納豆提取物對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松作用的研究

蔡鐵全 李瑩 徐建文 曹璨 劉影*

1.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局食品審評(píng)中心，北京 100070 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150001

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性代謝性骨病，其特征是骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化，使得骨的強(qiáng)度破壞、骨折危險(xiǎn)性增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在55歲以上女性及65歲以上男性中，因骨相關(guān)疾病導(dǎo)致的死亡率和醫(yī)療費(fèi)用在逐年增加[1]。中國(guó)是世界老齡人口最多的國(guó)家，根據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)在這方面也存在著較大的問(wèn)題[2]。由此可見(jiàn)，開(kāi)展骨質(zhì)疏松癥防治研究已經(jīng)到了刻不容緩的地步。

納豆由納豆菌、納豆芽孢桿菌發(fā)酵黃豆制成，它的多種功能因子綜合作用于機(jī)體，使其具有多種預(yù)防疾病和保健的功效。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果表明，納豆對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥具有一定的作用[3-5]。為了進(jìn)一步對(duì)納豆預(yù)防骨質(zhì)疏松作用作具體闡明，本實(shí)驗(yàn)預(yù)通過(guò)納豆提取物對(duì)大鼠的實(shí)驗(yàn)研究，探討納豆提取物預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣品及劑量：納豆提取物。人體推薦劑量為3 g/(人·d)，如成人體重以60 kg計(jì)，則每日推薦劑量為0.05 g/(kg·bw)。實(shí)驗(yàn)設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組，劑量分別為0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)，鈣含量分別為0.037 5、0.075、0.225 g/(kg·bw)。相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10、30倍，同時(shí)設(shè)置低鈣對(duì)照組(鈣含量為150 mg/100 g飼料)(灌胃等容積去離子水)和碳酸鈣對(duì)照組[劑量為0.56 g/(kg·bw)]，碳酸鈣中鈣含量占40%，因此鈣含量為0.224 g/(kg·bw)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：Wistar品系雄性大鼠50只(SPF級(jí)，60～75 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，參照原衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(京)2012-0001。所有大鼠均在本院清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(屏障環(huán)境)飼養(yǎng)[許可證號(hào)：SYXK(黑) 2011007]，環(huán)境條件保持為12 h晝夜循環(huán)，恒溫(21 ℃～23 ℃)，濕度為55%～58%，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間均給予低鈣飼料[北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0012]。低鈣飼料配方(g/100 g)：酪蛋白10.0，黃豆粉15.0，小麥粉54.0，花生油4.0，纖維素2.0，AIN-76混合鹽2.6，AIN-76混合維生素1.0，氯化膽堿0.2，DL-蛋氨酸0.2，淀粉11.0。加入CaCO3使飼料鈣含量達(dá)到150 mg/100 g，實(shí)測(cè)鈣含量為141.5 mg/100 g。保證有充足飲水，飲用去離子水，連續(xù)3個(gè)月。

50只大鼠在實(shí)驗(yàn)室條件下檢疫1周后，隨機(jī)分成5組，分別為受試物低、中、高3個(gè)劑量組、低鈣對(duì)照組、碳酸鈣對(duì)照組，每組10只，將各組動(dòng)物均按10 mL/(kg·bw)灌胃容積進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃3個(gè)月后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.1.3儀器及試劑：HOLOGIC Discovery雙能X線骨密度儀(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)、原子吸收分光光度計(jì)(AA 7002，北京東西分析儀器有限公司)、動(dòng)物天平、電子天平、加樣器、試管、離心管、動(dòng)物解剖器材、游標(biāo)卡尺、代謝鼠籠、105 ℃烘箱。優(yōu)級(jí)純碳酸鈣、硝酸、高氯酸、氧化鑭、鈣單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1體重測(cè)定：每周測(cè)定體重1次，測(cè)定前禁食12 h。

1.2.2股骨重量測(cè)定：動(dòng)物干預(yù)結(jié)束后處死，采集右側(cè)股骨，測(cè)量股骨長(zhǎng)度；于105 ℃烘箱中烘烤8 h至重量不再變化，冷卻至室溫后，稱(chēng)量骨干重。

