拉曼光譜在皮膚領域的研究進展

郭博遠， 趙鵬翔， 王惠， 王振， 姚婷婷， 劉夢昱， ADZAVON Yao Mawulikplimi，謝飛

北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部基礎醫(yī)學研究室，抗病毒藥物北京市國際科技合作基地，北京100124；

皮膚作為人體最大的器官，是保護人體不受外界物質入侵的屏障，皮膚中含有水分、膠原蛋白、類胡蘿卜素和脂質等物質，各種物質協(xié)同作用共同維持皮膚結構的完整，皮膚的完整性對于維持人體正常的生理功能十分重要。通過分析皮膚中各種組織成分的含量和分布可以評價皮膚的健康狀況。

拉曼光譜作為一種新型的無損原位檢測技術，近年來，已廣泛應用于疾病診斷、物質鑒別等生物領域。同時可以通過判斷物質微觀的官能團震動推斷出物質的組成，是一種實用的光譜測量工具。拉曼光譜能夠實時無損傷地完成對皮膚各種物質的檢測，為皮膚疾病的診斷提供了一種新的思路。日常生活中的各種化學類藥物和化妝品應用越來越頻繁，拉曼光譜可以實時檢測藥物在皮膚的滲透情況，同時還可以評價保濕產品的效果，具有廣闊的應用前景。本文針對拉曼光譜在皮膚領域的研究進展進行了綜述，以期為拉曼光譜的廣泛應用及其對皮膚病學的機理研究和臨床診斷提供參考。

1 拉曼光譜對皮膚組織成分的定量分析

拉曼效應是1928 年拉曼發(fā)現(xiàn)的，指光在不同介質間傳播會發(fā)生3 種不同的結果，在理想狀態(tài)下，光在介質中的傳播可以被認為是沒有波長變化的。光具有波粒二象性，即光子在透過不同介質時沒有與介質分子之間發(fā)生碰撞時，不會產生波長和能量的變化，并稱這一散射為瑞利散射。但非理想狀態(tài)下光子在穿過不同介質時會發(fā)生能量的轉移，造成波長的變化。如果散射光波長大于入射光，稱這一散射為反斯托克斯散射，如果散射光波長小于入射光，稱這種散射為斯托克斯散射。折射后的能量變化如圖1 所示。光透過不同基團后散射光和入射光的波長變化是不同的，類似于分子指紋，拉曼光譜就是基于這一特性[1]。拉曼散射被發(fā)現(xiàn)后主要用于材料學中物質成分的檢測，由于生物信號比較微弱，拉曼光譜在生物學的應用受到了很大程度的限制。近年來，隨著多學科多領域相互交叉的深入，拉曼光譜通過表面增強拉曼光譜技術使信號強度得到了很大的提升，有望運用于生物學領域。

圖1 光散射前后能量圖Fig.1 Energy map before and after light scattering

1.1 皮膚的主要結構和成分

皮膚主要分為表皮層和真皮層，皮膚中的水分含量較高，占全身的20%左右，充足的水分對維持皮膚的正常生理功能具有重要意義。水分的變化會直接影響皮膚的健康程度，如果角質層中的水分含量過低，皮膚就會產生蛻皮、干燥等一系列問題。皮膚中的蛋白質主要以膠原蛋白的形式存在于皮膚的真皮層中，真皮層中膠原蛋白占真皮干重的75%，體積高達30%，為皮膚提供一定程度的彈性和韌性。膠原蛋白是脊椎動物的主要蛋白質，可以協(xié)調骨骼、肌腱、皮膚和其他組織的形式和功能。膠原蛋白在止血、傷口愈合、血管生成和生物礦化中發(fā)揮作用，其功能障礙導致纖維化、動脈粥樣硬化、癌癥轉移和脆性骨病[2]。膠原蛋白是含羥脯氨酸最多的蛋白質，而羥脯氨酸可以被拉曼光譜檢測。脂質作為皮膚的重要組分，主要分布于表皮和皮下脂肪層，在皮膚屏障中具有十分重要的作用，脂質成分和結構發(fā)生改變會引發(fā)一系列的疾病[3]。

