CircRNAs在骨質疏松癥中的研究進展

張素華 徐月新

江蘇省蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 揚州 225001

正常成人骨骼由皮質骨和松質骨組成，其比例在不同部位有所差異，如椎骨以松質骨為主，長骨以皮質骨為主。骨重塑是新骨替代舊骨的過程，大約每十年骨骼會更新一次，主要是在舊骨的基礎上，骨重塑單元招募破骨細胞進行骨吸收，隨后成骨細胞進行骨形成和礦化，最終在新骨吸收腔內形成新骨。骨質疏松癥一般是由于衰老引起骨重塑的速率改變，導致骨量丟失、骨微環(huán)境結構破壞等[1]。據(jù)估計，約30%年齡超過50歲的女性會經(jīng)歷一次骨質疏松導致的骨折，這是由于荷爾蒙水平變化及身體運動減少、破壞了骨重塑所引起的[2]。骨質疏松癥的早期診斷比較困難，因此臨床上迫切希望能夠早日探索出一種靈敏度高、特異性好、方便性佳的新型生物標志物進行骨質疏松癥的早期篩查和診斷。

1 circRNA的概述

早在20世紀70年代，借助電子顯微鏡就已經(jīng)觀察到了真核細胞細胞質中存在部分circRNAs，但當時被認為是異常剪接產(chǎn)生的“垃圾”[3]。后來研究[4]發(fā)現(xiàn)circRNAs是由前體mRNA通過反向剪接產(chǎn)生的單鏈共價閉合RNA分子。近年來隨著高通量測序、多組學研究及生物信息學分析等飛速發(fā)展，已經(jīng)鑒定出數(shù)千萬種circRNAs，它們一般由一個或兩個外顯子反向剪接產(chǎn)生，這種環(huán)狀結構不易被外切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定。而且在外泌體、唾液及血清中都發(fā)現(xiàn)有circRNAs的表達，提示circRNAs可能是潛在的生物標志物及治療靶點[5]。

1.1 circRNA的特征

目前高通量測序發(fā)現(xiàn)數(shù)萬種circRNAs在哺乳動物組織中廣泛表達，其中人體組織大約有3萬個不同的circRNAs[6]。人體內circRNAs長度通常為幾百個核苷酸左右，它們是一類由非標準剪接(即反向剪接)產(chǎn)生的非編碼RNA，在這過程中下游的剪接供體位點與上游的剪接受體位點共價連接形成閉合環(huán)狀結構。circRNAs這類轉錄本大多由2～3個外顯子組成，也有只含內含子的circRNAs和同時包含內含子及外顯子的circRNAs[7]。除了內含子circRNAs外，大部分circRNAs通常定位在細胞質。一般circRNAs的表達水平只有其相對應的線性轉錄水平的5%～10%，這是因為其反向剪接的效率較低，但是由于它們缺乏自由末端，不易被核酸外切酶(RNase R)降解，使部分circRNAs表達可以富集到較高水平[8]。circRNAs表達是一種古老的基因組特性，在數(shù)億年進化中保持不變，它們可以在非常簡單的生物體基因組表達，如釀酒酵母、阿米巴變形蟲等，也可以在植物中表達，這些都是源于它們具有廣泛的選擇性剪接程序[9]。

1.2 circRNA的形成機制

circRNA依賴剪接體去除內含子并將外顯子連接在一起，形成成熟的mRNA并催化線性mRNA前體剪接。circRNA通常需要一個外顯子供體的剪接位點，但不與下游另一個外顯子的受體剪接位點連接，而是與上游受體的剪接位點連接，這一過程稱為反向剪接。剪接體選擇哪些外顯子進行環(huán)化的機制尚不完全清楚，但這個過程顯然需要將反向剪接外顯子側面的兩個內含子靠近。目前已知有3種機制可以實現(xiàn)這一步：①內含子配對驅動環(huán)化：主要成分是順式作用元件(短非編碼調控序列)，位于側翼內含子內，使得側翼內含子反向互補序列配對形成環(huán)狀結構[10];②RNA結合蛋白(RBP)驅動環(huán)化:反式作用因子(結合順式作用元件)識別并位于環(huán)狀外顯子側面的內含子上，通過蛋白-蛋白相互作用或RBPs二聚化作用，使得剪接位點靠近，剪接小體參與反向剪接[11];③套索驅動環(huán)化：這一過程源于線性剪接，轉錄時RNA部分折疊與非臨近外顯子靠近，導致外顯子跳躍，形成套索中間體進一步剪接產(chǎn)生[12]。