1.2.3股骨骨密度測(cè)定：骨密度儀校準(zhǔn)后測(cè)量股骨中點(diǎn)[測(cè)量股骨全長(zhǎng)，從而確定其中點(diǎn)(截面)]及股骨遠(yuǎn)心端[股骨遠(yuǎn)心端關(guān)節(jié)凹槽最下緣處(截面)]的骨密度。

1.2.4骨鈣含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)量烤至恒重的股骨整體，放入經(jīng)鹽酸處理干燥清潔的150 mL三角瓶中，加入硝酸+高氯酸(4∶1)混合酸15～20 mL，在電熱板上加熱消化至冒白煙并透明無(wú)色。加數(shù)毫升去離子水，煮沸以趕出剩余的酸。重復(fù)2次，定容后，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

1.2.5鈣吸收實(shí)驗(yàn)：給予該樣品3周后，將大鼠置不銹鋼代謝籠中進(jìn)行3 d鈣代謝實(shí)驗(yàn)，記錄3 d進(jìn)食量，收集72 h糞便，測(cè)定飼料樣品及糞便中的鈣含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取飼料(均勻混合后過(guò)20目篩)或糞便(均勻混合后80 ℃烘箱中烘干，冷卻后磨細(xì))0.300～1.000 g，經(jīng)硝酸和高氯酸混合酸消化后，用原子吸收法測(cè)定飼料和糞便中鈣含量，計(jì)算鈣的吸收率。鈣的表觀吸收率(%)=(攝入鈣-糞鈣)/攝入鈣×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間均數(shù)比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 納豆提取物對(duì)大鼠體重、鈣吸收率的影響

以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經(jīng)口給予大鼠納豆提取物90 d后，高劑量組、碳酸鈣組大鼠的體重顯著大于低鈣對(duì)照組，高劑量組的大鼠體重與碳酸鈣對(duì)照組相比，顯著大于碳酸鈣對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1～3。

表1 各組大鼠初始體重比較Table 1 Comparison of baseline body weight of the rats

表2 納豆提取物對(duì)大鼠體重的影響Table 2 Effect of natto extract on body weight of the rats

表3 納豆提取物對(duì)大鼠鈣表觀吸收率的影響Table 3 Effect of natto extract on apparent absorption of calcium in rats

2.2 納豆提取物對(duì)大鼠股骨質(zhì)量和長(zhǎng)度的影響

以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經(jīng)口給予大鼠納豆提取物90 d后，各劑量組、碳酸鈣組大鼠的股骨干重均顯著大于低鈣對(duì)照組，高劑量組大鼠的股骨干重和骨長(zhǎng)與碳酸鈣對(duì)照組相比，均不低于碳酸鈣對(duì)照組。見(jiàn)表4。

表4 納豆提取物對(duì)大鼠股骨質(zhì)量和長(zhǎng)度的影響Table 4 Effects of natto extract on femoral mass and length in rats

2.3 納豆提取物對(duì)大鼠股骨骨密度和骨鈣含量的影響

以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經(jīng)口給予大鼠納豆提取物90 d后，高劑量組大鼠的股骨骨密度和骨鈣含量均顯著大于低鈣對(duì)照組，且不低于碳酸鈣對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5、6。

表5 納豆提取物對(duì)大鼠股骨骨密度的影響Table 5 Effect of natto extract on bone mineral density of the rat femur

表6 納豆提取物對(duì)大鼠股骨骨鈣含量的影響Table 6 Effect of natto extract on bone calcium content of the rat femur

