mTORC1抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路在激素環(huán)境下對MC3T3-E1成骨分化的影響

招文華 任輝 沈耿楊 尚奇 張志達(dá) 余翔 陳弘林 張鵬 陳桂鋒 余富勇 湯凱 江曉兵 梁德 張玉新 唐軍偉*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405 3.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆 喀什 844000

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是一種使用糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)后導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降和骨折風(fēng)險(xiǎn)增高的骨骼系統(tǒng)疾病，是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1]。研究表明，在接受長療程GC治療的患者中，超過10%診斷為骨折，30%～40%具有放射學(xué)證據(jù)的椎體骨折，給社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。GIOP的骨代謝紊亂主要表現(xiàn)為成骨抑制，自噬的過度激活及Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)下調(diào)在該過程中扮演了重要角色，然而其相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍不甚明確[1,4-5]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex，mTORC1)是細(xì)胞內(nèi)存在的一種復(fù)合物，Raptor是該復(fù)合物中的關(guān)鍵蛋白，既往研究常通過檢測Raptor來反映mTORC1的表達(dá)[6-7]。研究證實(shí)，mTORC1是自噬的上游抑制因子[8]，然而mTORC1是否通過抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)激素環(huán)境下成骨分化的過程仍然未知。為明確相關(guān)機(jī)理，本研究針對前成骨細(xì)胞MC3T3-E1開展相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞：前成骨細(xì)胞MC3T3-E1購于廣州市源井生物有限公司，傳至第三代用于本實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑：MHY1485(Sigma公司，美國)，α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基Gibco公司，美國)，青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco公司，美國)，谷氨酰胺(Gibco公司，美國)，抗壞血酸(Sigma公司，美國)，β甘油磷酸二鈉(Sigma公司，美國)，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國上海)，茜素紅染液(Cyagen Biosciences，中國廣州)，RNA 提取試劑盒(Takara公司，日本)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix(Takara公司，日本)，熒光定量SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara公司，日本)，BCA 蛋白定量檢測試劑盒(天根生物公司，中國北京)。

1.1.3儀器：ZHJH-C1109C型 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)儀(Bio-Rad公司，美國)，DMI300B型熒光倒置顯微鏡(Leica公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)：將MC3T3-E1接種于含10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素雙抗，1%谷氨酰胺的α-MEM完全培養(yǎng)基，并置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%融合度時(shí)傳代。

1.2.2分組、成骨誘導(dǎo)和給藥：將細(xì)胞分為3組：對照組、DEX組、DEX+mTORC1激活劑組。其中DEX為1 μmol/L，mTORC1激活劑為10 μmol/L的MHY1485。對照組加入成骨誘導(dǎo)液，DEX組予成骨誘導(dǎo)液及1 μmol/L DEX進(jìn)行干預(yù)，DEX+mTORC1激活劑組予成骨誘導(dǎo)液、1 μmol/L DEX及10 μmol/L MHY1485進(jìn)行干預(yù)。每3 d更換一次培養(yǎng)基。

1.2.3ALP和ARS染色法檢測成骨能力：在干預(yù)的第7天和第14天分別對各組細(xì)胞進(jìn)行ALP和ARS染色。ALP 染色按照ALP染色試劑盒操作步驟進(jìn)行；ARS染色步驟：藥物干預(yù)結(jié)束后，吸棄完全培養(yǎng)基并用PBS沖洗，每孔加入4%多聚甲醛2 mL固定30 min，隨后吸棄多聚甲醛后用PBS沖洗，每孔加入ARS 染液1 mL，3 min后吸棄ARS染液并用PBS沖洗，在顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.4RT-PCR：提取干預(yù)第7天的細(xì)胞的RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并按照試劑盒步驟進(jìn)行擴(kuò)增。最后測得PCR反應(yīng)的Ct值，以2-ΔΔCt值作為mRNA相對表達(dá)量。Raptor、Beclin-1、Atg5、Wnt3、β-catenin、Runx2、GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表 1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.5Western blot：通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)解析每個(gè)樣品的均等蛋白(30 μg)，并電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用5%無脂牛奶封閉，然后與Raptor、Beclin-1、Atg5、Wnt3、β-catenin、Runx2和β-actin在4℃下以1∶1000稀釋過夜，然后在室溫下與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶1000)雜交1 h。將膜用TBST洗滌3次，并使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組MC3T3-E1細(xì)胞的ALP染色比較

與對照組相比，DEX組的ALP染色陽性率明顯降低，顏色較淺；與DEX組相比，DEX+mTORC1激活劑組的ALP染色陽性率顯著升高，顏色深染。見圖1。

圖1 各組MC3T3-E1細(xì)胞的ALP染色比較Fig.1 Comparison of ALP staining of MC3T3-E1 cells between each group

2.2 各組MC3T3-E1細(xì)胞的ARS染色比較

ARS染色結(jié)果顯示，干預(yù)第14天，DEX組的ARS染色陽性率明顯低于Con組；與DEX組比較，DEX+mTORC1激活劑組ARS染色陽性率增加。見圖2。

圖2 各組MC3T3-E1細(xì)胞的ARS染色比較Fig.2 Comparison of ARS staining of MC3T3-E1 cells between each group