1.2 拉曼光譜對皮膚組織中主要成分含量和分布的測定

皮膚中各物質相對含量的穩(wěn)定是十分必要的，拉曼光譜可以檢測皮膚組織血液、脂質、蛋白質含量的分布情況，還可以研究水在皮膚中的存在形式。2012年Fu等[4]運用一種新穎的多路復用方法，使用傅立葉變換同時檢測多種物質，得到了離體小鼠皮膚組織中血液、脂質和蛋白質的三維高分辨率成像結果，并得到了這3 種混合化學成分的相對含量。同時Zhang 等[5]通過化學計量方法從角質層體內共聚焦拉曼光譜中分離出了水、蛋白質和脂質的拉曼成像，拉曼光譜實現(xiàn)了在皮膚脂質生物學和生物醫(yī)學成像中的快速無損以及指紋識別能力的應用。2020年Yang等[6]分析了動物皮膚樣本脂肪、肌腱和肌肉組織的拉曼光譜，確定了皮膚中次甲基和羥基的光譜代表的物質。證明了皮膚中蛋白質比脂質具有更高的水容量和更大的保水能力，對維持皮膚水合有益。同時證明了水分在脂肪中主要以未結合的形式存在，而部分水分在肌肉中以結合的形式存在。

1.3 拉曼光譜對皮膚其他成分含量和分布的測定

類胡蘿卜素是一類植物營養(yǎng)素，可以通過抗氧化作用緩解紫外線對皮膚的損傷[7]，類胡蘿卜素可以作為體內表皮抗氧化狀態(tài)的標志物，對皮膚有抗氧化、抗癌癥、延緩皮膚衰老等作用[8]。因此對于皮膚類胡蘿卜素含量分布的檢測不僅可以評價皮膚的健康情況，還可以分析類胡蘿卜素與具體健康指標之間的關系，如分析不孕癥皮膚類胡蘿卜素和胚胎發(fā)生率、乳腺癌幸存者皮膚類胡蘿卜素和肥胖癥之間的關系等，同時還可以研究皮膚類胡蘿卜素含量的影響因素。Morovati 等[9]研究表明拉曼光譜可作為離體皮膚類胡蘿卜素含量的檢測工具。2021 年 Dancik[10]、Toh[11]和 Jung等[12]通過拉曼光譜研究不同攝食人群的皮膚類胡蘿卜素的狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，食入不飽和脂肪酸和維生素C會影響皮膚類胡蘿卜素的含量。通過共振拉曼光譜法測定不育癥夫婦男性皮膚類胡蘿卜素狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，皮膚類胡蘿卜素狀態(tài)與良好的胚胎發(fā)生率密切相關[13]。Cartmel 等[14]通過共振拉曼光譜法對乳腺癌幸存者進行了皮膚類胡蘿卜素評分評估發(fā)現(xiàn)，皮膚類胡蘿卜素與乳腺癌幸存者的肥胖呈負相關。Horowitz 等[15]使用拉曼光譜測量兒童皮膚類胡蘿卜素含量，結果發(fā)現(xiàn)對學前兒童父母進行營養(yǎng)教育可改善兒童皮膚的類胡蘿卜素含量。Jontony等[16]用拉曼光譜研究了運動員皮膚類胡蘿卜素變化與身體組成的關系，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的變化與體脂百分比之間存在中等程度的負相關。

拉曼光譜可以對皮膚中主要物質成分的相對含量進行檢測，進而可監(jiān)測皮膚健康狀況，且結合相應的醫(yī)學手段可預防一系列的皮膚疾病，在生物學和醫(yī)學領域有廣闊的應用前景。

2 拉曼光譜在常見皮膚疾病鑒別及治療效果評價中的應用

拉曼光譜可以為一些皮炎、皮膚癌黑色素瘤以及常見的皮膚燒傷等病癥的鑒別提供新的思路。皮膚類的疾病在臨床上大多依賴醫(yī)生的主觀判斷，常用的檢測手段會對患者造成傷害，缺乏無創(chuàng)檢測手段。所以對皮膚疾病的快速無創(chuàng)診斷是目前臨床急需的檢測手段。