1.3 circRNAs 的生物學功能

2017年Science的一篇報道[13]為circRNAs 的生物學功能研究提供了重要的證據(jù)。研究[13]發(fā)現(xiàn)小鼠缺失circRNA(Cdr1as)會導致miRNA(miR-7)表達異常并影響腦內突觸傳遞。雖然circRNAs表達量較少，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)它們在生理及病理條件下發(fā)揮著潛在的作用。它們通過不同的機制參與了基因表達調控：①circRNAs充當miRNA海綿：一些circRNAs可以與miRNA結合，以阻止miRNA與mRNA靶標的相互作用(即它們充當miRNA海綿)。比如Cdr1as廣泛存在于哺乳動物大腦中并高度保守，且含有大量miR-7結合位點。在小鼠中敲除Cdr1as，會導致大腦中miR-7靶基因Fos表達顯著升高[13]；②circRNAs可以結合RNA結合蛋白(RBPs)并介導RBPs的活性或定位。比如HuR可能與HeLa細胞中一半的circRNAs結合，HuR與circPABPN1的結合阻止了其與線性PABPN1 mRNA的結合，從而導致PABPN1轉錄翻譯下降，細胞增殖減少[14]；③作為轉錄調節(jié)基因：盡管大部分circRNAs定位在細胞質中，但發(fā)現(xiàn)細胞核中的一些circRNAs參與了轉錄調控。比如EIciRNAs可以與U1snRNPs (U1 small nuclear ribonucleoproteins)相互作用形成復合物，并在其親本基因啟動子上與Pol II相互作用，增強基因表達[15]；④競爭其線性mRNA的剪接：circRNAs的生成會影響其宿主基因的表達，在果蠅中進行的研究發(fā)現(xiàn)，去除剪接體成分會導致circRNAs水平升高，而其線性mRNA水平降低。這是由于線性剪接和反向剪接通常使用相同的標準剪接受體和供體，所以circRNAs的產(chǎn)生會影響線性mRNA的生成[16]；⑤作為蛋白質合成的模板：它們主要位于細胞質且大多來源外顯子，除了其非編碼的功能，研究[17]發(fā)現(xiàn)circRNAs可能與核糖體翻譯相關，并以依賴內部核糖體進入位點(IRES)進行翻譯；⑥circRNAs是很有前途的生物標志物：環(huán)狀結構使其在細胞內及細胞外(血漿、唾液等)中穩(wěn)定存在[18]。提示疾病相關的circRNAs是具有潛力的生物標志物。

2 circRNAs與骨質疏松癥發(fā)生相關

近年來circRNA是研究的熱點，但是其在骨質疏松癥中研究相對較少。circRNA通過直接參與骨相關的信號通路，形成circRNA-miRNA-mRNA軸，參與骨重塑過程。

2.1 circRNA與成骨細胞

成骨細胞是介導骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的形成、分泌及礦化，并進一步直接影響骨骼重塑。一般間充質干細胞可以分化形成成骨細胞，但這一過程需要一系列細胞外信號及轉錄因子的精細調控。Huang等[19]通過重組NELL-1誘導人脂肪干細胞成骨分化，并進行RNA測序發(fā)現(xiàn)了兩個關鍵的circRNAs：circRFWD2和circINO80，敲除這兩個circRNAs會影響其成骨分化進程。作為miRNA海綿作用，這兩個circRNAs與hsa-miR-6817-5p相互作用，并調控其表達。Zheng等[20]誘導牙周韌帶干細胞成骨分化，相較于第0天細胞，第3天細胞中有118個circRNAs差異表達，第7天細胞中有128個circRNAs差異表達，第14天細胞中有139個circRNAs差異表達。Peng等[21]在誘導上頜竇膜干細胞成骨分化中，發(fā)現(xiàn)circRNA_33287表達上調，并充當miR-214-3p海綿，發(fā)揮促進成骨分化的作用。Long等[22]篩選了小鼠脂肪基質細胞分化中差異表達的circRNAs，其中40種circRNAs表達上調，并發(fā)現(xiàn)miR-338-3p與mmu_circRNA_013422及mmu_circRNA_22566的表達上調相關聯(lián)。Qian等[23]通過BMP2誘導小鼠前成骨細胞MC3T3-E1并得到1 581種差異表達的circRNAs，而且鑒定出circ19142和circ5846與該進程相關聯(lián)。大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cdr1as可以作為miR-7海綿參與多種生物進程，Li等[24]運用牙周韌帶干細胞成骨分化并發(fā)現(xiàn)Cdr1as表達升高，體外實驗發(fā)現(xiàn)Cdr1as通過抑制miR-7b表達，進一步調控GDF5表達及Smad1/5/8磷酸化等，促進細胞成骨分化。體內實驗證明敲低Cdr1as會導致骨形成減少。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)在人間充質干細胞成骨分化中，存在1 505個circRNAs表達下調，而抑制circIGSF11的表達會相應的增加miR-199b-5p的表達，提示circRNA-miRNA相互作用影響了細胞成骨分化。Li等[26]對雌激素受體敲低的人骨髓間充質干細胞進行RNA測序，篩選出差異表達circRNAs共146種，并通過預測提示雌激素受體可能通過circRNA 2∶27713879∣27755789和circRNA 2∶240822115∣240867796-miR-328-5p-mRNA軸調控成骨分化。Du等[27]篩選出大鼠牙濾泡細胞成骨分化中差異表達的circRNAs共266種，其中circFgfr2通過miR-133/BMP6促進成骨分化。