3 討論

納豆經(jīng)豆類(lèi)發(fā)酵制成，含有蛋白酶、多種維生素、Y-多聚谷氨酸、Y-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也含有納豆激酶(NK)、超氧化物歧化酶、異黃酮、皂甙素、VK2[6]等生物活性物質(zhì)。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，納豆中還有較高含量的支鏈脂肪酸[7]。納豆不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是對(duì)于心血管疾病[8-9]和骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用以及抗菌[10-11]、抗氧化[12-13]作用在許多報(bào)道中被提及。早在1999年Yamaguchi等[14]就曾發(fā)現(xiàn)，納豆中的維生素K2對(duì)大鼠由于卵巢切除術(shù)(OVX)引起的骨質(zhì)流失具有預(yù)防作用。Ono等[15]的研究也證明，納豆提取物中的皂苷和異黃酮對(duì)OVX大鼠同樣具有預(yù)防骨量流失作用。Ikeda[16]等進(jìn)行了基于人群的隊(duì)列研究，結(jié)果顯示納豆的攝取與絕經(jīng)后女性的骨質(zhì)流失相關(guān)。同時(shí)，Kojima[17]等的最新研究發(fā)現(xiàn)，習(xí)慣性攝取納豆可能與日本絕經(jīng)后女性的骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)，提示納豆提取物在預(yù)防骨質(zhì)疏松中可能起到作用。

骨是一個(gè)“活”的器官，骨重建是一個(gè)終身的過(guò)程，舊骨被破骨細(xì)胞吸收，新骨由成骨細(xì)胞形成，骨量的維持取決于成骨細(xì)胞新骨形成與破骨細(xì)胞舊骨吸收之間的平衡活動(dòng)[18]。產(chǎn)生骨質(zhì)疏松的根本原因就是骨重建的失衡，形成的新骨量少于被吸收骨量，導(dǎo)致骨量的丟失[19]，臨床表現(xiàn)為骨密度降低，骨皮質(zhì)變薄等[20]。故而骨密度測(cè)量被認(rèn)為是評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松程度的客觀量化指標(biāo)，也是診斷骨質(zhì)疏松癥的主要依據(jù)[21]。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經(jīng)口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對(duì)照組相比，高劑量組大鼠的股骨骨密度顯著升高(P<0.05)，且不低于碳酸鈣對(duì)照組(P>0.05)，此結(jié)果與Kawano等[22]利用去卵巢大鼠進(jìn)行研究的結(jié)果一致，說(shuō)明納豆提取物具有一定的預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用。

骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)之一為骨密度降低，而體重則是影響骨密度的因素之一[23]。有研究提出，體重可作為預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要指標(biāo)，因?yàn)槠淇赡苁沁z傳、運(yùn)動(dòng)、飲食等因素的綜合反映[24]。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經(jīng)口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對(duì)照組相比，高劑量組、碳酸鈣組大鼠的體重顯著升高(P<0.05)，高劑量組大鼠體重與碳酸鈣對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示納豆提取物可能通過(guò)保持合適體重，從而達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。

對(duì)于骨骼來(lái)說(shuō)，骨重量及骨長(zhǎng)度直接反映了骨的健康程度。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經(jīng)口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對(duì)照組相比，各劑量組、碳酸鈣組的股骨干重均顯著升高(P<0.05)，高劑量組的大鼠股骨干重和骨長(zhǎng)與碳酸鈣對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wang等[25]也評(píng)估了納豆預(yù)防卵巢切除大鼠骨量流失的能力，結(jié)果與本研究相似，說(shuō)明納豆提取物可以增加骨量，從而起到預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。

鈣是人體中最豐富的無(wú)機(jī)元素，它在人體飲食中的存在有利于骨骼肌的完整性，防止骨質(zhì)疏松癥[26]。人體中絕大多數(shù)的鈣均儲(chǔ)存在骨骼與牙齒中，同時(shí)骨骼的形成也需要鈣的參與[27]。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經(jīng)口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對(duì)照組相比，高劑量組大鼠骨鈣含量顯著升高，且不低于碳酸鈣對(duì)照組(P>0.05)。高劑量組的鈣吸收率顯著大于碳酸鈣對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明納豆提取物可能具有促進(jìn)鈣吸收，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)的作用，進(jìn)一步提示其在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥中可能發(fā)揮的作用。

綜上所述，經(jīng)口給予大鼠不同劑量的納豆提取物90 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠的股骨的骨密度、骨鈣含量顯著高于低鈣對(duì)照組且不低于碳酸鈣對(duì)照組，鈣吸收率不低于碳酸鈣對(duì)照組，因此認(rèn)為納豆提取物可能通過(guò)促進(jìn)鈣吸收增加骨量，提示其在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥中可能發(fā)揮的作用。