2.3 各組MC3T3-E1細(xì)胞的PCR結(jié)果比較

如圖3所示，與對照組相比，DEX組成骨相關(guān)基因Runx2 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，說明DEX抑制MC3T3-E1的成骨分化，且mTORC1組成中的關(guān)鍵基因Raptor的mRNA水平下降(P<0.05)，自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5 mRNA水平上升(P<0.05)，說明DEX下調(diào)mTORC1水平并誘導(dǎo)MC3T3-E1自噬，而Wnt3、β-catenin mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。與DEX組相比，DEX+mTORC1激活劑組Raptor、Wnt3、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，而Beclin-1、Atg5 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，表明應(yīng)用mTORC1激活劑后抑制自噬并上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，從而挽救DEX對MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化的抑制作用。

圖3 各組MC3T3-E1細(xì)胞的PCR結(jié)果比較Fig.3 Comparison of PCR results of MC3T3-E1 cells between each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各組MC3T3-E1細(xì)胞的WB結(jié)果比較

與對照組相比，DEX組成骨相關(guān)基因Runx2蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，mTORC1組成中的關(guān)鍵基因Raptor的蛋白質(zhì)水平下降(P<0.05)，自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5蛋白質(zhì)水平上升(P<0.05)，而Wnt3、β-catenin蛋白質(zhì)表達(dá)下降(P<0.05)。與DEX組相比，DEX+mTORC1激活劑組Raptor、Wnt3、β-catenin、Runx2蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，而 Beclin-1、Atg5蛋白質(zhì)表達(dá)下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組MC3T3-E1細(xì)胞的WB結(jié)果比較Fig.4 Comparison of WB results of MC3T3-E1 cells between each group注：A為Con組，B為DEX組，C為DEX+MHY1485組

3 討論

骨穩(wěn)態(tài)主要由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成維持，該過程的動態(tài)平衡是保證骨重塑的關(guān)鍵[9]。持續(xù)性骨形成下降是激素誘導(dǎo)GIOP發(fā)生的主要特征之一，目前認(rèn)為激素主要通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ受體2和抑制Wnt/β-catenin信號通路對成骨細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用[1,10]。自噬是細(xì)胞降解損壞的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器并將其循環(huán)利用的過程，對于維持細(xì)胞壽命具有重要生理意義[11-12]。研究表明，mTORC1介導(dǎo)自噬的過度激活是GIOP的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)[4,6]，且有研究證實(shí)mTORC1可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[13-14]，然而相關(guān)機(jī)制在GIOP的發(fā)病中尚未見報(bào)道。本研究針對前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，探索在激素環(huán)境下mTORC1是否通過抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)MC3T3-E1的成骨分化。

ALP活性是成骨細(xì)胞早期的重要表型標(biāo)志物，直接反映了成骨細(xì)胞的活性，而ARS染色主要用于評價(jià)成骨細(xì)胞分化后期礦化程度[15]。本研究中，與對照組相比，DEX組的ALP染色及ARS染色均明顯變淺，表明1 μmol/L的DEX顯著抑制MC3T3-E1的成骨分化及礦化，與既往研究一致[16-17]。而在DEX+mTORC1激活劑組中，應(yīng)用mTORC1激活劑后，ALP染色及ARS染色均較DEX組變深，表明mTORC1激活后可緩解DEX對MC3T3-E1的成骨分化及礦化的抑制作用。

Runx2是成骨細(xì)胞分化早期的主要轉(zhuǎn)錄因子，并且與成骨細(xì)胞分化后期成骨細(xì)胞標(biāo)記基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)[16,18]。本研究中，與對照組相比，DEX組Runx2 mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)下降，表明1 μmol/L的DEX顯著抑制MC3T3-E1的成骨分化，而mTORC1激活后可緩解DEX對MC3T3-E1的成骨分化的抑制作用，表現(xiàn)為Runx2 mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。

生理性自噬對于維持細(xì)胞壽命、促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育具有重要意義，然而自噬的過度激活則導(dǎo)致不利的結(jié)局[19-20]。本研究應(yīng)用1 μmol/L DEX處理MC3T3-E1，出現(xiàn)較對照組降低的Raptor mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，而自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5 mRNA則顯著升高，表明自噬過度激活且自噬的上游抑制因子mTORC1下調(diào)，同時(shí)該過程中伴隨著Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因Wnt3、β-catenin mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)下降。這與既往研究中，DEX抑制mTORC1表達(dá)、促進(jìn)自噬及抑制Wnt/β-catenin信號通路的結(jié)果相一致[7,16]。為了證實(shí)mTORC1抑制自噬后是否能夠調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)激素對MC3T3-E1成骨分化的影響，本研究應(yīng)用mTORC1激活劑干預(yù)被1 μmol/L DEX處理過的MC3T3-E1，發(fā)現(xiàn)mTORC1組成中的關(guān)鍵基因Raptor mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)，自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5 mRNA顯著下調(diào)，而Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵基因Wnt3、β-catenin mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)上升，逆轉(zhuǎn)了DEX對上述調(diào)控因子的作用，重新激活MC3T3-E1的成骨分化，證實(shí)在激素環(huán)境下，mTORC1通過抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化。

本研究再次證實(shí)激素抑制前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化，該過程中伴隨著mTORC1下調(diào)、自噬激活及Wnt/β-catenin信號通路抑制，并且應(yīng)用mTORC1激活劑首次證實(shí)了mTORC1抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)理，溝通了自噬與Wnt/β-catenin信號通路在GIOP發(fā)病中的關(guān)鍵作用。然而，本研究局限于細(xì)胞水平，需要進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。