2.2 circRNA與破骨細胞

破骨細胞是介導骨吸收的重要細胞，其增殖、分化及活性直接影響骨量改變。過度骨吸收會導致骨平衡被打破，進一步引起骨質疏松。Dou等[28]發(fā)現(xiàn)了RAW264.7破骨細胞生成的4個不同階段差異表達的circRNAs共24種。Chen等[29]利用Rankl和CSF1誘導骨髓單核/巨噬細胞破骨生成，其中circRNA_28313表達明顯升高，而在卵巢摘除小鼠中尾靜脈注射Lsh-circRNA_28313會引起小鼠骨吸收減弱，骨量增加。

3 circRNA與骨質疏松癥

由于骨質疏松癥往往沒有明顯的臨床表現(xiàn)，一般發(fā)生骨折后才進一步確診。近些年不少研究通過研究骨質疏松性骨折案例，試圖找尋新的早期診斷及治療靶點。Ouyang等[30]針對骨質疏松性骨折患者中約5%的骨不連患者進行研究，發(fā)現(xiàn)患者骨髓間充質干細胞中存在差異表達的circRNAs，并證明了hsa_circ_0074834通過miR-942-5p調控了ZEB1和VEGF，進而促進骨髓間充質干細胞成骨分化。通過裸鼠異位成骨及股骨單皮質缺損模型發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0074834可以修復骨缺損。對20例絕經(jīng)后骨質疏松癥婦女血清circRNAs進行的分析[31]，發(fā)現(xiàn)387種circRNAs顯著差異表達，其中circRNA_0016624表達下降，發(fā)現(xiàn)它是作為miR-98海綿，進一步調控了BMP2的表達。而另一項針對40例骨質疏松癥病人血清進行的CircRNA芯片的研究[32]發(fā)現(xiàn)，其中circ_0006873和circ_0002060表達明顯上調，并通過皮爾森關聯(lián)分析了這兩種CircRNA與骨質疏松臨床特征的關系，從而確定circ_0002060是骨質疏松癥診斷的分子標志物。一項對于28例絕經(jīng)后骨質疏松癥婦女外周血單核細胞(PBMCs)進行的CircRNA芯片研究[33]，運用熒光定量PCR及關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)hsa_Circ_0001275是潛在的診斷分子標志物。針對3例絕經(jīng)后骨質疏松癥婦女外周血淋巴細胞(PBL)進行RNA測序，發(fā)現(xiàn)260種circRNAs差異表達[34]。見表1。

表1 骨質疏松癥中CircRNA表達譜Table 1 CircRNA expression profiles in osteoporosis

4 討論

circRNAs是分布廣泛、結構穩(wěn)定、功能復雜的RNA分子。雖然circRNA在癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及心臟疾病中取得較大的進展，但在骨質疏松癥、骨關節(jié)炎等骨科疾病中的研究較少。目前大部分研究只是局限于circRNA芯片等表達譜的分析，缺乏circRNA調控成骨細胞、破骨細胞及骨質疏松癥的機制研究。少數(shù)機制研究也是主要關注circRNA作為miRNA海綿調控這一生物進程。但是circRNA的功能多種多樣，例如翻譯的功能、轉錄調節(jié)功能都值得在骨質疏松癥領域進行深入研究。

血液來源的生物標志物因其無創(chuàng)性，在癌癥早期診斷、產(chǎn)前診斷方面都發(fā)揮著重要作用。目前已經(jīng)報道circRNA在骨質疏松癥病人血液中差異表達，當然這里涉及了血清、血漿、外周血單核細胞及外周血淋巴細胞等，多方面闡釋了circRNA做為骨質疏松癥生物標志物的巨大潛力。當然這只是剛開始，雖然有研究已經(jīng)利用異位成骨及骨缺損模型研究circRNA在骨質疏松癥中的作用，但是完善circRNA在動物方面的研究大勢所趨，包括骨質疏松癥動物模型構建、轉基因動物等。從臨床出發(fā)最終還是要回歸臨床，擴大骨質疏松癥樣本進行臨床驗證。

總而言之，這些研究雖然證實了circRNA在骨發(fā)育方面的作用及其作為骨質疏松癥生物標志物的價值，但在臨床常規(guī)開展及個體化治療方面，仍需進一步實驗研究，希望獲得能直接反映骨骼形成及骨結構的變化。未來一方面應進一步深入對于circRNA在骨質疏松癥中的機制研究，另一方面應繼續(xù)探討將其作為臨床篩查及診斷標志物的可能性。