2.1 皮炎

皮膚炎癥會破壞皮膚對于外界的屏障作用，因此皮膚炎癥的診斷和分類十分重要[17]。拉曼光譜為皮膚炎癥的診斷提供了一種新型的無標簽臨床高分辨率成像診斷方法，可以實現(xiàn)快速早期診斷。2019 年Zhang 等[18]采用多變量曲線分辨率解析皮膚共聚焦拉曼數(shù)據(jù)中高波數(shù)的水、蛋白質和脂質3 種成分，分析出這3 種物質的相對質量，證明了非病變和皮炎病變皮膚部位的拉曼光譜存在統(tǒng)計學差異。通過分析不同病變程度的拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，發(fā)生皮炎的皮膚組織中核酸、脂質和蛋白質的峰值更高[19]。進一步通過手持式共聚焦拉曼光譜儀量化皮膚中天然保濕因子的濃度和皮膚中的生化成分，可以對特異性皮炎的嚴重程度進行區(qū)分[20]。2020年Knig 等[21]使用基于紅外激光的拉曼層析成像得到了皮炎患者、牛皮癬患者和正常皮膚組織的彈性蛋白/膠原蛋白的比率，可以清楚地確定受皮炎和牛皮癬影響的皮膚區(qū)域。拉曼光譜同時可以評價牛皮癬的治療效果，局部使用環(huán)孢菌素的拉曼光譜彈性蛋白/膠原蛋白的比率明顯上升[22]。

2.2 黑色素瘤

皮膚黑色素瘤是最致命的皮膚癌形式，在過去的30 年中，其發(fā)病率一直在上升。盡管在大多數(shù)情況下是可以切除的，但是較厚的黑色素瘤和局部淋巴結受累者復發(fā)風險較高[23]，因此，對于皮膚黑色素瘤快速準確的診斷是十分必要的。傳統(tǒng)方法對于黑色素瘤的排查需要對人體的痣進行大量活檢，其中包含很多的良性痣，而對良性痣的檢測不僅對皮膚造成傷害，且浪費時間和經濟成本，拉曼光譜為黑色素瘤的檢測提供了一種新的思路，利用拉曼光譜技術可以減少不必要的皮膚活檢，這是臨床上將拉曼光譜技術用于黑色素瘤篩查的重要原因[24]。2020 年 Zhang 等[25]利用拉曼光譜實現(xiàn)了人皮膚中黑色素瘤的快速非侵入性體內檢測，為黑色素瘤相關的無損非離體檢測提供了一種新方法。Kristo 等[26]通過拉曼光譜非侵入性活檢快速準確地診斷出皮膚非黑色素瘤細胞癌。2018 年Santos 等[27]分析了新切除的疑似黑色素瘤的各種高波段不同峰位的拉曼光譜，客觀診斷了所有類型的黑色素瘤。

拉曼光譜還可以評價黑色素瘤的治療效果，2020 年Palombo 等[28]運用拉曼光譜成像技術研究光化學清除劑結合光動力療法治療小鼠皮膚黑色素瘤組織的變化，結果表明光學清除劑與光動力療法在深度為725 μm時更加均勻，效果更好。拉曼光譜還可以分析白癜風的發(fā)病機理，白癜風普遍被認為是由表皮中過度的氧化應激導致黑色素細胞的損失造成的，白癜風病變表皮中的過氧化氫含量高于正常皮膚，Zailaie[29]使用便攜式拉曼光譜儀對病變和非病變皮膚進行測量，發(fā)現(xiàn)875 cm-1處代表過氧化氫的峰位絕對強度在病變組織明顯升高，證明氧化應激是白癜風發(fā)病的標志。

2.3 皮膚老化

皮膚長期暴露在陽光下會破壞皮膚的膠原蛋白網(wǎng)絡，導致光老化，形成皺紋。皮膚的正常衰老和光化學衰老同樣可以用拉曼光譜區(qū)分，2020 年Kourbaj 等[30]通過拉曼光譜檢測不同的人群發(fā)現(xiàn)，真皮中的水分含量可用于評價人體光老化程度。

拉曼光譜還可以對皮膚的燒傷程度進行分類，燒傷嚴重程度的判定對于后續(xù)的治療至關重要，使用拉曼光譜和光學相干斷層掃描可以對不同程度的燒傷進行分類，總體光譜顯示隨著燒傷程度的增加,蛋白質和氨基酸相關的條帶已顯示出結構變化，準確率高達85%[31-32]。

