線的Ct 值≤32；當(dāng)紅花大金元DNA 初始濃度在0.055 ng·μL-1以下時(shí)，擴(kuò)增曲線的Ct 值＞32，模板DNA含量為2μL，可得本方法的檢測(cè)限為0.11 ng。

圖4 靈敏度測(cè)試結(jié)果Fig.4 Test results for sensitivity

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.2.6節(jié)所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從結(jié)果可以看出（圖5、表8），Ct值的RSD范圍在0.05%～0.38%之間，重復(fù)性較好；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y =-1.575ln（x）+ 27.156，決定系數(shù)R2為0.997。

表8 紅花大金元熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值Tab.8 Ct value of standard curve of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve

2.7 預(yù)混樣品中紅花大金元含量測(cè)定

將紅花大金元 DNA（55 ng·μL-1）與云煙 85 DNA（55 ng·μL-1）按照表5的方式進(jìn)行混合，以上述DNA 預(yù)混樣品為模板進(jìn)行熒光定量PCR。從結(jié)果（表9）可以看出，Ct值的RSD范圍在0.04%～0.33%之間，重復(fù)性較好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出預(yù)混樣品A～F 中紅花大金元DNA 含量檢測(cè)值分別為51.36%、61.95%、72.17%、81.18%、87.95%和97.29%，檢測(cè)值與理論值相對(duì)誤差分別是2.72%、3.25%、3.10%、1.48%、-2.28%和-2.71%。相對(duì)誤差均在3.5%以下，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對(duì)混樣中紅花大金元含量進(jìn)行定量分析。

表9 預(yù)混樣品中紅花大金元熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果Tab.9 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in premixed samples

2.8 混合煙葉樣品中紅花大金元含量測(cè)定

從表 10 可以看出，1～9 號(hào)混合煙葉樣品 Ct 值重復(fù)性較好。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出煙葉混合樣品中紅花大金元的DNA 濃度，通過(guò)紅花大金元的DNA濃度和混合煙葉樣品DNA濃度之比得出1～9號(hào)樣品中紅花大金元的含量（表10）。紅花大金元的檢測(cè)值均值與理論值的差值在2.5%～3.5%之間，且每個(gè)樣品3次重復(fù)計(jì)算得出紅花大金元檢測(cè)值的變異系數(shù)小于2%，屬于弱變異，結(jié)果波動(dòng)較小。

表10 混合煙葉樣品中紅花大金元熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.10 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in mixed tobacco leaf samples

基于熒光定量PCR的煙葉品種定量檢測(cè)技術(shù)的核心在于引物的特異性。本研究中以紅花大金元品種特異性序列為基礎(chǔ)建立了該品種的定量檢測(cè)方法，當(dāng)鑒定靶標(biāo)品種改變時(shí)，需要根據(jù)靶標(biāo)品種的特異性序列重新設(shè)計(jì)、篩選引物，參照本研究中的流程建立其檢測(cè)方法。本研究中所用混合樣品包含了4個(gè)煙葉品種，當(dāng)品種范圍擴(kuò)大時(shí)，需要以新加入品種為模板對(duì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性。此外，由于熒光探針?lè)`敏度較高，對(duì)DNA 模板質(zhì)量和操作精度要求較高，檢測(cè)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)均需嚴(yán)格、規(guī)范操作以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

通過(guò)特異性引物設(shè)計(jì)、篩選、探針引物組合特異性測(cè)試和熒光定量PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化，利用TaqMan MGB 探針?lè)▽?shí)現(xiàn)了混合煙葉中紅花大金元品種的定量檢測(cè)。以紅花大金元品種特異性SCAR序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了熒光定量引物和探針，從中篩選出了特異性強(qiáng)、靈敏性高、重復(fù)性好的引物和探針組合，在此基礎(chǔ)上繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終建立了紅花大金元在混合煙葉樣品中的定量檢測(cè)方法。該方法的檢測(cè)限為0.11 ng，誤差范圍在2.5%～3.5%之間，精確度高、檢測(cè)周期短、安全性好，可應(yīng)用于特定混合樣品中紅花大金元煙葉的定量檢測(cè)，為煙葉品種的定量檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。