由于皮膚長期與外界環(huán)境接觸，容易受到病毒和細菌等有害物質的感染，皮炎和黑色素瘤等一系列皮膚疾病是最常見的，拉曼光譜對于這些病癥的診斷準確率較高，大大縮短了皮膚疾病的診斷周期，有利于皮膚疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。

3 拉曼光譜在化妝品和藥物對皮膚的滲透效果評價中的應用

角質層對于涂抹類的化妝品或者藥物的滲透有很大的阻礙，滲透促進劑是克服角質層屏障功能所必需的，拉曼光譜可以通過研究涂抹試劑后皮膚脂質結構的變化以及藥物滲透入角質層的含量，評價滲透劑的促滲透效果[33]。

Zeng等[34]用共聚焦拉曼光譜法通過繪制皮膚中增強劑的動態(tài)分布圖觀察滲透增強劑的滲透效果。聚乙二醇作為乳化劑在制藥和化妝品工業(yè)中得到廣泛的應用。2020 年Liu 等[35]研究了具有不同親脂性和親水性鏈長的聚乙二醇對皮膚的影響，拉曼光譜成像結果表明聚乙二醇改變了皮膚的脂質百分比含量變化，增大了含水量。干性皮膚易對女性日常生活造成困擾，因此，對于保濕產品效果的評價十分重要。2020年Stettler等[36]針對保濕產品對干性皮膚的保濕結果進行評價，體內拉曼光譜結果表明隨著膽固醇、游離脂肪酸和神經酰胺的水平以及角質層脂質薄片雙層的平均長度的增加，脂質/蛋白質的比率也有所增加。說明在使用測試產品后，與干性皮膚發(fā)育相關的特征顯著降低。

如圖2 所示，拉曼光譜作為一種新型的檢測技術，多用于非生物材料的成分含量分析，通過表面增強拉曼光譜技術增強樣品的生物信號后，可用于皮膚各主要物質成分相對含量的檢測，快速無損傷，為皮膚健康的監(jiān)測以及皮膚疾病的檢測提供了一種新的手段。

圖2 拉曼光譜的廣泛應用Fig.2 Wide range applications of Raman spectroscopy

4 展望

拉曼光譜是一種新型的無損原位檢測技術，可以檢測皮膚組織中的水分、氨基酸、蛋白質和脂類等物質的相對含量和分布，從而實時監(jiān)測皮膚的健康狀態(tài)，預防皮膚疾病的發(fā)生。在發(fā)生病變的皮膚組織中，皮膚主要成分的含量和分布可能會發(fā)生變化，拉曼光譜可以針對這一特性完成對于部分皮膚類疾病的分級和診斷，靈敏度高，檢測快。拉曼光譜同樣可以對滲透增強劑和保濕產品的效果進行快速評價。隨著科技的發(fā)展，表面增強拉曼光譜技術改善了拉曼光譜靈敏度低的缺點，便攜式拉曼光譜儀使拉曼光譜可以隨時隨地進行檢測。

皮膚特征拉曼譜峰可以分辨蛋白質、脂質等分子，提示因血液和唾液等可以便捷得到的體液，是否可以將拉曼光譜應用于其各項指標的檢測，評價人體的健康狀態(tài)，從而對人體常發(fā)性疾病，如高血糖、高血脂等進行診斷和預防。目前仍在流行的新型冠狀病毒肺炎疫情，是否可以通過進一步增加拉曼光譜的靈敏度，利用血液進行快速準確的輔助診斷值得深入研究，從而為新型冠狀病毒肺炎的診斷提供思路，以利于患者早診斷、早治療。

此外，拉曼光譜的適用性雖然很強，但是拉曼光譜成像的普遍應用性不高，而且國際上缺少統(tǒng)一標準型的拉曼光譜成像數(shù)據(jù)的格式以及處理方式。這需要我們在今后的工作中多方面學習跨學科知識，簡化拉曼光譜成像的操作步驟，并且通過大量的實驗設計統(tǒng)一度、認可度高的數(shù)據(jù)保存格式以及簡便的數(shù)據(jù)處理方式，推動拉曼光譜廣泛的應用。相信隨著科學技術的發(fā)展，拉曼光譜今后將廣泛應用于臨床醫(yī)療診斷和藥物滲透性相關的各個領域。